factor de transcrição STAT6 Sumário
tornou-se uma molécula potencial para a intervenção terapêutica uma vez que regula ampla variedade de processos celulares em uma grande variedade de tipos de células. Embora alguns genes alvo e os parceiros interactuantes de STAT6 tenham sido identificados, o seu mecanismo de acção exacto precisa de ser elucidados. Neste estudo, procurou-se caracterizar ainda mais os moleculares interações, redes e funções de STAT6 perfilando a expressão de mRNA de STAT6 silenciados células de pulmão humano (NCI-H460), utilizando microarrays. Nossa análise revelou 273 genes diferencialmente expressos após STAT6 silenciamento. A análise dos dados de expressão gênica com software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) revelou
A expressão dos genes, morte celular, metabolismo lipídico
como as funções associadas com a rede mais bem cotados.
biossíntese do colesterol foi
entre as vias mais enriquecidos em IPA, assim como em análise Panther. Estes resultados foram validados por PCR em tempo real e colesterol ensaio utilizando mexidos siRNA como um controlo negativo. Achados semelhantes também foram observados com o tipo II humana células epiteliais alveolares pulmonares, A549. No presente estudo, nós, pela primeira vez, mostram a relação inversa de STAT6 com a biossíntese do colesterol em células de cancro de pulmão. Os achados são potencialmente significativa para avançar a compreensão e design de terapêuticas para as condições patológicas em que tanto STAT6 e biossíntese de colesterol estão implicados viz. asma, aterosclerose etc.
Citation: Dubey R, Chhabra R, Saini N (2011) pequeno RNA de interferência contra o Fator de Transcrição STAT6 leva ao aumento da síntese de colesterol em linhas celulares de cancro do pulmão. PLoS ONE 6 (12): e28509. doi: 10.1371 /journal.pone.0028509
editor: Sunil K. Ahuja, South Texas Health Care System Veteranos, Estados Unidos da América
Recebido: 09 de junho de 2011; Aceito: 09 de novembro de 2011; Publicação: 05 de dezembro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Dubey et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores reconhecer o Departamento de Biotecnologia (DBT) para o financiamento do projeto intitulado “Estudo do fator de transcrição STAT6 na regulação de apoptose utilizando RNAi Tecnologia ‘(GAP0047). RD foi apoiado financeiramente pela DBT GAP0047 projeto. RC foi apoiada com CSIR-Senior Research Fellowship (Conselho de Investigação Científica e Industrial). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
STAT6 é um dos sete membros da família de factores de transcrição que participam na regulação da expressão do gene quando as células encontrar vários polipeptídeos extracelulares, como citoquinas, hormonas e factores de crescimento e regulam uma grande variedade de processos celulares, incluindo a proliferação , a diferenciação e a apoptose [1], [2], [3], [4]. Em geral, existem proteínas STAT não fosforilados como formas latentes no citoplasma. A exposição de citocinas conduz a STAT fosforilação por quinases Janus e uma vez fosforilada a dimerização de proteínas STAT individuais ocorrem através dos seus domínios SH2 seguido pela migração de dímero STAT funcional para o núcleo onde se pode ligar ao ADN e directamente activar a transcrição de genes que respondem citoquina [5] , [6]. Tal como os outros membros da família STAT, STAT6 desempenha um duplo papel de transdutor de sinal e activador de transcrição, quer por expressão do gene que regula directamente ou através da interacção com uma vasta variedade de outros factores de transcrição [7].
IL -4 e IL-13 induzida sinalização STAT6 tem mostrado desempenhar um papel importante na diferenciação de células Th2, células B induzida por expressão de IgG e de IgE e a exposição de superfície celular de MHC de classe II e CD23 [8], [9] [10], [11]. Embora STAT6 é conhecida principalmente para ser associada com a inflamação alérgica e asma, STAT6 desregulação também tem sido implicada em várias outras doenças. STAT6 desempenha um papel chave na hepatite células T através de aumentar a expressão de eotaxinas em hepatócitos e células endoteliais, e induz a expressão de IL-5, a infiltração de eosinófilos e neutrófilos no fígado e levando a hepatite [12]. Existem também evidências de que a activação induzida por IL-4 de STAT6 está associado com a expressão hepática reduzida de TNFa, bem como a atenuação de recrutamento de neutrófilos no fígado e pode proteger contra a isquemia hepática /lesão de reperfusão [13]. STAT6 também foi demonstrado estar envolvida na mechanosensation ciliar em células epiteliais de rim [14]. Recentemente, os polimorfismos do gene IL-4 e STAT6 também foram encontrados associados com o desenvolvimento de lúpus eritematoso sistémico em pacientes chineses [15]. Shum
et ai, em 2006, desde que uma ligação entre a inflamação alérgica e metabolismo de ácidos gordos em que eles mostraram que um gene de IL-4 /aP2 STAT6 regulada, que desempenha um papel importante no metabolismo dos lípidos, é necessário em Th2 mediadas inflamação alérgica das vias respiratórias [16] e recentemente foi encontrado STAT6 para desempenhar um papel na regulação da homeostase de lípidos no fígado como aumento da deposição de lípido foi observada em ratinhos knockout STAT6 [17]. Além dos resultados acima, Zhang
et al
em 2006 relatou que STAT6 silenciamento inibe a proliferação e induz a apoptose no câncer de cólon HT-29 células [4]. Em outro estudo, Das
et al
em 2007 descobriu que STAT6 é um factor de sobrevivência constitutivamente expresso no cancro da próstata humana [18]. Este efeito da STAT6 foi reforçada por um estudo de Cui
et al
em 2007, onde eles têm mostrado que STAT6 não fosforilada transcricionalmente-se regula COX-2 expressão e protege contra a apoptose em NSCLC (cancro do pulmão de células não pequenas ) células [19].
Embora, alguns genes-alvo e alguns parceiros que interagem de STAT6 foram conhecidos até à data, os mecanismos precisos da sinalização mediada STAT6 é em grande parte desconhecido. Em vista disso, procurou-se estudar o efeito de silenciamento STAT6 no genoma de largura padrões de expressão gênica em células NCI-H460 (epitelial câncer de pulmão). Os resultados obtidos após siRNA silenciamento mediado de STAT6 em células NCI-H460 também foram validados em células A549.
Materiais e Métodos
cultura de células e carcinoma de Transfection siRNA
Lung ( ), as células NCI-H460 e A549 foram obtidas a partir de National Center for Cell Science, Pune, índia e mantidos em meio RPMI-1640 /DMEM, contendo 10% de soro fetal de vitelo e antibióticos (100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2 no ar.
para a transfecção em placas de 12 poços, 1,2 x 10
5 células foram semeadas por poço e deixou-se aderir durante a noite. As seguintes células dia foram transfectadas com 60 nM de ARNsi validado (Ambion, EUA) utilizando 4 uL de lipofectamina 2000 (Invitrogen, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Onde indicado, as células foram estimuladas com 50 ng /ml de recombinante humano IL-4 (BD Pharmingen, EUA) durante 4 h. As células foram colhidas após 24 h /48 h /72 h após a transfecção e utilizados para as experiências. O não-transfectadas e transfectadas de ARNip mexidos células foram colhidas após 48 h para todas as experiências salvo indicação em contrário.
Extração de RNA e PCR em Tempo Real
O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen, CA, EUA) e 2 ug de ARN foi transcrito de forma inversa utilizando RevertAid ™ H Minus kit da transcriptase reversa (Fermentas, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. PCR em tempo real foi feito usando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os resultados foram normalizados com rRNA 18S. Os dados foram analisados utilizando o método de Pfaffl [20]. As sequências dos iniciadores utilizados para RT-PCR são indicados na Tabela S1.
Western Blotting
As células foram tripsinizadas e os sedimentos celulares foram lisadas com tampão RIPA modificado {Tris-HCl a 50, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NP40 a 1%, 0,25% de desoxicolato de Na, 1 ug /mL de aprotinina, 1 ug /mL de leupeptina, 1 ug /mL de pepstatina, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), orthovandate de sódio 1 mM e 1 mM fluoreto de sódio} e mantido em gelo durante 30 min. O lisado foi centrifugado a 12000 rpm durante 30 min, o sobrenadante recolhido e a estimativa da proteína foi realizada utilizando o método BCA. Quantidades iguais de proteína (50 ug) foram separados em sulfato de dodecilo de sódio a 12% – electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidos para uma membrana de PVDF. A membrana foi bloqueada com 3% de leite desnatado em tampão salino Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) com 0,1% de Tween-20 durante 1 h e, em seguida, incubadas com anticorpo primário em leite desnatado a 1% durante 2 h seguida pela de incubação com o anticorpo secundário adequado (ALP anti-ratinho ligada ou ALP /anti-coelho ligado) durante 1 h. As manchas foram desenvolvidas utilizando NBT- BCIP como substrato. O carregamento igual de proteína foi confirmada utilizando anticorpo GAPDH. A medição da intensidade de sinal em membranas de PVDF após transferência de Western foi efectuada utilizando AlphaImager 3400 (Alpha InnoTech Corporation, San Leandro, Califórnia). Os valores IDV são calculadas como os valores de densidade dos valores de densidade de banda /GAPDH de proteínas específicas. A mudança vezes em relação a células não transfectadas foi então calculado com base nos valores IDV. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes; resultados representativos são apresentados.
Illumina Microarray
Genome grande efeito do silenciamento STAT6 foi estudada usando Illumina microarray. Duas réplicas biológicas de células NCI-H460 não transfectadas e células NCI-H460 transfectadas com 60 nM de ARNsi STAT6 (durante 48 h) foram usados na experiência matriz. O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen, CA, EUA), purificado e concentrado utilizando RNeasy kit MinElute Cleanup (Qiagen, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Todas as amostras de ARN foram testadas quanto à integridade por electroforese em gel. O Kit de Amplificação Ilumina TotalPrep ARN (Ambion, TX, EUA) foi utilizado para gerar ARN biotinilado, amplificado. Em resumo, 500 ng de ARN total foi transcrito de forma inversa com um iniciador oligo (dT) utilizando enzima ArrayScript e amplificados durante a noite com polimerase de ARN de T7 e marcado com biotina de acordo com o protocolo do fabricante. Este rotulados RNA amplificado (ARNA) foi hibridizada para Illumina BeadChips expressão Genome-Wide (Humanos Ref-6 v.3.0, Illumina, CA, EUA), representando ~43,000 transcritos humanos a 58 ° C durante a noite. As matrizes foram incubadas com estreptavidina Cy3 e lavada de acordo com o protocolo do fabricante. O chip foi digitalizado com o scanner Illumina (iScan) ea análise dos dados microarray foi feito usando software Illumina Beadstudio 2.0. Os dados eram média normalizada e os genes que cruzaram o limite do valor p de detecção ≤ 0,05 entre todas as amostras e contagem diferencial valor de p ≤ 0,05 entre as amostras de teste foram considerados genes expressos diferencialmente. O diagrama de fluxo de trabalho desta experiência é apresentado na Figura S1. Os dados obtidos foram depositados em Gene Expression Omnibus NCBI [21] e é acessível através de número de acesso Gene Expression Omnibus (GEO) Série GSE25942 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi ? acc = GSE25942)
análise de caminho Ingenuity (IPA)
os conjuntos de dados que representam genes com perfil de expressão alterada derivado de microarray análises foram importados para a pathway Analysis Tool Ingenuity (IPA Ferramenta;. Ingenuity®Systems , Redwood City, CA, EUA; https://www.ingenuity.com). No IPA, os genes diferencialmente expressos são mapeados para redes genéticos disponíveis no banco de dados Engenho e, em seguida, classificados por pontuação.
A base do programa IPA consiste na Ingenuity Pathway Base de Conhecimento (IPKB), que é derivado de funções conhecidas e interacções de genes publicadas na literatura. Assim, a ferramenta IPA permite a identificação de redes biológicas, funções globais e vias funcionais de um conjunto de dados particular. O programa também fornece o valor de significância dos genes, os outros genes com os quais interage, e como os produtos dos genes de actuar directamente ou indirectamente uns sobre os outros, incluindo aqueles que não estão envolvidos na análise de microarray. As redes criadas são classificados de acordo com o número de genes expressos de forma significativa e que contêm também a lista de doenças que foram mais significativas. Uma rede é uma representação gráfica das relações moleculares entre moléculas. As moléculas são representadas como nós, e a relação biológica entre dois nós é representado como uma aresta (linha). Todas as bordas são apoiados por, pelo menos, 1 de referência da literatura, a partir de um livro, ou a partir de informações canônica armazenado no Ingenuity Pathways Knowledge Base. A intensidade da cor do nó indica o grau de para cima (vermelho) ou a jusante regulação (verde). Nodes são exibidos usando várias formas que representam a classe funcional do produto do gene.
PANTHER análise
A PANTHER (análise de proteínas através de relações evolucionárias) Classification System é um recurso único que classifica os genes por sua funções, usando evidências experimentais científicos publicados e relações evolutivas para predizer a função, mesmo na ausência de evidência experimental direta [22]. Os genes expressos diferencialmente obtidas após o silenciamento STAT6 em células NCI-H460 foram importados para PANTERA (https://www.pantherdb.org/), onde o número de genes em cada via foram comparados com o número de genes a partir do NCBI
Homo sapiens
genoma no que via. O teste binomial foi usado para determinar estatisticamente super-representação de categorias de classificação PANTHER. valores de p 0,05 foram considerados significativos.
ensaio de colesterol
teor de colesterol foi determinada nas células usando kit colesterol quantificação (Biovision, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 10
6 as células foram lisadas e os lípidos foram extraídos por homogeneização com 200 ul de clorofórmio: isopropanol: Triton X-100 (7: 11: 0,1). Estes extractos de lípidos foram secos sob vácuo durante 30 minutos e os resíduos foram dissolvidos em Tampão de Reacção 200 ul de colesterol fornecido com o kit. O colesterol foi estimada por espectrofotometria a λ = 570 nm numa placa de 96 poços de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de colesterol foram normalizados para quantidades de proteína celular total.
Análise Promotor
Para identificar os controles regulamentares comuns entre os genes alterados, genes da via da biossíntese do colesterol (HMGCR- 3-hidroxi 3-metilglutaril-coenzima a-redutase, HMGCS1- 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima a-sintetase 1 e IDI1- isopentenil-difosfato isomerase delta 1) foram tomados para análise promotor. Ensembl [23] foi usado para recuperar 5,0 kb regiões a montante dos locais de iniciação da transcrição destes genes e o factor de transcrição (s) de ligação dentro desta região foi determinada utilizando sobre-representados Transcription factor de ligação Predição sítio ferramenta (OTFBS) [24] que detecta sobre-representados motivos de factores de transcrição conhecidos para um conjunto de genes.
eletroforética mobilidade mudança Assay (EMSA)
O ensaio de desvio de mobilidade eletroforética foi realizada como descrito por Shiraga
et al
. [37]. Os extractos nucleares foram preparados a partir de não-transfectadas, siRNA-transfectadas (60 nM, 48 h /72 h) e mexidos siARN transfectadas células NCI-H460, utilizando Kit de citoplasmática reagente de extracção NE-PER nuclear e (Pierce) de acordo com o protocolo do fabricante.
As sequências de oligonucleótidos utilizados na EMSA foram tiradas de um estudo publicado no início [25]. DNA de cadeia dupla foi gerado por mistura de quantidades equimolares de oligonucleótidos complementares em tampão de têmpera (Ambion, CA, EUA). sequência mutada do factor de transcrição, também foi utilizado para verificar a especificidade da ligação do factor de transcrição. Estes recozido de ADN de cadeia dupla foram etiquetados com [C32-P] -ATP (Brit, Hyderabad, índia), na presença de T4-polynucleotidekinase (New England Biolabs, MA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Os extractos nucleares (18 ug) a partir das células não transfectadas e transfectadas com ARNsi foram incubadas durante 30 min à temperatura ambiente na presença de tampão de reacção contendo 8 mM de Tris-KCl (pH 8,0), EDTA 2 mM, DTT 1 mM, 12% de glicerol , 1 mg de BSA e 1 mg de poli (dl-dC). Ou o tipo selvagem ou mutante marcada oligonucleótido de cadeia dupla (40.000 cpm) foi então adicionada à mistura de reacção e incubado durante 45 min à temperatura ambiente. A cessação de incubação, as amostras foram aplicadas num gel não redutor de poliacrilamida a 6% e submetidas a electroforese em TBE 0,5X. Os geles foram depois secos e submetidos a análise Phosphorimager (FLA 2000, Fujifilm, Japão). As análises densitométricos foram feitas usando o AlphaImager 3400 (Alpha InnoTech Corporation, San Leandro, Califórnia). A mesma caixa de tamanho do retângulo foi desenhada em torno de cada banda e a intensidade de cada foi analisado pelo programa após a subtração da intensidade de fundo.
anexina-V ensaio
A apoptose foi avaliada pela Goiaba nexina kit eo sistema Guava PCA (Guava Technologies, Hayward, CA, EUA). A exposição de fosfatidilserina (PS) sobre a superfície celular (associada com o aparecimento da apoptose) forma a base do ensaio de goiaba nexina. O ensaio de goiaba nexina utiliza duas manchas (anexina V e 7-amino actinomicina D [7-AAD]). Anexina V-PE liga-se a PS na superfície celular de células apoptóticas e de 7-AAD, o corante impermeabilizante celular é um indicador da integridade estrutural da membrana. 7-AAD é excluído a partir de células em apoptose vivos, saudáveis e no início, mas permeia apoptótica fase tardia e células mortas. O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo e anexina-PE fluorescência do fabricante foram analisados com a ajuda do software cytosoft (goiaba Technologies, Hayward, CA, EUA). Um mínimo de 2.000 eventos foram contadas.
ciclo celular ensaio
Para a análise da distribuição do ciclo celular, as células foram fixadas com gelo frio de 70% de etanol e tratou-se com 1 mg /ml de ARNase durante 30 minutos a 37 ° C. As células foram, em seguida, tratada com iodeto de fluorescência do corante de propídio (50 ug /ml, Sigma, USA), que se ligam ao ADN por intercalação entre as bases a 4 ° C durante 30 minutos e analisados utilizando citometria de fluxo (goiaba Technologies, Hayward, Califórnia, EUA ). Um mínimo de 5.000 eventos foram contados.
Resultados
downregulation STAT6 usando STAT6 siRNA específico
A eficácia da STAT6 siRNA específico para regular negativamente a expressão STAT6 em células NCI-H460 foi avaliada por PCR em tempo real para a expressão de ARN e transferência de western para os níveis de proteína. Como mostrado na Fig. 1b, os níveis de ARN diminuiu 1,20 vezes em 24 horas, 2.12 vezes (valor de p = 0,046) durante 48 h e em 1,66 vezes (valor de p = 0,05) às 72 h em siRNA transfectadas células NCI-H460, em comparação com não-transfectadas NCI-H460 células. Não houve alteração significativa nas células não transfectadas e mexidos células transfectadas siARN em diferentes pontos de tempo. No entanto, os níveis de proteína de STAT6 foram reduzidos de um modo dependente do tempo. Como mostrado na Fig. 1a e 1b, havia 1,12 diminuição dobra às 24 h, 1,79 vezes (valor de p = 0,02) diminuir em 48 h e 2,40 vezes (valor de p = 0,028) diminuição às 72 horas pós transfecção de STAT6 siARN específica em células NCI-H460 em comparação com as células NCI-H460 não transfectadas em respectivos pontos de tempo. Nós próxima verificada a expressão da proteína fosforilada STAT6 (pSTAT6), que é a forma de sinalização ativada da STAT6. Em concordância com os níveis de proteína STAT6, a expressão dos níveis de proteína pSTAT6 também foi reduzido de uma maneira dependente do tempo. Houve 1,13 diminuição dobra às 24 h, 1,85 vezes (valor de p = 0,0008) diminuir em 48 h e 2,67 vezes (valor de p = 0,001) diminuição às 72 horas pós transfecção de STAT6 siARN específica em células NCI-H460 quando comparado com NCI não transfectadas -H460 células em respectivos pontos de tempo (Fig. 1A e B). As alterações não significativas foram observadas em células transfectadas com ARNsi scrambled (controlo negativo) em diferentes pontos de tempo.
a) A transferência de Western de STAT6 e forma fosforilada de STAT6) proteína (pSTAT6 em extractos celulares a partir de não-transfectadas, STAT6 específica siRNA e mexidos siARN transfectadas células NCI-H460, em diferentes pontos no tempo, tal como indicado. b) O gráfico representa a variação no nível de ARNm de dobragem STAT6, proteína de STAT6 e nível de proteína pSTAT6 em comparação com as células não transfectadas NCI-H460 em respectivos pontos de tempo. siRNA mexidos em diferentes pontos de tempo foi utilizado como um controlo negativo. GAPDH foi usada como um controlo de carga por análise densitométrica por análise Western Blot. Os níveis de ARNm foram normalizados aos ARNr 18s expressão em análise por PCR em tempo real. Os dados são expressos como a média ± S.D. de 3 experiências independentes. * Indica p valor 0,05 em comparação com as células não transfectadas. ** Indica p valor 0,01 em comparação com as células não transfectadas. c).
Genoma de largura efeitos de silenciamento STAT6 na linha celular NCI-H460 utilizando Illumina microarray
Os perfis de expressão genética em células NCI-H460 não transfectadas e células NCI-H460 transfectadas com STAT6 siRNA foram determinados por microarranjo illumina usando duas réplicas biológicas. Illumina experimento matriz identificou 273 genes diferencialmente expressos (
187 reprimidos e 86 upregulated)
. Os dados em bruto foram analisados utilizando o software Beadstudio 2.0. Os dados matriz foi média normalizada e filtrada através da detecção de um valor p ≤ 0,05 e diferencial de valor de p ≤ 0,05. A lista de genes diferencialmente expressos, juntamente com suas mudanças de dobra é fornecido no S2 Table.
Elucidação de vias e interações entre genes diferencialmente expressos
Para investigar possíveis interações biológicas de genes diferencialmente regulados, conjuntos de dados representando genes com perfil de expressão alterada provêm de análises de microarray foram importados para a ferramenta de Análise Ingenuity Pathway.
a lista de genes diferencialmente expressos analisados pelo IPA revelou 20 redes significativas (Tabela S3). FIG. 2a representa a lista de top 5 redes identificadas pelo IPA. Dessas redes,
A expressão dos genes, morte celular, no metabolismo lipídico
foi a rede mais alta nominal com 28 moléculas de foco ea pontuação de significância de 54 (Fig. 2b). A pontuação é a probabilidade de que um conjunto de genes igual ou maior do que o número de uma rede pode ser conseguida apenas por acaso. Uma pontuação de 3 indica uma chance 1/1000 que os genes foco estiver em uma rede não devido ao acaso. A lista de genes nesta rede com as respectivas alterações vezes na matriz de dados é fornecido na Tabela S4.
Para investigar possíveis interações de genes diferencialmente regulados, conjuntos de dados que representam 273 genes com perfil de expressão alterada obtido a partir da Illumina microarray foram importados para a ferramenta de análise Ingenuity Pathway e os seguintes dados são ilustradas: a) a lista das cinco principais redes com as respectivas pontuações obtidas a partir IPA b) a maioria altamente rede classificado na análise IPA a representação de rede da rede mais cotados ( Expressão de genes, morte celular, Lipid Metabolism). Os genes que são sombreadas foram determinados como sendo significativa a partir da análise estatística. Os genes vermelho sombreadas são regulados positivamente e aqueles que são verde são reprimidos. A intensidade do sombreamento mostra até que ponto cada gene foi para cima ou reprimidos. A linha sólida representa uma interacção directa entre os dois produtos de genes e uma linha a tracejado significa que há uma interacção indirecta. Os genes marcados com asterisco azul foram validados por PCR em tempo real. Genes associados à expressão gênica, morte celular e Lipid Metabolism estão circulados com as cores laranja, azul e roxo, respectivamente. c) Lista via Toxicologia na análise IPA. O eixo x representa as funções de toxicologia de topo tal como calculado pelo IPA baseado em genes expressos diferencialmente são destacadas e o eixo dos y representa a razão entre o número de genes a partir do conjunto de dados que são mapeados para a via e o número de todos os genes conhecidos atribuída ao via. A linha amarela representa o limiar de valor de p 0,05 calculado pelo teste de Fischer.
A análise IPA também grupos de genes diferencialmente expressos em mecanismos biológicos que estão relacionados com grupos de toxicidade. Na lista de toxicologia,
biossíntese do colesterol e p53 Sinalização
veio a ser os dois principais caminhos mais significativos com um valor de p de 0,011 e 0,013, respectivamente (Fig. 2c). Os genes associados com a lista Tox topo são também dadas na Tabela S5.
Simultaneamente, lista de genes expressos diferencialmente obtidas após o silenciamento STAT6 em células NCI-H460 foi alimentada para o recurso de Internet Panther revelam vias enriquecidos. Curiosamente, nesta análise também encontramos a biossíntese do colesterol e sinalização de apoptose entre as vias significativamente enriquecidos. As vias que passaram o limiar do valor de p 0,05 na análise PANTHER estão listadas na Tabela 1.
STAT6 silenciamento aumenta a expressão de genes associados à biossíntese do colesterol /homeostase e aumenta os níveis de colesterol
Desde o mais alto de rede obtidos na análise IPA era
a expressão dos genes, morte celular, metabolismo lipídico Comprar e biossíntese do colesterol saiu enriquecido em ambos IPA e análise PANTHER verificamos as alterações nos níveis de colesterol após o silenciamento STAT6 por siRNA em células NCI-H460. Mexidos siARN foi utilizado como um controlo negativo. FIG. 3a mostra que o STAT6 silenciamentos aumentou os níveis de colesterol de uma forma dependente do tempo, com 1,23 vezes de aumento em 24 horas, de 1,8 vezes (valor de p = 0,005) aumentar a 48 h e 2,3 vezes (valor de p = 0,004) aumentar a 72 h após transfecção de siRNA em células NCI-H460. No entanto, nenhuma alteração foi observada nos níveis de colesterol em células NCI-H460 transfectadas com ARNsi mexidos. Também obtivemos resultados semelhantes em células A549 (Fig. 3A). Não foi de 1,28 vezes de aumento a 24 h, de 1,6 vezes de aumento (valor de p = 0,03) às 48 horas e 2,2 vezes de aumento (valor de p = 0,04) em 72 h após transfecção de siRNA em células A549, indicando, assim, que o aumento dos níveis de colesterol pode ser um efeito geral de silenciamento STAT6 em células pulmonares.
Os níveis totais de colesterol após STAT6 knockdown foi verificada em diferentes pontos de tempo em células A549 e NCI-H460. siRNA mexidos foi usado como controlo negativo. Os dados são expressos como a média ± S.D. de 3 experiências independentes realizadas em triplicado. * Indica p valor 0,05 em comparação com as células não transfectadas. a) a análise de Western blot foi realizada para analisar a mudança na expressão de proteína pSTAT6 mediante tratamento com IL-4 em células NCI-H460. GAPDH foi usada como um controlo de carga para a análise densitométrica. O gráfico representa a variação vezes na expressão da proteína em comparação com as células NCI-H460 não transfectadas. Os dados são expressos como a média ± S.D. de 3 experiências independentes. * Indica p valor 0,05 em comparação com as células não transfectadas. b) PCR em tempo real foi efectuada para determinar as alterações no nível de genes relacionados com a biossíntese do colesterol e homeostase em células NCI-H460 e A549 células 48h após a transfecção de STAT6 siRNA específico expressão. As amostras foram normalizadas para expressão de rRNA 18S. Os dados de tempo real são expressos como a média ± S.D. de 3 experiências independentes realizadas em triplicado. * Indica p valor 0,05 em comparação com as células não transfectadas. c) ensaio de colesterol foi realizado para determinar o efeito do tratamento com IL-4 sobre os níveis de colesterol total no não-transfectadas e transfectadas siARN células NCI-H460 e A549 células. Os dados são expressos como a média ± S.D. de 3 experiências independentes realizadas em triplicado. * Indica p valor 0,05 em comparação com as células não transfectadas. d) A transferência de Western de HMGCS1, HMGCR e IDI1 foi feito em extractos celulares a partir de não-transfectadas e transfectadas com ARNsi células NCI-H460 em diferentes pontos de tempo. GAPDH foi usada como um controlo de carga para a análise densitométrica. O gráfico representa a variação vezes na expressão da proteína em comparação com as células NCI-H460 não transfectadas. Os dados são expressos como a média ± S.D. de 3 experiências independentes. * Indica p valor 0,05 em comparação com as células não transfectadas.
Uma vez que IL-4 é conhecido por fosforilar STAT6, queríamos a olhar para o papel de IL-4 na síntese do colesterol. Em células NCI-H460, foi 1,48 vezes (valor de p = 0,01) alteração no nível de pSTAT6 (forma fosforilada de STAT6) proteína após tratamento com IL-4, 0,48 vezes (valor de p = 0,01) alteração após transfecção de STAT6 siRNA e 0,69 vezes (valor de p = 0,05) mudança quando as células transfectadas com ARNsi STAT6 foram tratados com IL-4 (Fig. 3b). Correspondendo a isso, houve 0,8 vezes (valor p = 0,05) alteração nos níveis de colesterol após o tratamento IL-4, 1,5 vezes (valor p = 0,01) alteração após transfecção de STAT6 siRNA e 1,32 vezes (valor p = 0,03) mudança quando as células transfectadas com ARNsi STAT6 foram tratados com IL-4 (Fig. 3d). Resultados semelhantes foram também observados na linha celular A549 (Fig. 3d).
próxima olhou para os genes expressos diferencialmente associados com a biossíntese do colesterol /homeostase obtido a partir dos dados de microarray. Em concordância com os dados de matriz Illumina, os níveis de transcritos destes genes foram confirmados para ser regulada positivamente por PCR em tempo real. Observou-se 1,27 vezes (valor de p = 0,03) aumento nos níveis de HMGCR, que é a enzima reguladora chave da via de biossíntese do colesterol. Observou-se também 1,94 vezes (valor p = 0,03) aumento HMGCS1, 2,7 vezes de aumento na IDI1, 4,2 vezes (valor p = 0,04) aumento CYP27B1
(citocromo P450, família 27, subfamília B, polipeptídeo 1)
, e 3,0 vezes de aumento na INSIG1
(insulina induzida gene 1)
níveis às 48 h após a transfecção de células NCI-H460 com STAT6 siRNA específico em comparação com as células NCI-H460 não transfectadas (Fig. 3C).
Um aumento semelhante da níveis de transcrição destes genes também foram observados em outra linha de células de cancro do pulmão, A549 (Fig. 3c), onde observou-se 1,6 vezes (valor p = 0,03) aumento nos níveis de HMGCR, 1,4 vezes de aumento na HMGCS1, 1,56 vezes de aumento na IDI1, 2,4 vezes de aumento na CYP27B1, e 1,25 vezes de aumento em níveis INSIG1 às 48 h após a transfecção das células A549 com STAT6 siRNA específico em comparação com as células não transfectadas A549. Isto implica que os efeitos de silenciamento STAT6 são gerais e não se restringe a qualquer linha de células de cancro do pulmão em particular.
Os níveis de proteína de HMGCR, HMGCS1 e IDI1 também foram examinados em não transfectadas e transfectadas com ARNsi células NCI-H460 às 48h e 72h após a transfecção. Não foram de 2,9, 3,5 (valor de p = 0,048) e 4,3 vezes de aumento em níveis HMGCS1, 0,94, 1,8 e 2,4 (valor de p = 0,03) dobrar aumento nos níveis de HMGCR, 1,6, 2,4 e 2,5 (valor de p = 0,024) dobrar aumento 4-B. Como mostrado na Fig. GAPDH foi usada como um controlo de carga.