Abstract

CD133 é uma molécula membrana que tem sido, de forma controversa, relatou como um marcador CSC no cancro colorectal (CRC). Neste estudo, buscou-se esclarecer a expressão e papel dos CD133 no CRC. Inicialmente, o tamanho da população que expressa CD133 (CD133 +) em oito linhas celulares de CRC bem descritas foi medida por citometria de fluxo e verificou-se variar entre 0% e 95%. A linha de células HT29 tem uma CD133 + população de 95% e foi escolhido para a avaliação funcional do gene CD133 após knockdown por interferência de ARN. Um ensaio de curso de tempo mostraram que a inibição CD133 tinha nenhum efeito significativo na proliferação celular ou apoptose. No entanto, CD133 knockdown deu origem a uma maior susceptibilidade à apoptose induzida por estaurosporina (p = 0,01) e redução na motilidade celular (p 0,04). Desde silenciamento de genes pode causar “off-alvo” efeitos, a linha celular SW480 (que tem um CD133 + população de 40%) foi classificada em populações CD133 + e CD133- puros para permitir a comparação funcional de populações isog�nicas separadas apenas por expressão CD133. Em concordância com os experimentos knockdown, um ensaio de curso de tempo não mostraram diferenças de proliferação significativas entre o CD133 + /populações CD133-. Além disso uma maior resistência à apoptose induzida por estaurosporina (p = 0,008), uma maior motilidade celular (p = 0,03) e uma maior eficiência de formação de colónias foi observada na CD133 + população do que a população CD133- em 2D e cultura em 3D (p 0,0001 e p 0,003, respectivamente). Finalmente, a plasticidade de expressão CD133 nas células tumorais foi testada. A análise de PCR quantitativa mostrou que havia repressão transcricional na população de CD133- SW480. cultura prolongada de uma população pura CD133- resultou no reaparecimento de células CD133 +. Concluímos que a expressão de CD133 em CRCs está associada com algumas características atribuíveis a stemness e que não há expressão de CD133 plasticidade. Mais estudos são necessários para delinear a base mecanicista desses recursos

Citation:. Elsaba TMA, Martinez-Pomares L, Robins AR, Crook S, Seth R, Jackson D, et al. (2010) a célula-tronco marcador CD133 Associates com a formação Colony reforçada e motilidade celular em câncer colorretal. PLoS ONE 5 (5): e10714. doi: 10.1371 /journal.pone.0010714

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de fevereiro de 2010; Aceito: 27 de abril de 2010; Publicado em: 19 de maio de 2010

Direitos de autor: © 2010 Elsaba et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Nottingham e CR-UK. Tarek Elsaba é um beneficiário de uma bolsa de doutoramento que foi fornecida pelo governo egípcio. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Nos últimos anos temos visto o surgimento da “hipótese de células-tronco do câncer”, que postula que uma minoria da população de células dentro de um tumor composto por células-tronco cancerosas (CSC) [1], [2]. Esta população é presumivelmente responsável pela geração da maior parte do tumor que consiste em células em diferentes graus de diferenciação. A hierarquia de um tumor é, assim, pensou ser semelhante ao tecido a partir do qual se origina o tumor e os CSCs são consideradas equivalentes neoplásicas de células-tronco no tecido normal. A este respeito, seria de esperar para os CSCs têm um fenótipo de células semelhantes a haste (geralmente referido como “stemness”). Esta é caracterizada por características como capacidade ilimitada replicativo, multipotency e resistência à apoptose [3]. O fenótipo de células estaminais também podem incluir cito-protecção estratégias como a capacidade de extrusão de substâncias perigosas activamente a partir do a-célula característica que pode ser a base de resistência aos agentes quimioterapêuticos [3], [4].

em paralelo com o aparecimento da hipótese de células estaminais do cancro, tem havido um interesse crescente no isolamento e estudo das CSCs. Um número de estudos afirmam ter CSCs isolado a partir de vários tipos de tumores diferentes, tais como tumores do cérebro [5], [6], da mama [7], do cólon [8], [9], o carcinoma hepatocelular [10] e cancro pancreático [11] . Estes estudos têm usado marcadores CSC putativos para separar as células-tronco a partir de diferenciação de células dentro de um tumor. Um método comum de separação é o método de eliminação do corante (ou seja população lateral [12]), embora a identificação de um número de marcadores da superfície das células (tais como CD24, CD44, CD166, e as integrinas) permitiu a utilização de fluorescência de células activadas (FACS) para isolar CSCs [13]. Um marcador consistentemente relatado como um marcador de células estaminais em tumores de diferentes origens é CD133 (também conhecido como Prominin 1).

O gene de CD133 (

PROM1

) mapeia no cromossoma 4p15 e codifica uma 120 kD glicoproteína transmembranar (ENSG00000007062). A proteína CD133 é pentaspan receptor da superfície celular, embora nem o seu ligando, nem os seus mensageiros secundários são conhecidos. Ele foi reconhecido pela primeira vez como um marcador de superfície de células-tronco hematopoiéticas [14], [15]. Mais tarde, foi utilizada para reconhecer células estaminais do cancro em muitos tumores sólidos resultantes em, por exemplo, da mama [13], pâncreas [16] e no fígado [17].

Dois estudos recentes identificaram CD133 como um marcador para células-tronco no câncer colorretal (CRC) [8], [9]. Nestes estudos, as células que expressam CD133 (CD133 +) foram isoladas a partir de CRCs primárias e mostraram ter a capacidade de formar tumores como xenoenxertos em ratinhos nus; Em contraste CD133- células da mesma tumores mostraram ter capacidade muito limitada para formar xenoenxertos e mesmo que foi atribuído à contaminação por células CD133 +. Análise dos xenoenxertos que foram formadas mostrou que o tamanho das células CD133 + população era semelhante ao observado no tumor primário e, além disso, a capacidade de se propagar continuamente os xenoenxertos foi fortemente associado com a expressão CD133. Estudos subsequentes, no entanto, não têm estas observações validado [18] e em um estudo, foi relatado que, na verdade, a população CD133- tem a maior capacidade de formação de colónias [19]. Nosso estudo procurou esclarecer ainda mais a expressão e o papel de CD133 no CRC. Foram utilizadas duas abordagens: a expressão (i) CD133 funcionalmente foi avaliada em HT29 depois de silenciamento de genes e a célula (II) SW480 foram submetidos a triagem em um CD133 + população e uma população CD133- seguida de análise funcional comparativa das duas populações

Materiais e Métodos

A cultura de tecidos, citometria de fluxo e de células activadas por fluorescência

Oito linhas celulares de cancro colorrectal humano (Caco2, DLD1, HT29, Lovo, LS1034, SW480, SW620, SW837) foram mantida como previamente descrito [20]. Identidade de todas as linhas de células foi confirmada através de impressões digitais para mutações em

KRAS, BRAF, PI3KCA, CDC4, TP53

e testes microssatélite instabilidade.

Avaliação do tamanho da expressando (CD133 +) população CD133 em cada linha celular foi realizada por citometria de fluxo utilizando um ficoeritrina (PE), anticorpo marcado com – CD133 /1 (clone AC133 /1, Miltenyi Biotec, Reino Unido). As células foram separadas utilizando uma solução de dissociação de células não enzimática (Sigma) e cerca de 5 × 10

5 as células foram incubadas com o anticorpo (diluído 1:100 na lavagem de FACS (0,5% de albumina de soro de bovino; NaN 2 mM de

3; 5 mM de EDTA)) durante 15 minutos a 4 ° C. Um isotipo e concentração combinado PE marcado foi utilizado anticorpo de controlo (Miltenyi Biotec, UK) e as amostras marcadas com esse anticorpo foram usadas para definir os níveis de propagação. Depois de três lavagens de 5 minutos com lavagem de FACS, as células foram re-suspensas e fixadas em solução contendo FACS lava-se com 1% de formaldeído. Determinação da percentagem de células CD133 + e de triagem de linhas celulares em populações CD133 + /CD133- foram realizadas num fluxo Epics Altra máquina de citometria (Beckman Coulter). Os resultados foram analisados ​​utilizando software de computador WinMDI 2,9.

Para células activadas por fluorescência (FACS) de SW480, as células foram marcadas utilizando o mesmo protocolo mas sem o passo de fixação final. A fim de avaliar a plasticidade de expressão CD133, células separadas foram mantidas em cultura durante 3 semanas antes de serem submetidos a re-avaliação. Para todas as outras experiências, as populações CD133- + /CD133 foram testados imediatamente após separação.

extracção de ARN, a detecção de variantes de splicing de ARNm e quantificação

O ARN total foi extraído a partir de células utilizando o Kit RNeasy Mini (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. As amostras de mucosa do cólon normal foram coletadas com total aprovação do comitê de ética local (Oxford Ética em Pesquisa comitê B, C02.310 referência REC). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes cujas amostras foram testadas para a expressão e da emenda variantes CD133. Extraiu-se RNA e DNA complementar (cDNA) foi sintetizado como anteriormente descrito [20].

Dois principais variantes de processamento têm sido descritos para CD133. A variante maior AC133-1 (NM_006017) foi identificado pela primeira vez e contém todos os exons [15]. A segunda variante, AC133-2, talas para o exão 4, que é de 27 pares de bases de comprimento e codifica uma sequência de 9 aminoácidos do primeiro domínio extracelular de CD133. A expressão de variantes de splicing foram testados por RT-PCR utilizando um iniciador a montante do exão 3 e um iniciador a jusante do exão 5 (disponível a partir de sequências iniciadoras os autores). Isto produziria um produto de 199 pares de bases a partir de AC133-1 e 172 pb a partir AC133-2. A análise de PCR de ponto final foi realizada por visualização de produtos de PCR em géis de agarose. No entanto, dado que a amplificação preferencial do produto menor pode produzir artefactos de dados, o estudo foi repetido utilizando PCR em tempo real (com SYBR Green como o corante repórter) no termociclador Mx3005P (Stratagene, RU). A especificidade da PCR foi validada por sequenciação directa bidireccional. A presença de variantes de processamento foi testado no ADNc obtido a partir das linhas celulares de CRC, as populações CD133 + e CD133- ordenada de SW480, assim como 10 amostras de mucosa de cólon normal

ordenada CD133 +/- populações submetidas a análise de níveis de mRNA por análise de RT-PCR quantitativo utilizando o método de curva padrão. A análise foi realizada em triplicado para cada amostra e

CD133

valores foram normalizados para o gene housekeeping

HPRT

. Cada reacção foi realizada num volume final de 25 ul num termociclador Mx3005P (Stratagene, RU). Os dados para Q-PCR foram analisados ​​utilizando o software MXPRO-QPCR.

Gene knockdown

Gene knockdown foi conseguida por transfecção de células HT29 (mostrado para ter alta expressão CD133) com pequena específicas de CD133 ARN interferente (ARNsi). Aproximadamente 2 x 10

5 as células foram semeadas em meios de comunicação 2 ml de DMEM com FBS a 10% em placas de 6 cavidades (Corning) 24 horas antes da transfecção. As células foram transf ectadas com CD133-específica furtivas ARNic em cadeia dupla (sequência: 5′-GAGUCGGAAACUGGCAGAUAGCAAU-3 ‘, Invitrogen) a uma concentração final de 33 nM, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Estes passam a ser anotada como HT29

CD133-. Os controlos consistiram em células transfectadas com controle mexidos siRNA (sequência: 5′-GAGGGAACAGUCGGAUAGACCUAAU-3 ‘). E passam a ser anotada como HT29

SSC (controle de siRNA mexidos)

Western blot

para transferência de Western, os lisados ​​foram preparados e quantificados como descrito anteriormente [20]. As amostras (30 ug) foram submetidas a Sodium Dodecyl Sulfate Gel de Poliacrilamida A electroforese (SDS-PAGE), utilizando um gel de poliacrilamida a resolução de 10% e transferidas para uma membrana Hybond-P PVDF (Amersham Bioscience). Após o bloqueio com 5% de albumina de soro bovino (BSA) /0.1% TPBS (Tween 20 em solução de PBS) durante 60 minutos, a membrana foi então incubada durante a noite à temperatura ambiente com CD133 (C24B9) Coelho mAb (Cell Signaling) em uma concentração de 1:1000. A membrana foi lavada com 0,1% de TPBS 3 vezes durante 5 minutos cada, em seguida, incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com um anticorpo de rábano ligada a peroxidase secundário (Sigma Aldrich) (1:10000, anti-IgG de coelho) diluído com 5% de BSA /PBS contendo 0,1% de Tween20. Após mais 3 lavagens, a membrana foi visualizado reagentes de quimioluminescência aumentada (Thermo Scientific) Para um controlo de carga, foi utilizado o anticorpo monoclonal anti-β-actina (Sigma Aldrich) em uma diluição de 1:2000 contra a proteína β-actina.

ensaios de proliferação

Um ensaio de curso de tempo para a proliferação foi realizada após silenciamento de genes e após a separação de células. Para HT29, cada poço de uma placa de 24 poços foi semeada com 10

4 células 24 horas após a transfecção com qualquer CD133 específica mexidos ou ARNsi de controlo. Os números de células foram avaliados nos dias 1, 3 e 5. Para SW480 as populações CD133 + e CD133- ordenados foram semeadas a 10

4 células por poço e celulares números avaliadas nos dias 1, 3, 5, 7 e 9. Pelo menos dois experimentos independentes, cada uma em triplicado, foram realizadas. Um ensaio de azul de metileno [21], [22] foi utilizada para quantificar o número de células viáveis ​​aderentes.

Stauropsorine apoptose induzida

Estaurosporina foi usada para avaliar a resistência conferida por CD133 a tensões apoptóticas exógenos . Para HT29, cada poço de uma placa de 96 poços (Costar) foi semeada com qualquer HT29

CD133- ou HT29

SSC células 72 horas após a transfecção. Aproximadamente 5 x 10

4 células foram semeadas por poço e incubou-se com estaurosporina (Sigma) a uma concentração final de 8 uM durante 24 horas. Após este período, as células viáveis ​​apoptóticas e foram medidos. Para SW480, cada poço de uma placa de 96 poços foi semeada com 10

5 células das células separadas e estaurosporina foi adicionada 24 horas mais tarde a uma concentração de 8 uM. Após mais 24 horas, o número de células /corpos apoptóticos viáveis ​​foram avaliadas. O ensaio foi realizado em triplicado e repetidas em pelo menos duas experiências independentes.

2 dimensões (2D) e 3 (3D) tridimensional colónia ensaio de formação

A capacidade de isolado único CD133 + e CD133- células para formar colónias foi testado em ambos os dois cultura bidimensional (2D) e 3 de cultura tridimensional (3D). Para a cultura 2D, a 300 células recentemente classificadas foram semeadas em poços individuais de uma placa de 6 poços e cultivadas durante 14 dias. As células foram então coradas com azul de metileno e as colónias contendo mais do que 20 células foram contadas. As experiências foram realizadas em triplicado e em duas ocasiões.

3D cultura foi realizada para avaliar a capacidade das populações colonogenic ordenadas em condições não aderentes. As células (2500 a partir de cada população CD133 + e CD133 células) foram contadas e ressuspensas como células isoladas em 0,7% de agarose de grau ADN (Sigma Aldrich) .Este foi revestida sobre uma base de agar de grau ADN 1% (Sigma Aldrich) e a parte superior ea camadas de base foram misturados com 2X DMEM. Experimentos foram instalados em triplicado e médio mudadas duas vezes por semana. Após duas semanas, o número de colónias que se desenvolveram no interior de cada poço foi contado e visualizados sob um microscópio, após coloração com violeta de cristal a 0,05% durante 1 hora e campos representativos foram fotografados. Para ambos 3D e em 2D cultura, por cento colónia formando eficiência (CFE) foi calculada como se segue,% CFE = (número de colónias obtidas /Número de células cultivadas) X 100 [23]. Log valores transformados foram então usados ​​para análise estatística.

In vitro

migração ensaio

ensaios de migração de células Transwell foram realizadas utilizando uma câmara de Boyden contendo um filtro de policarbonato com um 8 mm tamanho de poro (Costar). O meio de cultura (600 ul) suplementado com FBS a 20% foi adicionado para a câmara inferior e 2,5 × 10

5 células das populações classificadas foram adicionadas para dentro da câmara superior (em 100 ul de meio de cultura suplementado com 10% de FBS). O número de células que migram através da membrana foi contado manualmente após 24 horas. Os ensaios foram realizados em triplicado e em duas ocasiões separadas. A migração celular foi também medida usando uma célula ferindo ensaio realizado em placas de 6 cavidades (Costar). As células foram cultivadas até à confluência e, em seguida, após jejum de 24 horas em meio isento de soro. Uma ponta de pipeta esterilizada de 200 ul foi utilizado para criar três feridas paralelas separadas e a migração das células através da linha de feridas foi avaliada após 24 horas. As fotografias foram tiradas com uma câmara de dispositivo de carga acoplada (CCD) (Canon, Japão) ligado a um microscópio de contraste de fase invertida a uma potência de X40. A distância entre os bordos foi medida a 6 pontos uniformemente distribuídos utilizando o software ImageJ [33] e, em seguida, analisada utilizando um teste t de duas caudas. As experiências foram repetidas em duas ocasiões distintas.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada usando SPSS 13.0 Software. Todas as avaliações foram feitas usando o teste T não pareado dois Student atados. Para estudos envolvendo células e contagem de colónias, foram analisados ​​os números de células. Para os estudos com uma saída de fluorescência numérica, foram utilizados os valores de fluorescência matérias.

Resultados

populações CD133 expressa em linhas celulares

O tamanho do CD133 + população foi testado em 8 linhas celulares de CRC, por citometria de fluxo e em cada caso foram analisadas aproximadamente 500 000 células. Em duas linhas celulares (DLD1 e SW837), células CD133 + não foram detectáveis. O tamanho de CD133 + população verificou-se ser 95% em duas linhas celulares (Caco2 e HT29). Nas linhas de células restantes, uma população bimodal estava presente com uma CD133 + população variando 32-64% (Figura 1).

Oito linhas de células de CRC foram testados e apresentaram tamanho variando de a população de células CD133 +. (A) fluxo de citometria Amostra imagens são mostradas para Caco2 (painéis da esquerda, 95% de células positivas) e SW837 (painéis da direita). A análise foi realizada utilizando um anticorpo AC133 /(painel superior) e de propagação foi efectuada para cada linha celular, utilizando um isotipo de controlo (painel inferior), PMTLin 1 é photmultiplier tubo linear de 1 o que indica dispersão lateral) (b) mostra que, em duas linhas de células não havia células CD133 +, enquanto identificados em duas linhas de células quase todas as células estavam CD133 +. As linhas de células restantes tinham variando população tamanho das células CD133 +.

variantes de processamento de CD133 em linhas celulares de CRC e normal mucosa

A expressão das duas principais variantes de processamento de CD133 (AC133- 1 e AC133-2) foi testada por RT-PCR em ambas as linhas celulares e amostras de mucosa normal. Apenas um produto foi visto em géis de agarose, que, na sequenciação, foi encontrado para ser o mais curto variante de splicing AC133-2 a partir do qual o exão 4 é spliced ​​out (Figura 2a e 2c). No entanto, os produtos de PCR mais curtos passam por amplificação preferencial e é possível que os produtos com maiores dimensões pode ser dispensada por gel de agarose de electroforese em gel e sequenciação (especialmente se estiver presente em níveis baixos). A análise foi aperfeiçoada efectuando PCR utilizando SYBR Green como um corante repórter. Avaliação da curva de dissociação mostrou a presença de um único produto de PCR única (Figura 2B).

linhas celulares e amostras de mucosas normais foram testadas para a expressão das duas principais variantes de CD133 de splicing por RT-PCR com iniciadores ancorados sobre ambos os lados do exão spliced ​​out (exão 4). Os dados da amostra são mostrados demonstram que apenas um único produto foi identificado quando os produtos de PCR foram analisados ​​tanto (a) em gel de agarose e (b) a técnica mais sensível Q-PCR utilizando SYBR Green como um repórter. M = tamanho do marcador, nc = controle negativo, * representa DLD1. (C) Sequenciação dos produtos mostrou que o exão 4 foi excisado para fora da sequência de codificação, assim, apenas mais curto variante de splicing (AC133-2) estava a ser expressa. A sequência acima do electrofograma é de AC133-1 com exão 4 mostrado nas entrelinhas.

Knockdown de CD133

HT29 tem um alto nível de expressão CD133. As células foram transfectadas com CD133 específica mexidos ou ARNsi de controlo e foram testadas 72 horas pós transfecção. Western blot mostrou que a proteína era praticamente indetectável na quando CD133 siARN específica foi usada. Em contraste, a transfecção de o siRNA de controlo não tem qualquer efeito na expressão da proteína (Figura 3).

Células

HT29 foram transfectadas com CD133 específica siRNA (HT29

CD133-) ou mexidos controle ((HT29

SSC). Western blot confirmou a perda de expressão CD133 pelo silenciamento de genes. p-actina mostra carga de proteína iguais.

Associação de expressão CD133 com a proliferação de células

Nós comparamos a proliferação taxa entre as células com altos e baixos níveis CD133 utilizando duas abordagens experimentais. Em HT29 a proteína CD133 foi derrubado e o número de células monitorados durante 5 dias (Figura 4a), enquanto SW480 foi classificado em CD133 + /populações CD133- e números de celulares foram monitorados mais de 9 dias (Figura 4b). Ambas as experiências mostraram os mesmos resultados, isto é, não houve diferença significativa entre as células com expressão elevada ou baixa CD133. Similarmente, as contagens de corpos apoptóticos de flutuação durante este período não mostraram qualquer diferença (dados não mostrados).

a proliferação celular foi avaliada após knockdown de CD133 em HT29 (Figura 4a) e triagem de SW480 em populações CD133 + e CD133- puros (Figura 4b). Um ensaio de curso de tempo foi realizada ao longo de vários dias sem associação observada entre CD133 e números de celulares.

Associação de expressão CD133 com estaurosporina induzida a formação de apoptose e colônia

Um recurso que pode ser esperado em células-tronco é a resistência à apoptose após estresse exógeno. Ambas abordagens experimentais foram usados ​​para testar o efeito de níveis de CD133 na resistência à apoptose quando expostos a estaurosporina durante 24 horas. resultados concordantes foram obtidos, indicando que os níveis elevados de CD133 conferiu resistência estaurosporina.

CD133- células HT29 viáveis ​​menos estavam presentes que HT29

células SSC (Figura 5a, p = 0,01); Inversamente maior número de células viáveis ​​estiveram presentes na população CD133 + ordenada do que a população CD133- (Fig. 5b, p = 0,008). Não foi, porém, nenhuma diferença entre células quando expostas a sós DMSO.

CD133 deu resistência a estaurosporina apoptose induzida. A Figura 5a mostra que após exposição a estaurosporina havia menos células viáveis ​​após transfecção com CD133 siRNA específico (HT29

CD133-) do que com o controlo scrambled (HT29

SSC) (p = 0,01). Não foram observadas diferenças entre as células após a exposição com o DMSO. A Figura 5b mostra que a CD133 + população de células SW480 apresentaram mostraram significativamente maior resistência do que a população CD133- (p = 0,008). células A Figura 5C e 5D mostram CD133 + foram significativamente mais do que clonogénico CD133- células (p 0,0001 e p 0,003) em cultura de 2D e 3D, respectivamente. Figuras 5e (colónias formadas por células CD133 +) e 5F (colónias formadas por células CD133-) mostram que ambas as populações CD133 + e CD133- de SW480 foram capazes de formar colónias de células individuais (colónias típicas são mostrados).

Outra características de “stemness” é a capacidade para formar colónias. Isto foi testado por crescimento de células individuais em agar mole por duas semanas de cultura (3D) e cultura 2D e o classificados CD133 CD133 + e – células foram comparados. Em ambos os casos, as colónias eram visíveis após duas semanas, mas o número de colónias foi significativamente maior em células CD133 + (P 0,0001 e P 0,003). Na cultura 2D e 3D, respectivamente (figura 5c e 5d)

Associação de expressão CD133 com a migração de células

análise comparativa da motilidade celular entre as células com expressão alta e baixa CD133 foi testada por transpo� ensaios de migração. Ambos condições experimentais produziram resultados concordantes. Um número significativamente menor

CD133- células HT29 migraram através da membrana do que HT29

células SSC (Figura 6a, p = 0,04). Por outro lado, significativamente maior número de células migradas CD133 + de células CD133- (Figura 6b, p = 0,03). Um ensaio ferindo celular foi também utilizada seguinte silenciamento de genes que mostraram que os bordos da ferida eram significativamente mais estreita em HT29

células de SSC que na HT29

CD133- células (p 0,001), confirmando deste modo a relação entre a expressão elevada CD133 e aumentou motilidade celular (Figura 6c).

Transwell migração foi medida após knockdown de CD133 em HT29 e triagem de SW480 em CD133 populações +/-. Um número significativamente menor

CD133- células HT29 migraram através da membrana do que HT29

células SSC (Figura 6a, p = 0,04). Por outro lado, um maior número de células CD133 + ordenadas do que as células migraram CD133- (Figura 6b, p = 0,03). Um ensaio ferindo também foi realizado e silenciamento de genes foi associada com um atraso acentuado no fechamento da ferida que foi visiually perceptível após apenas 24 horas (Figura 6c) e estatisticamente significativa (p 0,001).

Plasticidade de expressão CD133 em linhas celulares

A linha celular SW480 foi classificado em populações CD133 + e CD133- que foram mantidas em condições de cultura de tecidos normais e submetidos à análise regular por citometria de fluxo. Imediata re-análise mostrou que populações CD133 + e CD133- foram, respectivamente, 97,6% e 99,9% de pureza (Figura 7a). PCR quantitativo mostrou repressão da transcrição de CD133 na população CD133- e embora CD133 mRNA ainda era detectável, foi apenas em 15% do nível visto no CD133 + população (Figura 8).

SW480 foi classificado em CD133 populações positivas e negativas que foram então cultivadas separadamente. (A) Supressão foi ajustada de modo que apenas as populações extremas que foram recolhidos, na repetição do teste imediato, mostraram ser muito populações puras. (B) Após cultura prolongada, tanto das populações classificadas se tornou bifásica. As proporções de células CD133 + e CD133- tornou-se estável após três semanas e não se alterou depois disso (embora não fossem a mesma que a linha celular parental original).

Q-RT-PCR análise das populações classificadas mostrou que não havia a repressão transcricional de

CD133

na população CD133- (embora níveis baixos de ARNm ainda eram detectáveis).

cultura prolongada resultou em ambas as populações revertendo a um perfil bimodal. A população CD133 +, após 3 semanas, consistiu de 70% de células CD133 + e células CD133- 30%, frequências que se mantiveram estáveis ​​em seguida por pelo menos 3 meses. As descobertas contrariam os relatórios publicados nos quais populações puras de células CD133 + reverter a taxa normal de CD133 +/- populações [8]. As células CD133- desenvolvido uma população de células CD133 + que, após 3 semanas, atingiu 17%, mas não aumentou em seguida (Figura 7b).

Discussão

A CD133 + população é variável em células de CRC linhas

conferido um grande número de células a partir de oito bem estabelecidas linhas celulares de CRC por citometria de fluxo para quantificar o tamanho da população CD133 +. Descobrimos que, em duas linhas de células (DLD1 e SW837) não havia células CD133 detectável +, em duas linhas de células (Caco2 e HT29) a CD133 + população era 95% do total de células de tumor enquanto as restantes linhas celulares tinham tamanhos da população variando de 32% -64%. Nossos dados estão de acordo com estudos realizados por letaet al. e Dalerba et ai. [18], [24] relataram que níveis semelhantes de expressão de CD133 nas linhas celulares HT29, Lovo e nenhuma expressão no DLD1. Nossos dados são, no entanto discrepantes com os de O’Brien e Ricci-Vitiani [8], [9], embora a causa dessa discrepância é desconhecida. Uma possibilidade é que os nossos estudos utilizaram linhas celulares estabelecidas, enquanto que os outros estudos utilizaram novas linhas celulares derivadas nos seus próprios laboratórios. É possível que a cultura prolongada pode causar alterações mantidos na regulação CD133 embora isso por si só, sugerem que a expressão CD133 não é um bom marcador de CSCs. Diferenças na técnica pode fornecer uma outra explicação, embora nós usamos os mesmos anticorpos como O’Brien e Ricci-Vitiani e mantivemos tempos de incubação com o anticorpo primário até 15 minutos. De qualquer maneira, os nossos dados demonstrou inequivocamente que em 4/8 linhas celulares, a população CD133 + ou é ausente ou compreende quase toda a população de células tumorais. Estes dados, juntamente com outros dados apresentados abaixo, levam-nos a concluir que CD133 provavelmente não é um marcador específico de células-tronco no CRC.

Apenas variante CD133 emenda AC133-2 é expresso em tecido do cólon

Embora uma grande variedade de variantes de splicing foram descritas para CD133, apenas um (denominado AC133-1 e que foi o primeiro a ser clonado) foi atribuída um número de sequência de referência. Este contém a sequência completa de codificao de comprimento, enquanto uma segunda variante de processamento (AC133-2, o segundo a ser clonado) aparece para emendar a exão 4. A nossa análise de 8 linhas de células CRC e 10 amostras de mucosa normal, usando tanto o ponto final e metodologias em tempo real, identificado apenas AC133-2 variante. Isto seria consistente com o estudo por Yu et al. [25] em que AC133-2 foi relatado como sendo a variante de processamento, que está presente em diversos compartimentos de células estaminais enquanto AC133-1 é limitado para o cérebro fetal e no músculo esquelético.

expressão CD133 está associada com algumas características de a célula-tronco fenótipo

a fim de avaliar a função de CD133, a linha de células HT29 foi testada após knockdown de CD133 por interferência RNA. Este método também pode produzir efeitos de “fora do alvo” e assim por uma abordagem complementar foi usada para separar SW480-uma linha celular com uma CD133 + população de 40% – em populações CD133 + e CD133- puros. Ambos os tipos de experiências produziu resultados semelhantes. Em primeiro lugar, os níveis de CD133 não parece alterar a proliferação celular ou apoptose. Não foram, contudo, diferenças significativas nas características que podem ser consideradas como parte do fenótipo de células-tronco. Assim, níveis elevados de CD133 foram associados com o aumento da clonogenicidade e resistência à apoptose induzida por estaurosporina. Este último pode ser devida a uma resistência inata de apoptose (possivelmente mediada por tais relatado associações como entre a expressão do CD133 e genes anti-apoptóticos tais como flip (caspase 8 inibidor) e Bcl-2 [26]. Alternativamente, pode ser devido a estratégias melhoradas citoprotectores, tais como a capacidade de extrusão activamente substâncias tóxicas do citoplasma [3].

uma outra característica que encontramos a ser associada com a expressão aumentada CD133 foi motilidade celular. Outros estudos sugeriram um papel para CD133 na célula motilidade, uma vez que é classicamente expressa em saliências de membranas [27], [28]. em certas situações, como a embriogénese e cicatrização de feridas, as células estaminais necessário adquirir características de motilidade. em CSCs, características de motilidade aumentada pode permitir a invasão e metástase de ocorrem-a noção apoiado pelo estudo do Rappa et al que encontrou expressão CD133 foi associado a metástases em células de melanoma [29]. os dados, no entanto, contradizem os de Horst et al. [30] que não encontrou essa expressão CD133 foi associada com a motilidade celular em Caco2.