Abstract

Fundo

biomarcadores urinários para a detecção de câncer de bexiga são limitados pela inadequada sensibilidade ou especificidade. Aqui nós avaliar a precisão do diagnóstico de Mcm5, um biomarcador ciclo celular novela de crescimento aberrante, sozinho e em combinação com NMP22.

Métodos

1677 pacientes consecutivos sob investigação de malignidade do trato urinário foram recrutados para um estudo prospectivo cego estudo observacional. Todos os pacientes foram submetidos a ultra-som, urografia excretora, cistoscopia, urocultura e análise citológica. Um ensaio imunofluorométrico foi utilizado para medir os níveis de MCM5 em sedimentos celulares urina. níveis urinários NMP22 foram determinados com o Kit NMP22® teste aprovado pela FDA.

Resultados

cânceres do trato genito-urinário foram identificados no 210/1564 pacientes (13%), com um resultado Mcm5 e em 195/1396 (14%) pacientes com um resultado NMP22. No ponto de corte ensaio em que sensibilidade e especificidade foram iguais, o teste Mcm5 detectado cancros da bexiga primários e recorrentes com sensibilidade de 69% (95% de intervalo de confiança = 62-75%) e 93% de valor preditivo negativo (IC 95% = 92- 95%). A área sob a curva ROC para Mcm5 foi de 0,75 (IC 95% = 0,71-0,79) e 0,72 (IC 95% = 0,67-0,77) para NMP22. Importante, Mcm5 combinado com NMP22 identificou 95% (79/83; 95% CI = 88-99%) de potencialmente diagnósticos fatais (ou seja, de grau 3 ou carcinoma in situ ou estágio ≥pT1) com alta especificidade (72%, 95% IC = 69-74%).

Conclusões

o imunoensaio Mcm5 é um teste não-invasivo para a identificação de pacientes com cânceres urothelial com precisão semelhante ao NMP22 ELISA Kit de teste aprovado pela FDA. A combinação de Mcm5 mais NMP22 melhora a detecção de UCC e identifica 95% da doença clinicamente significativa. Ensaios de um ensaio Mcm5 desenvolvido comercialmente adequado para um laboratório para o usuário final ao lado NMP22 são necessárias para avaliar a sua utilidade clínica potencial na melhoria vias de diagnóstico e cuidados de vigilância

Citation:. Kelly JD, Dudderidge TJ, Wollenschlaeger A, Okoturo O, Burling K, Tulloch F, et al. (2012) cancro de bexiga diagnóstico ea identificação da doença significativa clinicamente por Combinada Detecção urinária de Mcm5 e matriz nuclear de proteínas 22. PLoS ONE 7 (7): e40305. doi: 10.1371 /journal.pone.0040305

editor: Clive Shiff, Johns Hopkins University, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de fevereiro de 2012; Aceito: 4 de junho de 2012; Publicação: 09 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Kelly et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Cancer Research UK (número de concessão C428 /A3441 a KS e GHW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma urotelial (UCC) da bexiga urinária é o quarto câncer mais comum em os EUA, com uma estimativa de 73510 novos casos e 14880 mortes por cancro da bexiga em 2012 [1]. A cistoscopia é o método padrão de detecção de tumor da bexiga, no entanto, é um procedimento invasivo, desconfortáveis ​​e dispendiosas que resulta em infecção urinária em até 5% dos casos de [2]. Detecção de câncer de bexiga com um teste de marcador tumoral não-invasiva pode potencialmente melhorar a gestão da doença, aumentando a precisão e diminuir a morbidade associada a vias de diagnóstico e de vigilância atuais. Através da redução da frequência de cistoscopias, as melhorias na qualidade de vida e eficiência de custos do paciente podia ser visto.

biomarcadores urinários para a detecção de câncer de bexiga são uma grande promessa e, enquanto numerosos marcadores têm regulamentar nenhuma aprovação ter sido aceito como padrão procedimento de diagnóstico [3]. citologia urinária continua a ser o mais amplamente utilizado devido à alta especificidade, embora pouca sensibilidade. As novas tecnologias e biomarcadores, no entanto, têm o potencial de melhorar a precisão diagnóstica, com as estratégias de diagnóstico e de vigilância mais eficazes até à data utilizam cistoscopia fotodinâmica e biomarcadores [4]. proteína de matriz nuclear 22 (NMP22), por exemplo, é uma proteína aparelho mitótico nuclear que regula a separação de células e os cromatídeos filha [5], [6] e emergiu como um dos biomarcadores urinários promissores para UCC [3]. O FDA-approved, NMP22® quantitativa Kit de teste de imunoensaio baseado em laboratório (Matritech, Freiburg, Alemanha) e um teste qualitativo point-of-care, NMP22® BladderChek® (Matritech; ® símbolo seguir omitido), estão agora disponíveis para uso clínico . No entanto, embora os níveis NMP22 urinário são elevados no cancro da bexiga, mortos e moribundos células uroteliais em muitas condições não-malignas e inflamatórias também pode liberar NMP22, reduzindo assim a especificidade. Além disso, uma ampla faixa marcada no desempenho do teste foi relatado entre os diferentes estudos utilizando NMP22, com sensibilidade variando de 33% a 100% e especificidade de 40% para 93% [4].

A precisão limitado de disponíveis biomarcadores, juntamente com sua custa, tem, portanto, limitado introdução de biomarcadores urinários na prática clínica de rotina. Por isso ainda há uma necessidade urgente para identificar novos biomarcadores que possam melhorar a precisão do diagnóstico, seja quando usado isoladamente ou em combinação com testes de biomarcadores existentes [7].

O DNA máquinas iniciação da replicação representa um passo final e crítica em o controlo do crescimento a jusante de vias de sinalização complexas oncogénicos redundantes e é, por conseguinte, um alvo diagnóstico e terapêutico potencialmente atractivo [8]. As proteínas da família manutenção minicromossoma (MCM) (Mcm2-7, colectivamente referidos como MCM), montar em complexos hexaméricas que têm actividade de helicase de ADN, que é essencial para a iniciação da síntese de ADN [9], [10]. Em sistemas de órgãos alinhados-epiteliais proteínas MCM tornar-se desregulado e sobre-expressos em displásicos hiperproliferativa (pré-invasiva) e estados malignos, [8], [11] – [13]. Na verdade, o grau de expressão de Mcm2 e Mcm5 foi mostrado para prever a recorrência e de morte em pacientes com cancro da bexiga [14] – [16]. a expressão da proteína Mcm2-7 no epitélio normal é restrito para os compartimentos haste /trânsito basais e está ausente das camadas superficiais como células adoptar um fenótipo completamente diferenciado. Em lesões pré-malignas epiteliais displásicas /há uma expansão do compartimento proliferativa acoplado a diferenciação preso, resultando no aparecimento de células em divisão MCM-positivo nas camadas superficiais. A detecção de células esfoliadas MCM-positivas em amostras clínicas, por conseguinte, fornece um método potencialmente sensível para a detecção de cancros invasivos pré-invasivas e [8], [17], [18]. Em um estudo de prova de princípio que anteriormente mostraram que níveis elevados Mcm5 em células em sedimentos de urina é preditivo da presença de cancro da bexiga [19].

O objetivo deste estudo foi avaliar Mcm5 como um biomarcador para a detecção de cancro da bexiga por si só, em comparação e em combinação com NMP22. O julgamento observacional cego prospectivo utilizou um ensaio imunofluorométrico para medir Mcm5 e aprovado pela FDA Test Kit NMP22.

Métodos

Os sujeitos do estudo

Single anuladas amostras de urina foram obtidas a partir de 1677 de uma clínica de diagnóstico de um batente para investigação de hematúria. O diagnóstico foi estabelecido após a avaliação por cistoscopia, imagens do trato urinário superior, citologia e cultura de urina. confirmação histológica de câncer de bexiga em posterior ressecção trans-uretral foi o padrão de referência e todos os pacientes foram acompanhados por um período de seis meses a partir do momento das investigações iniciais. Foram excluídos pacientes com uma história recente de instrumentação genito-urinário ou cirurgia nas duas semanas anteriores. Também foram excluídos pacientes com história de doença maligna concomitante ou de outra doença maligna dentro de cinco anos anteriores ao estudo. Com essas exceções todos os pacientes consecutivos que participam pela investigação durante o período do estudo foram abordados para o recrutamento para o julgamento

As amostras de urina foram divididos igualmente para:. (I) exame de urina e cultura microbiológica, (ii) a análise citológica, (iii ) medição Mcm5 e (iv) a medição NMP22. Os pacientes foram submetidos imagens do trato urinário superior, incluindo ultra-som e urografia intravenosa. Doentes do sexo masculino foram examinados por exame rectal digital para a presença de doença da próstata clinicamente detectável. antigénio específico da próstata (PSA), não foi mandatado e níveis de PSA foram verificadas em uma proporção de casos em que o câncer foi suspeita ou que solicitou o teste. Se os níveis de PSA eram pacientes elevados foram oferecidos ultra-som trans-retal guiada biópsias da próstata. Normalmente todos os testes hematúria foram concluídas no prazo de 24 horas e, no prazo de duas semanas para todos os pacientes. Os dados clínicos foram inseridos em um banco de dados prospectivamente antes Mcm5 e análise NMP22. O padrão de referência para a detecção de câncer de bexiga foi a confirmação patológica após ressecção trans-uretral.

As amostras de urina foram analisados ​​de forma cega para detecção Mcm5, teste NMP22 e análises citológicas. Na conclusão do estudo, foram decodificados os dados do paciente e compararam sinais imunofluorométrico Mcm5 e resultados NMP22 com diagnósticos clínicos baseados em cistoscopia, histologia biópsia, imagiologia e citologia urinária. Preparo e classificação de tumores malignos foi realizada por um especialista uro-patologista usando o TNM (tumor-nódulo-metástase) sistema de classificação [20] e da Organização Mundial da Saúde de 1973 (OMS) sistema de classificação, respectivamente [21].

Ética Declaração

a aprovação ética foi obtida a partir da UCL comissões mistas /UCLH sobre a Ética de Pesquisa Humana (04 /Q0502 /1), o Comitê de Addenbrooke Hospital Ética (00/236) e do Newcastle e North Tyneside Research Comissão de ética (2002/161). consentimento informado por escrito foi recebida de todos os participantes.

Urina Citologia

As amostras de urina (50 ml) foram centrifugados a 1500 g durante 5 min. preparações de citospina foram preparadas em lamelas revestidas com poli-L-lisina, utilizando tubos de Cytospin Shandon e um citocentrifugação de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Shandon, Runcorn, Reino Unido). As amostras foram fixadas em álcoois metilados industriais e corados utilizando a técnica de Papanicolaou para esfregaços [20]. As amostras foram avaliadas por um cytologist consultor experiente em uro-patologia. Citologia foi classificado como positivo se foram identificadas células atípicas ou malignas.

NMP22 Ensaio

NMP22 foi medida por enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) usando o Kit de Teste NMP22 aprovado pela FDA produzido por Matritech (Freiburg, Alemanha). O ensaio executado em um 2000 processador de ELISA automatizado Dade Behring BEP (agora Siemens Healthcare). Todos os reagentes, calibradores e controlos estavam preparados, tal como recomendado pelo fabricante. Todos os padrões, controlos de qualidade e amostras foram analisadas em duplicado. Os resultados foram calculados utilizando o software de processamento de dados fornecido com o BEP 2000. O limite inferior de detecção do ensaio verificou-se ser de 2 U /mL. As amostras com concentrações maiores do que o padrão de topo foram repetidas após a diluição em tampão de ensaio. O coeficiente entre a-lote de variação foi de 13,3% para uma concentração de 11,3 U /ml, 8,8% a 34 U /mL e 9,5% a 65 U /mL. Um resultado para o teste de NMP22 estava disponível em 1396 pacientes, incluindo 195 pacientes (14%) com um tumor urotelial.

imunofluorométrico Ensaio para medir os níveis Mcm5 em sedimentos de urina

Mcm5 foi medida por dois -site imunoensaio de fluorescência resolvida no tempo no analisador AutoDELFIA (Perkin Elmer). Todos os padrões, controlos de qualidade e as amostras de urina foram preparadas e processadas como descrito [19]. placas de microtítulo Nunc Maxisorp (Perkin Elmer) foram revestidas com anticorpo monoclonal 12A7 Mcm5 de ratinho anti-humano [19] a uma concentração de 8 mg /L por Dako UK Ltd (Ely, RU). Um lote grande (cerca de 200) das placas foram preparadas por Dako e usadas durante todo o estudo. As placas foram recebidos pré-bloqueado e pronto para ser utilizado. Um segundo anticorpo de rato anti-humano Mcm5 monoclonal (4B4) [19] foi conjugado com európio por Dako. O anticorpo marcado com európio estava a uma concentração de 1,75 mg /mL. As células HeLa S3 foram adquiridos comercialmente (protecção da saúde agência Culture Collections, Porton Down, Reino Unido) e o ensaio foi calibrado com padrões de células HeLa transformadas com uma concentração de 150.000 células /poço. Uma série de padrões abrangendo a gama de concentrações de 150000 a 1500 células /poço foram preparadas diluindo o padrão de reserva em solução salina tamponada com fosfato contendo 0,04% de SDS e 0,02% de azida de sódio. amostras de controlo de qualidade com quatro concentrações diferentes de células HeLa foram analisados ​​no início e no final de cada lote. O protocolo para o ensaio foi como se segue AutoDELFIA. 50 ul padrão, ou amostra de controlo de qualidade foi adicionado (em duplicado) para a placa de microtitulação revestida com anticorpo, juntamente com 100 ul multibuffer DELFIA (Perkin Elmer código de produto 1.380-3.614). A placa foi incubada durante 2,5 horas com agitação contínua. A placa foi então lavada quatro vezes com tampão de lavagem DELFIA (Perkin Elmer código de produto B117-100). anticorpo de detecção marcado com európio 4B4 foi diluída em 1:1,800 multibuffer DELFIA. 100? L de anticorpo diluído foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada durante mais 4 h, com agitação contínua. A placa foi então lavada seis vezes com tampão de lavagem DELFIA e 200 uL solução melhoramento DELFIA (Perkin Elmer código de produto B118-100) foi adicionado a cada poço. A placa foi incubada num agitador durante mais 10 min. A quantidade de európio em cada poço foi medida no leitor de placa AutoDELFIA. Os dados foram automaticamente transferidos para um pacote de software MultiCalc (Perkin Elmer), o qual foi utilizado para gerar uma curva de calibração e calcular a concentração dos desconhecidos. O limite inferior de detecção do ensaio verificou-se ser de 1000 células /poço. As amostras com concentrações maiores do que o padrão de topo foram repetidas após a diluição no tampão de diluição padrão. O coeficiente entre a-lote de variação foi de 11,5% a uma concentração de 2648 células /poço e 11,0% em 26382 células /poço. Um resultado para o teste Mcm5 imunofluorométrico estava disponível em 1564 pacientes, incluindo 210 pacientes (13%) com um tumor urotelial.

Análise Estatística

sensibilidade e especificidade características de Mcm5 e NMP22 para a detecção de UCC da bexiga são apresentados como característica de operação do receptor (ROC). A área sob a curva ROC não paramétrico foi utilizado para avaliar o desempenho de diagnóstico geral de cada teste. Três pontos de corte foram utilizados para demonstrar o desempenho do teste em circunstâncias diferentes para Mcm5 como se segue: (i) o limite inferior de detecção do ensaio em que a sensibilidade do teste era máxima (1000 células /poço) (ii) sensibilidade igual a especificidade (2150 células /poço) e (iii) 95% de especificidade (8500 células /poço). valor preditivo negativo (VPN) e valor preditivo positivo (PPV) também foram estimadas. Um intervalo de confiança de 95% exato (CI) para cada parte, incluindo sensibilidade, especificidade e valores preditivos para Mcm5 e NMP22, foi derivado assumindo uma distribuição binomial. Recomenda-ponto de corte do fabricante para NMP22, 10 U /ml foi utilizado para todas as análises, a menos que especificado em contrário.

taxas de falsos positivos (FPR) para o Mcm5 e testes NMP22 em pacientes com diagnóstico benigno foram comparados com clara normais pacientes em uso de um teste qui-quadrado. O Mcm5 e valores NMP22 foram resumidas por meio de medianas e intervalos interquartis (IQR) e comparados com os pacientes normais clara usando o teste U de Mann-Whitney. Para cada biomarcador, a análise ROC foi repetido para homens e mulheres separadamente e as áreas sob as curvas ROC foram comparadas utilizando um teste qui-quadrado com um grau de liberdade. análise ROC também foi realizado para examinar a sensibilidade dos principais resultados à exclusão daqueles com doença benigna. Os valores dos biomarcadores urinários para pacientes com diferentes graus de tumores e estágios e pacientes normais foram comparados por meio de Mann-Whitney U-testes entre as categorias vizinhos e utilizando o teste de Jonckheere-Terpstra para tendência entre os diversos graus e fases. O teste do qui-quadrado para linear por associação linear foi utilizado para avaliar a evidência para uma tendência nas taxas de falsos positivos, aumentando o grau do tumor e estágio. A sensibilidade determinada por citologia urinária foi comparada com a do teste Mcm5 imunofluorométrico utilizando o teste de McNemar para proporções emparelhados. A precisão de um biomarcador foi definido como o valor de sensibilidade e especificidade, onde o ponto de corte desde que estes sejam iguais. A precisão dos dois testes de biomarcadores foi comparada pelo teste de McNemar. O teste de McNemar também foi utilizado para comparar a sensibilidade da citologia com que de cada biomarcador em pontos de corte proporcionando a mesma especificidade como observado para a citologia. correlação de Spearman foi utilizado para avaliar o grau em que os biomarcadores foram diferenciado no caso UCC e em grupos de controlo normais. Todos os testes estatísticos foram bicaudais, e um nível de 5% foi usado para indicar significância estatística.

Uma análise ROC multi [22] foi realizada para determinar o desempenho adicional resultante do uso de ambos os biomarcadores juntos. Nesta análise, NMP22 foi mantido fixo no ponto de corte recomendada de 10 U /mL e Mcm5 foi incluído com um ponto de corte variando. valores elevados de qualquer um dos marcadores poderia prever positivo para UCC. O desempenho adicional de Mcm5 sobre aquela obtida a partir de NMP22 (10 U /mL cut-point) foi avaliada usando a área sob a curva não paramétrico multi-ROC, e avaliadas para significância estatística usando um teste qui-quadrado com um grau de liberdade. De forma a demonstrar o desempenho do teste, Mcm5 foi então fixado no ponto de corte do que a fornecida igual sensibilidade e especificidade na curva multi-ROC da utilização dos marcadores combinadas. Esta precisão teste de combinação foi comparada com a precisão do teste fornecida pelo uso de somente NMP22 pelo teste de McNemar.

Resultados

Demografia e Investigação Clínica

As características demográficas, modo de apresentação , o diagnóstico final, e o grau do tumor e estágio para os 1677 pacientes incluídos neste estudo estão resumidos na tabela 1. A população de estudo foi predominantemente do sexo masculino (62%) e tinham uma idade média de 60,7 anos (desvio padrão, 16,3 anos). Daqueles com uma apresentação gravada, 54% tinham hematúria visível e 46% tinham hematúria não-visível. Estes pacientes foram recém apresentação de casos, embora quatro pacientes recrutados, mais tarde revelou uma história prévia de UCC. As investigações foram omitidos em uma proporção de casos da seguinte forma: cistoscopia não foi realizada em 20 pacientes, ecografia em 186 doentes e urografia intravenosa em 223 pacientes. Urina citologia não estava disponível para 109 pacientes, devido à coleta de amostra insuficiente ou, em alternativa, porque o teste não foi realizado. Nem ecografia nem urografia intravenosa foi realizada em 77 pacientes. Todos os pacientes tiveram um diagnóstico clínico atribuído a eles pelo seu médico. Os dados não foram formalmente recolhido sobre os efeitos adversos de testes clínicos padrão e sem efeitos adversos do teste urinário para Mcm5 ou NMP22 foram registrados.

Após investigação clínica, os tumores do trato urinário foram identificados em pacientes 222/1677 (13%). Quase todos os tumores eram UCCs, mas, a investigação também identificou um caso de adenocarcinoma e dois casos de carcinoma de células escamosas da bexiga. Os UCCs eram tumores predominantemente na bexiga, com apenas sete pacientes com tumores do tracto superior. Os UCCs trato superior estão incluídas juntamente com os tumores da bexiga para a análise relatados abaixo. Os diagnósticos dos pacientes restantes incluídas outras doenças malignas, lesões benignas ou cistos do rim, condições inflamatórias e benignas congênitas, litíase urinária, hiperplasia benigna da próstata e doenças nefrológicas. Os diagnósticos são listados na Tabela S1. Como um componente da via de diagnóstico, citologia urinária apresentou uma sensibilidade de 9% (IC de 95%, 5-14%; incluindo a citologia atípica como positivo), especificidade de 88% (IC de 95%, 86-89%) e de VPP 10% (95% CI, 7-15%).

Mcm5 e teste de Desempenho NMP22

O teste Mcm5 discriminados, com alta especificidade e sensibilidade, entre os pacientes com e sem cancro da bexiga, como demonstrado pela ampla área sob a curva ROC (AUC) (0,75 [IC 95% = 0,71-0,79]) (Figura 1), estatisticamente significativamente maior do que a área coberta pelo hipótese nula (0,5; P 0,001) e com base nas 210 e 1354 pacientes, respectivamente, com e sem UCC.

A sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivos e negativos (VPP e VPN) para Mcm5 são apresentados na Tabela 2. A análise de ponto de corte (cut -points correspondem a: (i) menor limite de detecção do ensaio; (ii) em que a sensibilidade é igual a especificidade, e (iii) a especificidade de 95% para todos os doentes testados) demonstraram uma vasta gama de níveis de desempenho de teste (Tabela 2) . No limite inferior de detecção do ensaio, o teste tinha 80% (167/210) (95% CI = 73-85%) e sensibilidade de 20% (167/846) (IC 95% = 17-23%) de PPV. Quando a sensibilidade é igual a especificidade, o teste tinha 69% (145/210) (95% CI = 62-75%) e sensibilidade de 26% (145/565) (IC 95% = 22-30%) de PPV. A 95% de especificidade (1286/1354), o teste tinha 42% (89/210) (IC 95% = 36-49%) e sensibilidade de 57% (89/157) (IC 95% = 49-65%) PPV .

o teste NMP22 discriminados com alta especificidade e sensibilidade, como demonstrado pelo grande AUC (0,72 [IC 95% = 0,67-0,77]; hipótese nula [0,5; P 0,001] (Figura 1) ) e com base em 195 e 1201 pacientes, respectivamente, com e sem UCC. A sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivos e negativos para NMP22 no /ml corte de ponto 10 U recomendado são apresentados na Tabela 2. A sensibilidade foi de 53% (104/195) (IC 95% = 46-60%) e PPV 36% (104/291) (95% CI = 30-42%).

a fim de avaliar o desempenho do teste em pacientes com diferentes estágios e graus de doença a verdadeira taxa positiva (TPR) foi calculado para Mcm5 (nos diferentes pontos de corte), NMP22 e citologia para o músculo invasivo vs não-músculo invasivo (Tabela S2) e entre os diversos graus (Tabela S3). Teste de desempenho melhorou em todos os testes em categorias estágio e grau mais elevados

Onde a especificidade de NMP22 (cut-ponto 12.1) foi a mesma que a da citologia positiva (88%; 989/1128)., a sensibilidade de NMP22 foi significativamente superior (P 0,001) (51%; 91/177 versus 8%; 14/177). Onde a especificidade de Mcm5 (5150-célula ponto de corte) foi a mesma que a citologia (87%; 1109/1271) a sensibilidade de Mcm5 foi significativamente superior (P 0,001) (52%; 100/193 contra 9% ; 17/193)

Análise de Biomarcadores Falso positivo

os falsos positivos foram encontrados em 400/1301 (31%) dos pacientes normais e benignos claros de diagnóstico com o teste Mcm5 na célula 2150. corte de ponto. Houve uma taxa significativamente maior de resultados falsos positivos em pacientes do sexo feminino, 38% (200/520), em comparação com os homens 26% (200/781) (P 0,001). níveis Mcm5 urinário também foram significativamente maiores em fêmeas normais /benignos comparação com os homens (células medianas 1560 /poço [IQR = 1000-3675 células /poço] vs medianos 1000 células /poço [IQR = 1000-2180 células /poço], P 0,001). Além disso, em comparação com pacientes normais, aqueles com, cálculos urinários tinha uma significativamente maior taxa de falsos positivos (44% [47/106] vs 30% [201/661], P = 0,004) e maiores níveis urinários de proteína Mcm5 (mediana 1840 células /poço [ 1000-3963 células /poço] vs 1040 células /poço [ 1000-2645 células /poço], P 0,001; Tabela 3). Não houve evidência de uma associação entre a taxa de falsos positivos e qualquer um dos outros grupos, incluindo condições inflamatórias benignas e hiperplasia prostática benigna. Nos grupos de pacientes normais e benignos claros não foram observadas diferenças significativas (P = 0,99) nos níveis de NMP22 entre machos e fêmeas. Um sinal NMP22 elevada e aumentada foi observada a taxa de falsos positivos para os doentes com infecções do tracto urinário (FPR: 22% versus 11%, P = 0,001; mediana resultado NMP22: 3,35 U /ml versus 2,2 U /ml, P 0,001) e cálculos urinários (FPR: 23% vs 11%, P = 0,001; NMP22:2.55 U /mL vs 2,2 U /mL, P = 0,047) (Tabela 3)

A análise ROC para Mcm5. e NMP22 foi repetido observando os resultados em todos os homens e mulheres (Tabela S4 e Figura S1). Não houve diferenças significativas nos valores da AUC para Mcm5 entre machos e fêmeas (P = 0,76), mas houve uma diferença significativa no valor NMP22 AUC entre machos e fêmeas (AUC 0,69 para o sexo masculino vs 0,80 para o sexo feminino, P = 0,025), aparentemente relacionada com a maior sensibilidade NMP22 em mulheres.

Biomarcador falso negativo Análise

Tabela 4 e Tabela S5 mostram as taxas de falsos negativos de Mcm5 urinária e NMP22 agrupados por grau do tumor e estágio. Não havia evidência de uma tendência para a diminuição da taxa de falso-negativo com o aumento do grau do tumor e estágio para ambos os biomarcadores urinários. Para graus 1, 2 e 3, respectivamente, as taxas de falsos negativos para Mcm5 urinária no ponto de cortar 2.150 células foram 52% (95% CI = 31-73%), 37% (IC 95% = 28-46%) e 11% (IC 95% = 4-22%; tendência P 0,001). Para NMP22 no ponto de corte de 10 U /ml, os correspondentes taxas de falsos negativos foram de 80% (95% CI = 59-93%), 49% (IC 95% = 40-59%) e 25% (95% IC = 14-40%; tendência P 0,001). Tendências semelhantes foram observadas para o estágio do tumor. Observou-se uma diminuição significativa da amplitude do Mcm5 e sinal de NMP22 com menor grau do tumor eo estágio, de acordo com as crescentes taxas de falsos negativos observados para estes grupos (Tabela 4 e Tabela S5).

Combinada Biomarcador multi Análise -ROC

Houve 183 UCCs bexiga e 1100 pacientes normais com os dados de ensaio disponíveis para ambos os marcadores urinários. Para estes pacientes, um ponto de corte Mcm5 de 2180 células /poço fornecida igual sensibilidade e especificidade de 71% (130/183 e 777/1100), e por NMP22 um ponto de corte de 4,6 L /mL munido igual sensibilidade e especificidade de 67% (123/183 e 742/1100). Embora não houvesse modestamente maior desempenho de Mcm5 comparação com NMP22 em termos de precisão (71% versus 67%, diferença de 3,3%, IC95% = -0.2-6.7%), esta diferença não foi estatisticamente significativa (teste de McNemar: P = 0,067).

os coeficientes de correlação de Spearman entre Mcm5 e NMP22 foram moderadamente elevada (rho = 0,54) para os casos UCC e desprezível (rho = 0,08) para o grupo normal, indicando potencial para os biomarcadores para fornecer funções distintas dentro uma combinação. Com base na análise multi-ROC, o teste Mcm5 imunofluorométrico, em combinação com NMP22 no ponto de corte de 10 U /mL recomendada, apresenta um aumento estatisticamente significativo no desempenho (P 0,001) em comparação com NMP22 sozinho no corte- recomendado ponto (área sob a curva multi-ROC = 0,65, IC 95% = 0,58-0,71). Como uma demonstração, se qualquer NMP22 excede 10 U /mL ou Mcm5 excede o ponto de corte 4200 de células, esta combinação proporciona sensibilidade (131/183) e especificidade (789/1100) ambos iguais a 72%, o que indica a melhoria sobre utilização de NMP22 sozinho em que a sensibilidade (123/183) e especificidade (742/1100) são ambos iguais a 67% (72% versus 67%, diferença = 4,3% [IC 95% = 1,5-7,0%], teste de McNemar P = 0,002) . Em combinação com NMP22 a 10 U /ml, o teste de MCM5 elimina falsos negativos do teste de NMP22, oferecendo uma melhoria da sensibilidade de 54% de NMP22 sozinho a sensibilidade de 75% com 65% de especificidade (2800-célula cortar-ponto), ou para sensibilidade de 80% com 58% de especificidade (1900-célula cortar-ponto), ou para a sensibilidade máxima de 85% com 45% de especificidade (1000-célula cortar-ponto).

na análise combinação, com NMP22 ( 10 U /mL cut-point) e Mcm5 (ponto de corte 4200-celular, onde a sensibilidade e especificidade são iguais), 100% (31/31) dos cancros invasivos (muscle estádio iE ≥ T2), 93% (40/43 ) de tumores pT1 e 53% (54/102) dos tumores PTA foram detectados. O número total de doentes com carcinoma in situ foi baixa e 86% (07/06) foram detectados. Grau 1 a doença foi identificada em 46% (10/22), grau 2 da doença em 64% (68/106) e grau 3 da doença em 96% (53/55) dos casos (incluindo 6/7 casos de carcinoma in situ) . Importante, Mcm5 combinado com NMP22 identificou 95% (79/83, 95% CI = 88-99%) dos diagnósticos potencialmente fatais (ou seja, de grau 3 ou da CEI ou estágio ≥pT1) com alta especificidade (72%, 95% CI = 69-74%).

Discussão

em um estudo anterior prova-de-conceito que mostrou que níveis elevados Mcm5 em sedimentos celulares de urina são altamente preditivos de câncer de bexiga [19]. O julgamento observacional cego prospectivo aqui relatado, envolvendo um grande grupo de pacientes, confirma nossas observações iniciais que Mcm5 é um biomarcador sensível e específico para a detecção de UCC. Importante, por meio de análise multi-ROC, mostramos aqui que o teste Mcm5, em combinação com NMP22 no cut-ponto estabelecido de 10 U /mL, aumenta a precisão do diagnóstico sobre NMP22 em isolamento e identifica quase todos potencialmente doença fatal.

Apesar de numerosos estudos durante a última década, a precisão relatado do teste NMP22 é altamente variável. Muitos dos estudos anteriores recrutou pequeno número de sujeitos a moderada e relataram altos sensibilidades e especificidades, acima de 80% [23] – [26]. No entanto, uma vasta gama de desempenho do teste foi observado em estudos mais recentes, com sensibilidade que varia entre 33% a 100% e especificidade de 40% para 93% [4]. A análise conjunta incluindo os ensaios mais recentes sugere uma sensibilidade de cerca de 68% e uma especificidade de 79% [4]. Um recente estudo internacional grande multi-institucional revelou uma variabilidade acentuada no desempenho do teste NMP22 entre instituições com sensibilidade e especificidade que varia entre 36% a 86% e de 50% para 94%, respectivamente participante [27]. Variabilidade tem sido atribuída a vários fatores de confusão, incluindo variáveis ​​biológicas, analíticos e epidemiológicos e viés metodológico.

Nosso estudo representa o maior estudo observacional, prospectivo já realizado usando o biomarcador urinário NMP22. Notavelmente, o desempenho no ponto de corte de 10 U /mL, com uma sensibilidade de 53% e especificidade de 84%, é um pouco menor que a relatada na análise conjunta, mas quase idêntica ao resultado de diagnóstico relatado na Matritech suportado grande paciente ensaios de coorte utilizando o ensaio proteômica NMP22 point-of-care [4], [28]. Curiosamente observou-se significativamente maior precisão do diagnóstico de NMP22 em mulheres em comparação aos homens.