Abstract

Introdução

células assassinas induzida por citocinas (células CIK) são um subconjunto heterogêneo de ex-vivo expandiu linfócitos T que são caracterizadas com uma atividade de matar tumor MHC-irrestrito e um misto fenótipo T-NK. Adoptiva CIK transferência de células, uma de a imunoterapia adoptiva, representa uma terapia promissora anticancro não tóxico. No entanto, em estudos clínicos, a actividade terapêutica de transferência adoptiva CIK células não é tão eficiente como o previsto. Possíveis explicações são que a vasculatura do tumor anormal e microambiente do tumor hipóxico possam impedir a infiltração e eficácia dos linfócitos. Trabalhamos com a hipótese de que a terapia antiangiogenesis poderia melhorar a actividade anti-tumoral de células CIK normalizando a vasculatura do tumor e modulando microambiente do tumor hipóxico.

Métodos

Nós combinados endostatina humana recombinante (rh-endostatina) e as células CIK em o tratamento de modelos murinos de carcinoma de pulmão. microscopia intravital, contraste dinâmico melhorado ressonância magnética, imuno-histoquímica, citometria de fluxo e foram utilizados para investigar a vasculatura do tumor e microambiente hipóxica assim como a infiltração de células imunitárias.

Resultados

Os nossos resultados indicaram que RH-endostatina em sinergia com células adoptivas CIK transferir para inibir o crescimento do carcinoma de pulmão. Descobrimos que a vasculatura tumoral normalizado rh-endostatina e reduziu a área hipóxica no microambiente tumoral. A hipoxia inibiu significativamente a proliferação, citotoxidade e migração de células CIK in vitro e impediu o homing de células CIK em parênquima do tumor ex vivo. Além disso, descobrimos que o tratamento com rh-endostatina aumentou significativamente o homing de células CIK e diminuiu a acumulação de células imunitárias supressivos no tecido do tumor. Além disso, a terapia de combinação produziu um nível mais elevado de linfócitos de infiltração de tumor, em comparação com os outros tratamentos.

Conclusões

Os nossos resultados demonstram que RH-endostatina melhora o efeito terapêutico da terapia adoptiva células CIK contra carcinomas do pulmão e desmascarar os mecanismos da eficácia antitumoral sinérgica, proporcionando uma nova lógica para a combinação de terapia antiangiogenesis com imunoterapia no tratamento do cancro do pulmão

Citation:. Shi S, Wang R, Chen Y, Song H, Chen L, Huang G (2013) Combinando terapia antiangiogênica com celular adotiva Imunoterapia exerce melhores efeitos antitumorais em Non-Small Cell Lung Cancer Models. PLoS ONE 8 (6): e65757. doi: 10.1371 /journal.pone.0065757

editor: Juri G. Gelovani, Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de dezembro de 2012; Aceito: 29 de abril de 2013; Publicação: 14 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Shi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (número Grant: 81101739) e China Medical Foundation International (número de concessão: CIMF-F-H001-023). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro do pulmão é uma das principais causas de morte relacionada ao câncer [1]. A maioria dos pacientes com câncer de pulmão são diagnosticados em estágios avançados (III ou IV) e diversos tratamentos surgiram incluindo quimioterapia, radioterapia, terapia-alvo e imunoterapia. CIK células são populações heterogéneas de células derivadas a partir de sangue periférico humano ou ratinhos baço, após a expansão in vitro com interferão-γ, anticorpos anti-CD3 e interleucina-2 [2]. células CIK mediar citotoxicidade potente MHC-irrestrita contra uma variedade de células tumorais e pode reconhecer e matar células de tumor, sem exposição prévia ou escorva. Existem duas subpopulações principais podem ser distinguidos dentro do volume de cultura de células CIK expandidas in vitro, um co-expressando as moléculas CD3 e CD56 (CD3

+ CD56

+) enquanto que o outro apresenta uma CD3

+ CD56

– fenótipo. A actividade anti-tumoral de células CIK foi relatado para ser restrita principalmente ao CD3

+ CD56

+ células [3]. Adoptiva CIK transferência de células, uma de a imunoterapia adoptiva, representa uma terapia anti-cancro não-tóxico promissora no tratamento de tumores sólidos refractários ao tratamento convencional. No entanto, em estudos clínicos, a actividade terapêutica de transferência de células CIK não é tão eficiente como antecipado [4]. transferência de células adotiva eficaz está a enfrentar numerosos desafios, tais como tolerância imunológica sistêmica e tumor de escape imune local. O homing de células imunitárias no local do tumor é reduzido e as funções imunitárias antitumorais são inibidas pelo microambiente tumoral e propriedades imunomoduladoras de populações de células supressoras [5], [6]. Assim, é urgente de encontrar uma terapia eficaz para aumentar a eficácia de transferência adoptiva de células de forma a melhorar o efeito clínico de doentes com cancro.

tem sido proposto que a eficácia da imunoterapia baseada em células pode ser afectada pela integridade da vasculatura do tumor e do tumor imunossupressora microambiente [7]. A hipoxia é uma marca do ambiente metabólico anormal em tumores sólidos. Excepto por estarem envolvidos na diminuição da sensibilidade à radiação e a resistência à quimioterapia, hipoxia tem emergido como um factor significativo de tolerância imunológica no microambiente tumoral [8], [9], [10]. Várias linhas de evidência sugeriram que antiangiogenesis transitoriamente vasculatura tumoral normalizado, diminuição da hipoxia intra-tumorais e aumento da infiltração de linfócitos no tumor, o que proporcionou uma base racional para a combinação de terapia com antiangiogenesis imunoterapia celular adoptiva [11], [12]. antiangiogenesis terapia tem sido relatado para aumentar a eficácia antitumoral da quimioterapia, radioterapia e imunoterapia em ambos os modelos animais e no ser humano [13], [14], [15], [16]. A endostatina um fragmento de 20 kDa de colagénio do tipo XVIII, capaz de reduzir a proliferação, a migração e a invasão de células endoteliais através da interacção αvβ1, -αvβ3, e intergrins avp5 na superfície de células endoteliais da veia umbilical humanas (HUVECs) [17]. Na fase I e fase II de ensaios clínicos nos Estados Unidos, endostatina mostrou menor a resposta antitumoral nenhum embora sem efeitos colaterais adversos foram encontrados. Rh-endostatina utilizado no presente estudo é uma forma modificada de endostatina com uma sequência de ácido nove-amino adicional que formou uma outra estrutura his-tag e foi aprovado para uso clínico pela Food and Drug Administration Estado na China para o tratamento de avançado cancro do pulmão de não-pequenas células, em 2005 [18]. Ficou provado que rh-endostatina poderia melhorar o progresso livre sobrevida dos pacientes em avançado cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) com a combinação de quimioterapia em ensaios clínicos randomizados. Temos anteriormente mostraram que RH-endostatina poderiam melhorar a eficácia antitumor do paclitaxel no tratamento do carcinoma pulmonar [19]. Rh-endostatina tem sido relatada para melhorar a radioresponse para o carcinoma humano através da melhoria do microambiente do tumor hipóxico [8], [20]. No entanto, até recentemente, há poucas informações disponíveis na literatura sobre o efeito antitumoral de combinar rh-endostatina com imunoterapia celular adotiva. Realizamos essa pesquisa para determinar se rh-endostatina poderia melhorar o efeito antitumoral do adotiva CIK transferência de células e para ilustrar os possíveis mecanismos pelos quais rh-endostatina liberados todo o potencial da terapia celular adotiva. Nossos resultados mostraram que rh-endostatina poderia melhorar os efeitos antitumorais de células CIK e sugeriu que a terapia de combinação com células CIK rh-endostatina e realizou uma grande promessa no tratamento de pacientes com câncer avançado de estágio de pulmão.

Métodos

Declaração de Ética

animal estudo foi realizado em estrita conformidade com as orientações para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do Hospital Jinling. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Jinling Hospital (NO. 2010062412). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia com pentobarbital de sódio e cetamina e animais foram sacrificados por sobredosagem de anestésicos. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. amostras de sangue humano foram coletadas de doadores informados e o procedimento foi realizado em estrita conformidade com o procedimento aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Jinling. doadores amostra de sangue forneceram seus consentimentos informados por escrito para participar neste estudo.

Linhas Celulares

murino Lewis células de carcinoma de pulmão, células de adenocarcinoma de pulmão humano A549 e SPC-A1 foram adquiridos a partir de Xangai Instituto de bioquímica e biologia celular (Xangai, China). HUVECs foram adquiridos de KeyGen Biotech (Nanjing, China). células de carcinoma de pulmão de murino Lewis [19] foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (Invitrogen, EUA) complementado por 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina e 10% de soro fetal de bovino. Células de adenocarcinoma do pulmão humano A549 [8] e SPC-A1 [21] foram mantidas no nosso laboratório e cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibaco, EUA) suplementado com 100 U /mL de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina e 10% de soro fetal de vitelo . HUVECs [22] foram cultivadas em F12K (Mediatech) suplementado com 100 U /mL de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 10% de FBS, 0,1 mg /ml de heparina, 0,03 mg /de suplemento de crescimento de células endoteliais ml (Sigma Aldrich). Todas as células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2.

Modelos Animais

SPF ratinhos C57BL /6 e ratinhos nus Balb /C (6-8 semanas de idade) foram adquiridas da Academy of Military Medical Science (Pequim, China), mantidos no comparativo Departamento de Jinling Hospital Medicina e criados sob temperatura e umidade controladas, e uma de 12 horas de escuridão, ciclo de 12 horas de luz com alimento estéril e ad libitum água. Nós estabelecemos três modelos animais no presente estudo. Dois modelos de xenoenxerto do adenocarcinoma do pulmão humano foram estabelecidos por inoculação subcutânea de células A549 e células SPC-A1 (1 × 10

6 /ul de PBS), respectivamente, no flanco direito de ratinhos nus BALB /C. Para o modelo de tumor terceiro, ratinhos C57BL /6 foram inoculados subcutaneamente no flanco direito com 1 × 10

6 células de carcinoma do pulmão de Lewis em 100 ul de PBS. Os volumes dos tumores subcutâneos foram medidos diariamente pela pinça e volumes tumorais foram calculados pela fórmula:. o volume do tumor = 0,52 x comprimento x largura

2

Generation and Cellular Fenótipo Análise de CIK As células

as células CIK humanas foram geradas como previamente descrito [23]. Resumidamente, as amostras de sangue a partir de doadores de consentimento foram processados ​​utilizando Ficoll-Hypaque de gradiente de densidade centrifugação (Pequim reagentes químicos Company, China) para separar células mononucleares do sangue periférico. Após lavagem no meio, as células foram ressuspensas em meio RPMI-1640 (10% de FCS, 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina), a uma densidade de 2-4 x 10

6 células /ml. A 1000 U /ml de interferão-γ (Peprotech, EUA) foi adicionado no primeiro dia da cultura. Após 24 horas, a 500 U /ml de Interleucina-2 (Peprotech, EUA) e 50 ng /ml de anticorpo anti-CD3 (eBioscience, EUA) foram adicionados. As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 e foram sub-cultivadas a cada 2-3 dias com meio completo fresco com 300 U /ml de Interleucina-2 (Peprotech, EUA) durante 2 semanas. A geração do rato de células de baço CIK de células foi operado semelhante ao de células CIK humanas. A fim de caracterizar os fenótipos de células CIK, células cultivadas durante 7, 14 e 21 dias foram colhidas e coradas durante 30 min a 4 ° C com os seguintes anticorpos monoclonais conjugados com FITC ou PE-conjugado (mAbs): anti-CD3 e anti- CD56. Por citometria de fluxo, a expressão de marcadores de superfície, CD3, CD56 foram analisados ​​e registados (Fig. S2). Todos os anticorpos foram obtidos a partir de (eBioscience, San Diego, CA) utilizando procedimentos padrão. Um total de 100000 células por amostra foram adquiridas e analisadas num FACS Calibur e CellQuest Software (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).

Protocolo de Tratamento

ratinhos nus

BALB /C foram desafiados por via subcutânea no flanco direito com 100 ul (1 × 10

7 /ml) de células A549. Quando os volumes dos tumores foram aproximadamente 100 milímetros

3, os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n = 4-5 por cada grupo) e os tratamentos foram iniciados. O dia em que o tratamento começou foi designado d0. A terapia antiangiogenesis neste estudo foi de injecção subcutânea de 5 mg /kg de rh-endostatina durante 7 dias e a imunoterapia adoptiva consistiu de dois transfusão intravenosa de células CIK em d6 e D9 (2 × 10

7 células por dose, em um total volume de 100 uL). Os agrupamentos detalhados foram como se segue (Fig S1.): (1) Grupo NS, tratados com solução salina normal (NS). (2) Grupo PT, tratados apenas com rh-endostatina. (3) Grupo CIK, tratados com células CIK sozinho. (4) Grupo EN + CIK, tratada com rh-endostatina seguido por transfusão de células CIK. O peso corporal e o volume tumoral foram registados diariamente. O sinergismo de duas terapias foi avaliada de acordo com a seguinte fórmula:. Q = E

A + B /[E

A + (1-E

A) E

B] [24]

E

a + B, a taxa de inibição da terapia de combinação.

E

a, a taxa de inibição da terapia antiangiogênica rh-endostatina.

E

B, a taxa de inibição da adotiva CIK células imunoterapia

q . 0,85 significa que as duas terapias são antagonismo

q .. 1.15 significa que as duas terapias são sinergismo

0.85≤ q ≤1.15 significa que as duas terapias são aditivos.

O experimento foi repetido com quatro grupos de C57B /6 ratinhos portadores de carcinoma do pulmão de Lewis e quatro grupos de ratinhos nus BALB /C portadores de carcinoma do pulmão de SPC-A1.

Condições Cultura

condição de incubação hipóxica foi realizada em uma, estação de trabalho anaeróbio incubadora umidificada (Box Bug; ALC International, Cologno Monzese, Milão, Itália). Uma mistura gasosa de 1% O

2, 5% de CO

2, e 94% N

2 foi injectado continuamente com um caudal de 25 L /min para a incubadora anaeróbica estação de trabalho. Para a condição normóxico, as células foram cultivadas a 37 ° C numa incubadora humidificada constituída por 20% de O

2, 5% de CO

2, e 75% de N

2. Todos os reagentes, incluindo materiais de média e plásticos utilizados para os tratamentos de hipoxia foram equilibrados na câmara anaeróbia para minimizar a contaminação com o ar.

carboxifluoresceína diacetato Succinimidyl Ester (CFSE) Labeling

Rotulagem de células CIK com CFSE foi realizada como descrito anteriormente [25]. Resumidamente, as células CIK humanas foram marcadas com CFSE (Molecular Probes Biotec., Concentração final de 5 pmol /L em PBS) e incubada em 37 ° C durante 6 minutos. A reacção de marcação foi parada pela adição de meio RPMI-1640 frio com 10% de FCS, e as células foram lavadas duas vezes com PBS com 2% de FCS para remover o excesso de CFSE.

supressão da proliferação Ensaio

CIK As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (10% de FCS, 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina) em placas de 96 poços sob condições de normóxia ou hipóxia. Anti-CD3 e interleucina-2 foram adicionados para o meio, a fim de estimular a divisão das células CIK. Quarenta e oito horas mais tarde, as células CIK foram contadas por hemocitometria em microscópio de luz.

In vitro Ensaio de citotoxicidade

Os citotoxicidades de células CIK contra células alvo em condições de normóxia e hipóxia foram analisados ​​usando CytoTox 96 ® ensaio de libertação de desidrogenase não radioactivo ensaio de Citotoxicidade de Lactato (Promega, Madison, WI, EUA). Resumidamente, as células A549 foram colocadas em duas placas de 96 poços a 1 × 10

5 células /poço e incubadas durante 48 h com células de CIK em 20:01, 40:1 efector-para-alvo (E-a-t ) as proporções. Um volume de 30 ul de sobrenadante de cultura de células foi transferido para transparentes placas de 96 poços de fundo plano, seguido pela adição de 30 ul de substrato. Após incubação durante 30 minutos no escuro à temperatura ambiente, a reacção foi parada pela adição de solução de paragem 30 ul. Em seguida, a absorvância foi medida a 490 nm. A libertação máxima de LDH foi realizada por células alvo de lise completo. células-alvo ou células efetoras só foram usados ​​como controles negativos (libertação espontânea). A taxa de morte foi determinada de acordo com a fórmula: matando taxa (%) = [(contagens experimentais – contagens de controle efetoras -target contagens espontânea) /(alvo valores máximos – contagens espontâneas-alvo)] × 100

Transmigração. ensaio

ensaio de transmigração foi realizada com inserções Transwell ™ (Costa, EUA) contendo cultura HUVECs. As HUVECs foram adicionadas à câmara superior e incubaram-se sob normóxica ou condição hipóxica durante 24 h, respectivamente. Um total de 1 × 10

6 CIK células em 200 ul de meio RPMI-1640 foram, então, adicionada sobre a camada de HUVEC com sobrenadante de células A549 de cultura adicionado na câmara inferior e foram, em seguida, incubadas sob normóxica ou condições hipóxicas durante 48 h, respectivamente . CIK células que migraram para a câmara inferior foram colhidas e contadas por hemocitometria.

A imunocitoquímica

Após a incubação em hipóxica ou condição de cultura normóxica durante 48 h, HUVEC foram fixadas com etanol a 70% durante 10 min e permeabilizadas por Triton 0,1%-100 durante 5 min. 5% de BSA em PBS foi usado para bloquear a ligação não específica de anticorpos. Anti-ICAM-1 (Abcam, Cambridge, MA) e anti-VCAM-1 de anticorpo (Abcam, Cambridge, MA) foram usados ​​para detectar a expressão da adesão da célula intercelular molécula-1 de adesão de células endoteliais (ICAM-1) e vascular molécula-1 (VCAM-1) por células HUVEC. As imagens foram adquiridas usando Olympus BX-60 microscópio em 400 × ampliação.

Células CIK adesão às células endoteliais in vitro

subconfluentes monocamadas de HUVEC em placas de 6 poços foram pré-incubados em hipóxica ou normóxica condição de cultura durante 48 h. Após pré-incubação, as células CIK (2 × 10

6 células /poço) foram transferidos para as culturas de HUVEC e incubado durante 24 horas sob a mesma condição como a cultura HUVECs. As células separadas foram removidos por duas lavagens cuidadosas utilizando PBS e as células restantes foram coradas com anticorpos de coelho anti-rato CD3 (Abcam, Cambridge, MA) para detectar células CIK. Imagens de células aderentes foram adquiridos usando Olympus BX-60 microscópio em 200 × ampliação.

Tumor hipóxia Medição

O hypoxyprobe ™ -1 kit (Pharmacia Natural International, Inc, Burlington, MA, EUA, constituída por 100 mg de sólido pimonidazole HCl (hypoxyprobe ™ -1) e 1,0 ml de anticorpo monoclonal IgG1 de ratinho (Mab1)) foram utilizados para estudar adicionalmente o efeito de rh-endostatina em hipoxia tumoral. A base desta medição é que é redutivamente pimonidazole activado quando o tecido pO

2 é abaixo de 10 mmHg e as formas intermediário activado estáveis ​​adutos covalentes com grupos tiol em proteínas, peptídeos e aminoácidos. Estes aductos podem ser detectados por meio de imunoquímica quando eles são combinados com o reagente de anticorpo Mab1. Para a detecção de hipóxia do tumor, os ratos sobrecarregados com carcinoma do pulmão A549 receberam 60 mg /kg de peso corporal pimonidazole HCl (hypoxyprobe ™ -1) por via intraperitoneal 4 h antes de serem sacrificados em três momentos diferentes (dias 3, 6, 9). Os tumores foram dissecados e fixados em formalina a 10%, embebidos em parafina e em seguida coradas com uma IgG de ratinho

um anticorpo. Imagens dos cortes foram adquiridos usando Olympus BX-60 microscópio em 100 áreas × ampliação e hipóxicos foram analisados ​​usando digital de software de análise de imagem Imagem J (NIH, Maryland, EUA).

In vivo a identificação de células CIK

Sete dias depois da administração de rh-endostatina, os ratinhos portadores de tumor A549 foram transfundidos com as células marcadas com CFSE CIK (2 × 10

7 células num volume total de 100 ul). solução salina normal foi usado como controlo negativo (n = 4 animais por grupo). Vinte e quatro horas após a transfusão de células CIK, os ratinhos foram sacrificados e as suspensões de células individuais de baço e de tecido de tumor foram preparados a partir de dois grupos. A análise da percentagem de células marcadas com CFSE CIK foi realizada num FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Dez mil gated eventos foram recolhidos e analisados ​​utilizando o software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).

Citometria de Fluxo

Sete dias após o tratamento de rh-endostatina, portador de tumor ratinhos C57BL /6 foram sacrificados. Tumores e os baços foram colhidos e foram preparadas suspensões de células únicas. Os eritrócitos foram removidos após a incubação em tampão de erylysis [155 mmol /L de NH4Cl, 10 mmol /L de KHCO3 e 0.1 mmol /L de EDTA (pH 7,4)] à temperatura ambiente durante 10 min. As células foram coradas durante 30 min a 4 ° C com os seguintes anticorpos monoclonais conjugados com FITC ou PE-conjugado (mAbs): anti-CD11b e Gr-1 para células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs), anti-F4 /80 e MHC /II para macrófagos associados a tumores (TAMs). Todos os anticorpos foram obtidos a partir de (eBioscience, San Diego, CA) utilizando procedimentos padrão. Um total de 100000 células por amostra foram adquiridas e analisadas em um FACS-Calibur e CellQuest software (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).

Intravital Microscopia e Permeabilidade Vascular Ensaio

A549 ratinhos portadores de tumores foram tratados com rh-endostatina (5 mg /kg, sc) durante 7 dias consecutivos, com uma solução salina normal como controlo. Nos dias 3, 6 e 9, os ratinhos foram anestesiados por administração intraperitoneal de pentobarbital sódico (40 mg /kg de peso corporal) e cetamina (20 mg /kg de peso corporal). Resumidamente, os ratinhos foram mantidos quentes utilizando almofadas de aquecimento ao longo do procedimento cirúrgico. Uma camada de pele (12 mm) em torno do tumor foi removido cirurgicamente para criar uma janela de observação. Após a adição de PBS estéril, uma lente de contacto estéril fina foi utilizada para cobrir o local da cirurgia e proporcionar o acesso visual para a rede vascular do tumor (Fig. S3A). Após a cirurgia, o rato foi fixado ao microscópio de fluorescência e observou-se a vasculatura interessado. Após o i.v. injecção de 20 mg /kg de corante azul de Evans (Sigma-Aldrich, EUA), o curso de distribuição de azul de Evans foi registada durante cerca de 10 minutos. O extravasamento de azul de Evans foi analisada no vídeo gravado. Os dados foram confirmados pelo teste de extração Evans Blue após o término do exame de microscopia intravital.

subcutaneamente Imunohistoquímica

camundongos C57BL /6 foram desafiados no flanco direito com células de carcinoma de pulmão de Lewis. Quando os volumes dos tumores foram aproximadamente 100 milímetros

3, os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de acordo com o protocolo de tratamento, e os tratamentos foram iniciados no dia 0. No dia 14, os tumores de todos os grupos experimentais foram removidos e as amostras de tumores foram fixadas em 4% de formalina e embebidos em parafina para estudos imuno-histoquímicos. seções 3 mícrons adjacentes foram feitas e corados com hematoxilina e eosina (H E). Os anticorpos de coelho anti-rato CD3 (Abcam, Cambridge, MA) foram usados ​​para detectar os linfócitos T. Imagens de seções foram adquiridos usando Olympus BX-60 microscópio em 200 × e 400 × ampliação. O número de células CD3

+ linfócitos T foi obtida através da contagem de células coradas para CD3-positivas. Pelo menos dez campos aleatórios foram avaliados para cada secção independentemente por dois observadores. resultados de consenso foram utilizados para os números finais de linfócitos T.

Imunofluorescência

amostras de tumor A549 foram fixadas em 4% de formalina, embebidos em parafina e as secções 3 mícrons adjacentes foram feitas para estudos de imunofluorescência. As lâminas foram desparafinados em xileno e re-hidratadas em etanóis graduadas e lavadas em dH

2O. As lâminas foram fervidos durante 2 minutos em tampão de citrato (Zymed), arrefeceu-se durante 15 minutos e depois lavadas em PBS durante 5 minutos. As amostras foram incubadas durante 1 hora numa solução de bloqueio, e, em seguida, incubadas com os anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite. Rato anticorpos anti-ratinho CD31 (01:50; Abcam, Cambridge, MA) foram utilizados para corar as células endoteliais vasculares, de coelho anti-ratinho alfa actina de músculo liso (α-SMA) anticorpos (1:200; Abcam, Cambridge, MA) foram utilizados para corar pericitos. Os tecidos tumorais foram duplamente coradas com anticorpos anti-CD31 e anticorpos anti-α-SMA. As lâminas foram então lavadas em PBS e incubadas em anticorpos secundários durante 2 h à temperatura ambiente no escuro. Os anticorpos secundários foram cabra anticorpos conjugados com FITC anti-rato e anticorpos TRITC anti-coelho de cabra. As lâminas foram então lavadas em PBS. Imagens dos cortes foram capturados. A densidade microvascular (MVD) foi avaliada como descrito anteriormente por dois observadores independentemente [26]. Em resumo, as secções foram rastreados em ampliações inferiores (100 ×) para identificar os dez áreas contendo o maior número de capilares e vénulas pequenas. Dentro da área selecionada, células endoteliais coradas CD31-positivo (MVD) e CD31 /α-SMA vasos double-coradas foram contados em uma ampliação de × 400.

Contraste Dinâmico avançado Ressonância Magnética (DCE-MRI)

ratinhos portadores de tumor A549 foram tratadas com rh-endostatina (5 mg /kg, sc) durante 7 dias consecutivos, com uma solução salina normal como controlo. Nos dias 3, 6 e 9, os ratos foram anestesiados e DCE-MRI foi realizada. DCE-MRI foi realizada utilizando um conjunto de 3 tesla-corpo MR-digitalizador (Siemens Symphony) em combinação com uma bobina de pequenos animais para a excitação e a recepção do sinal. Morfológica MR-imagiologia foi realizada utilizando uma sequência spin-turbo transversal T2-weighted echo (tempo de repetição, TR 650 ms, tempo de eco, TE 24 ms, campo de visão, FOV 70 × 70 mm2, espessura de 2 mm). T1 mapa da seção tumor foi obtida com 3 ângulos Flip (5 graus, 15 graus e 30 graus), e os valores T1 foram calculados por estimativa curva. Cinética do agente de contraste em tumores foram registados usando um inversão-recuperação sequência pesada em T1 FLASH (TR 5 ms, TE 2 ms, espessura de corte 5 mm, FOV 55 × 70 mm2). Depois de iniciar a medição do DCE-MRI, 0,1 ml (0,1 mmol /kg) do paramagnético agente de contraste de gadolínio de dietileno-triamina ácido penta-acético (Gd-DTPA) (Bayer-Schering Pharma) foi injectada manualmente durante os 5 segundos na veia da cauda , 70 exames dinâmicos foram adquiridos a partir de uma seção. Os dados foram analisados ​​usando o modelo farmacocinético como previamente relatado e imagens paramétricas de K

trans (a constante transferência de volume do agente de contraste) foram produzidos por análise farmacocinética da série DCE-MRI [27].

Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± erro padrão (sE). Diferenças entre quatro grupos foram comparados por ANOVA e LSD foi aplicada para comparações múltiplas meios. As comparações-medição única entre dois grupos foram testados utilizando testes t desemparelhados. análise de correlação de Pearson foi utilizado para testar a correlação entre a hipóxia intra-tumoral e acumulação MDSC. Os valores de p 0,05 foram tomadas como significativas. A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS 16.0 (Chicago, IL, EUA).

Resultados

Morfologia Observation and Cellular Fenótipo da CIK Cells

Na microscopia, as células CIK demonstraram aglomerado de crescimento semelhante. Massas de células CIK gradualmente se multiplicaram e se tornaram maiores após 4 dias de incubação. Existem dois principais subpopulações de células CIK, um expressam tanto moléculas de CD56 (CD3

+ CD56

+) CD3 e e outra apresentando uma CD3

+ CD56

– fenótipo. Após incubação durante 7, 14 e 21 dias, os fenótipos de células CIK foram detectados. As percentagens de CD3

+ células CD56 + CIK

foram 8,93%, 23,66% e 17,17% no dia 7, 14 e 21, respectivamente (Fig. S2).

Combinação de rh-endostatina as células com adoptiva CIK transferem substancialmente inibe o crescimento de carcinoma do pulmão in vivo

Para determinar se a adição de Rh-endostatina tem qualquer efeito sinérgico sobre a eficácia anti-tumor de células CIK, três modelos de tumor representativos foram estabelecidos. Em A549 modelo de carcinoma de pulmão, descobrimos que rh-endostatina crescimento do tumor pouco limitada em comparação com o controle NS, mas não alcançou significância estatística (929,46 ± 471,70 vs 1251,8 ± 531,75, p = 0,324). CIK células terapia adoptiva sozinho não tinha actividade anti-tumoral em comparação com o controle NS (1192,1 ± 621,68 vs. 1251,8 ± 531,75, p = 0,852). Pelo contrário, significativa (p 0,05) a actividade anti-tumor foi visto após a terapia de combinação em comparação com a monoterapia ou o controlo NS (Fig. 1A). E

A = 1,35, E

B = 1,05, E

AB = 2.08 e q ​​= 2,71, o que confirma a avaliação de sinergismo. Resultados similares foram observados em modelos de carcinoma de pulmão de Lewis e SPC-A1 estabelecidos. Na SPC-A1 modelo de cancro do pulmão, em comparação com o controle NS, rh-endostatina (1152,8 ± 181,4 vs 1284,7 ± 229,2, p = 0,527) e CIK (1204,1 ± 536,2 vs 1284,7 ± 229,2, p = 0,698) monoterapia não mostraram significativa efeito anti-tumoral. No entanto, o efeito anti-tumoral significativa foi alcançada em terapia de combinação (p 0,05) (Figura 1B.). No carcinoma do pulmão de Lewis, nem rh-endostatina (3394,7 ± 668,4 vs 3866,5 ± 490,62, p = 0,176), nem CIK terapia de células (3429,6 ± 579,12 vs 3866,5 ± 490,62, p = 0,208) inibição óbvio sozinho exibiu no crescimento do tumor em comparação com o NS ao controle. No entanto, o efeito anti-tumor significativo sinergético foi mostrado quando rh-endostatina foi adicionada à terapia CIK (2037,0 ± 294,6 3866,5 ± 490,62 vs, p = 0,000) (Fig. 1C). As experiências in vivo foram repetidos duas vezes. E resultados semelhantes foram obtidos em três modelos diferentes de carcinoma do pulmão de tudo o que sugeria que os efeitos antitumorais sinérgicos foram obtidos através da combinação de terapia anti-angiogénico rh-endostatina e as células CIK terapia adoptiva.

ratinhos nus BALB /c foram injectados s.c. com células de cancro do pulmão A549 e quando o volume do tumor atingiu 100 mm

3, os ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos e receberam respectivos protocolos de acordo com o esquema de tratamento. Carcinoma do pulmão de Lewis xenoenxertos SPC-A1 e foram estabelecidas e dado tratamentos semelhantes. A, efeito anti-tumoral sinergético foi mostrado quando rh-endostatina foi combinada com terapia adoptiva CIK na supressão do crescimento do tumor A549 (p 0,05). Rh-endostatina ou terapia CIK sozinho não suprimiram significativamente o crescimento do tumor. B, RH-endostatina exibiu um efeito anti-tumor significativo, quando administrado em combinação com células CIK na inibição de carcinoma do pulmão de SPC-A1 (p 0,05). C, efeito anti-tumoral sinergético foi mostrado quando rh-endostatina foi combinada com terapia adoptiva CIK em suprimir o crescimento de carcinoma do pulmão de Lewis (p 0,05). Pontos, através de volumes de tumor de ratos por grupo; Bares, SE. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.

Rh-endostatina Diminui microvascular Densidade e promove Tumor Vessel Normalização

Em nosso estudo anterior, encontramos a cobertura de colágeno que a densidade microvascular foi reduzida e foi aumentada em RH-endostatina no carcinoma de Lewis do pulmão de murino rolamento ratinhos C57BL /6 [19]. No presente estudo, a densidade microvascular (MVD) foi avaliado em ratinhos portadores de tumor A549. No dia 3, 6 e 9, os ratinhos de cada grupo foram sacrificados e as amostras de tumor foram preparadas para coloração por imunofluorescência. Colunas, quer dizer; Colunas, quer dizer; Colunas, quer dizer; Colunas, quer dizer; Colunas, quer dizer;