Abstract

Fundo

opções de tratamento atuais para castration- e câncer de próstata resistente ao tratamento são limitados e novas abordagens são desesperadamente necessários. Os nossos resultados recentes de uma tela de sensibilidade biologia química sistemática cobrindo drogas mais conhecidas e moléculas de droga do tipo indicado que o aldeído desidrogenase disulfiram inibidor é um dos inibidores específicos de cancro mais potentes do crescimento de células de cancro da próstata, incluindo TMPRSS2-ERG cancros positivos de fusão. No entanto, os resultados revelaram que disulfiram sozinho não bloqueia o crescimento do tumor

in vivo

nem induz apoptose

in vitro

, indicando que as abordagens combinatórias podem ser obrigados a aumentar os efeitos anti-neoplásicos.

métodos e resultados

neste estudo, utilizamos uma tela de sensibilidade às drogas biologia química para explorar disulfiram detalhes mecanicistas e identificar compostos potencializando o efeito do dissulfiram em células de câncer de próstata positiva de fusão TMPRSS2-ERG. No total, 3357 compostos incluindo agentes quimioterapêuticos correntes, bem como compostos moleculares pequenos fármacos como foram rastreados por si só e em combinação com o disulfiram. Curiosamente, os resultados indicaram que os compostos androgénicos e antioxidantes antagonizada efeito dissulfiram enquanto que os inibidores de tirosina cinase do receptor, proteassoma, topoisomerase II, glucosilceramida sintase ou ciclo celular foram de entre os compostos sensibilização de células de cancro da próstata para o disulfiram. A combinação de dissulfiram e um agente anti-angiogénico sunitinib foi estudado em mais detalhe, uma vez que ambos já estejam em utilização clínica em seres humanos. O dissulfiram-sunitinib combinação induziu apoptose reduzida e a expressão da proteína do receptor de androgénio mais do que qualquer dos compostos sozinhos. Além disso, a exposição combinatória reduzida características metastáticas, tais como migração celular e invasão celular 3D, bem como diferenciação epitelial induzida mostrados como elevada expressão da caderina-E.

Conclusões

Em conjunto, nossos resultados propor romance combinatória abordagens para inibir o crescimento de células de cancro da próstata. combinação Disulfiram-sunitinib foi identificado como uma das abordagens sinérgicos potentes. Desde sunitinib sozinho tem sido relatada a falta de eficácia em ensaios clínicos de cancro da próstata, os nossos resultados proporcionam uma base racional para nova abordagem combinatória para alvejar o cancro da próstata mais eficientemente

citação:. Ketola K, Kallioniemi O, Iljin K (2012) Chemical Biology droga sensibilidade da tela Identifica sunitinib como sinérgica Agent com Disulfiram em células cancerosas da próstata. PLoS ONE 7 (12): e51470. doi: 10.1371 /journal.pone.0051470

editor: Jun Liu, Johns Hopkins School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de maio de 2012; Aceito: 06 de novembro de 2012; Publicação: 12 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Ketola et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento foi fornecida pelo projecto EU-PRIMA (contract # LSHC-CT-204-504587), a organizações de câncer da Finlândia, Sigrid Juselius Foundation e da Academia da Finlândia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o câncer mais frequente ea segunda principal causa de mortes por câncer em população masculina no mundo ocidental [1]. Uma vez que a maioria dos doentes com cancro da próstata, eventualmente, tornar-se resistentes a fármacos actualmente existentes, tais como anti-androgénios e mais tarde também a agentes citotóxicos, são necessários novos medicamentos e abordagens combinatórias. Temos recentemente realizada uma tela de química composto biologia para testar sistematicamente as sensibilidades de 4910 drogas conhecidas e pequenas moléculas da droga, como em células não-malignas e malignas do câncer de próstata [2]. Aldeído desidrogenase (ALDH) disulfiram inibidor estava entre os quatro câncer inibidores seletivos identificados bloqueando o crescimento de células VCaP positivos cultivadas fusão TMPRSS2-ERG em concentração nanomolar, bem como a redução do crescimento de xenotransplante VCaP

in vivo

[2]. Recentemente, o potencial inibidor do crescimento do dissulfiram no cancro da próstata foi confirmado em uma tela composto de alto rendimento independente

in vitro Comprar e xenoenxerto estudos

in vivo

[3], [4].

Disulfiram é um inibidor de ALDH que tem sido longo prazo usado como um elemento de dissuasão álcool nas clínicas. Para além do cancro da próstata, o dissulfiram, também tem sido demonstrado que possuem efeito anti-cancro na mama, mieloma, leucemia, cancro do pulmão, adenocarcinoma do colo do útero, melanoma, neuroblastoma e cancro colo-rectal [5] – [11]. Actualmente, o disulfiram é na Fase I de ensaios clínicos em melanoma metastático, em hormona de cancros refractários com metástases no pulmão e fígado (www.clinicaltrials.gov, identificadores NCT00256230 e NCT00742911), bem como no cancro da próstata (Identificador: NCT01118741). Em células de cancro da próstata em cultura, dissulfiram induz o stress oxidativo, reduz a actividade de DNA metiltransferase (DNMT) e de ALDH, bem como inibe a replicação do ADN [2], [4], [12]. No cancro da mama, dissulfiram e cobre co-exposição inibe a actividade de NF-kB, aumenta as espécies de oxigénio reactivas e o número de células estaminais do cancro (CSC) [13]. Além disso, a inibição da actividade de ALDH tem sido sugerido como um potencial para reduzir a média de células estaminais do cancro e para vencer a resistência de drogas [14]. Nossos resultados anteriores indicaram que, embora disulfiram reduzida VCaP crescimento xenoenxerto de células de aproximadamente 40%, não foi capaz de bloqueá-lo [2]. Resultados semelhantes foram obtidos em metastáticas no osso humano xenoenxertos de LNCaP C4-2B [4]. Além disso, a exposição dissulfiram por si só não foi suficiente para induzir a apoptose em células de cancro da próstata [2]. Assim, no presente estudo, foi realizada uma tela sensibilidade combinatória em células de cancro da próstata ERG positivo para explorar mecanismo de acção dissulfiram em mais detalhe. Além disso, o objetivo foi identificar potenciais agentes sinergia com dissulfiram em células de câncer de próstata. No total, 3357 compostos incluindo agentes quimioterapêuticos correntes e compostos moleculares pequenos fármacos como foram estudados sozinho e em combinação com o disulfiram. As alterações moleculares e fenotípicas foram exploradas com um dos sensibilizador disulfiram mais potente, sunitinib.

Materiais e Métodos

Células

O

TMPRSS2-ERG

fusão do gene e uma linha de células de carcinoma da próstata positivo AR VCaP foi recebida de Drs. Adrie van Bokhoven (Universidade do Colorado Saúde Sciences Center, Denver, Colorado) e Kenneth Pienta (Universidade de Michigan, Michigan) e foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle [15]. carcinoma da próstata PC-3 células foram adquiridos da American Type Culture Collection (LGC Promochem AB, Borås, Suécia) e cultivadas de acordo com as instruções do fornecedor. resultados

Loess normalizada CellTiter-Glo com 3357 compostos selecionados na ausência ( eixo dos y) e presença (eixo X) de dissulfiram (CE

50 90 nM) em células de cancro da próstata VCaP. Cada ponto representa resultado obtido com um composto. Os pontos de dados que se qualificam como sensibilizante disulfiram (quadrados abaixo da linha de tendência) e resgate (triângulos acima da linha de tendência) compostos são indicados. O resultado com sunitinib é indicado por uma seta.

Compostos

O dissulfiram foi adquirido à Fluka (Munique, Alemanha) e diluídos em DMSO. Sunitinib foi comprado de LC Laboratories (Woburn, EUA) e diluído em DMSO.

de alta capacidade: Composto sensibilidade da tela

A tela de sensibilidade composto de alto rendimento com a biblioteca de compostos 3357 sozinho e em combinação com o disulfiram foi realizada em células da CV. A biblioteca incluída quimioterápicos atuais e compostos moleculares pequenos de bibliotecas de compostos comerciais Lopac (1.280 existentes drogas e outros compostos Food and Drug Administration-aprovado com as estruturas farmacologicamente relevantes; 1 e 0,1 mmol /L), Microsource Spectrum (2.000 compostos, incluindo a maior parte da conhecida drogas e outros compostos bioactivos e produtos naturais; 1 e 0,1 nmol /L), e uma biblioteca de PA p (77 compostos experimentais, 10, 1, e 0,1 mmol /L). Na tela, foi usada CE

50 valor do disulfiram (90 nM). A viabilidade das células foi determinado após incubação de 3-dias usando um CellTiter-Glo (CTG) ensaio de viabilidade celular fluorescente (Promega, Inc.). Os resultados de viabilidade celular foram normalizados utilizando um método loess como previamente descrito [2]. Os compostos que se classificaram como bate viabilidade celular inibida em pelo menos três desvios-padrão da mediana dos controles DMSO.

Viabilidade celular e apoptose Assays

ensaios

A viabilidade celular e apoptose foram realizados em placas de 384 poços (Falcon). 2.000 células por poço foram plaqueadas em 35 ul de seus respectivos meios de crescimento e deixou-se ligar durante a noite. diluições dos compostos foram adicionados às células em 15 jil e incubou-se durante 48 h. A viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de viabilidade celular CTG (Promega, Inc.). A indução de caspase-3 e 7 com actividades foi detectado homogénea Apo-ONE ensaio (Promega, Madison, WI). ensaios de viabilidade celular e apoptose foram, em seguida, realizada de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, no ensaio de viabilidade de células, 25 ul de reagente CTG activado foi adicionado a cada poço, a placa foi incubada durante 30 min a RT /150 rpm e o sinal de luminescência (700 nm) foi quantificada utilizando Envision Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer, Massachusetts, MA). Para o ensaio de apoptose, 25 ul de meio foi retirado de cada poço e 25 ul de reagente de ApoONE foi adicionado em cada poço. A placa foi incubada durante 2 horas à temperatura ambiente e o sinal fluorimétrico (excitação de FITC 499 nm, emissão a 521 nm com FITC) foi quantificada utilizando Envision Multilabel Plate Reader. A luminescência médio ou sinal fluorimétrico dos poços tratados com composto de seis replicados foram divididos pelo sinal de controlo do veículo média de seis poços tratados DMSO para determinar mudanças de dobragem.

viabilidade celular relativa resultados em A) e B VCaP) PC- células cancerosas 3 próstata, bem como em C não maligno) de células RWPE-1 e D) EP156T. Os asteriscos indicam significância estatística: *, P 0,05; **, P 0,01; e ***, P . 0.005

Análises Estatísticas

Os critérios de sucesso na tela composto (pontuação inferior a -3 DP da mediana) correspondem a um valor de P 0,01. As análises estatísticas de todos os resultados foram feitas usando o teste t de Student. Estes resultados são apresentados como a média ± DP. Os seguintes valores de P foram usados ​​para demonstrar diferenças estatisticamente significativas: *, P 0,05; **, P 0,01; e ***, P . 0.005

Determinação da Combinatória efeitos de drogas

A natureza da interação e do grau de sinergia entre disulfiram e sunitinib foram analisados ​​utilizando o método de índice de combinação [16]. A dependência da concentração dos efeitos antiproliferativos foi determinada para ambos os compostos, quer sozinhos ou em combinação. Fracção afectada (Fa) foi definida como a fracção de células afectadas pela concentração dada de compostos, isoladamente ou em combinação. Fa = 0 foi determinado com base no controle de DMSO e 1 = resposta Fa em estaurosporina (1 M) (sem células viáveis ​​esquerda). Os dados foram analisados ​​com software CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido), e o índice de combinação (Cl) foi calculada a partir das parcelas efeito mediano de acordo com a equação CI = (D) 1 /(DX) 1+ (D) 2 /( DX) 2, onde (DX) 1 e (DX) 2 são as concentrações de compostos de D1 e D2 necessária para produzir um dado nível de efeito anti-proliferativo, quando utilizado por si só, enquanto (D) 1 e (D) 2 são as concentrações que produzem o mesmo efeito quando usados ​​em combinação. Um índice de combinação de 0,9-1,1 indica aditivo interação, valores abaixo de 0,9 indicam sinergismo, e valores acima de 1,1 indicam antagonismo.

A) morfologia celular em resposta a disulfiram (1 M) e sunitinib (5 mm) exposições sozinho e em combinação. B) Apresentação do índice de combinação (IC) e fracção de células afectadas (Fa) por exposições compostos em diferentes concentrações (500 nM, 1 pM, 5 pM e 10 pM) em células de cancro da próstata VCaP. valores de CI para cada concentração de 500 uM:: 0,92, 1 uM: 0,19, 5 ^ M: 0,21, 10 uM: 0,40. C) Caspase 3/7 actividades em resposta às exposições compostos. Os asteriscos indicam significância estatística:. ***, P 0,005

Extração de RNA e PCR quantitativa da Transcriptase Reversa

O ARN total foi extraído a partir de células cultivadas utilizando RNeasy (Qiagen) de acordo com a o protocolo do fabricante. A transcrição reversa utilizando 500 ng de ARN total foi realizada utilizando o kit de síntese de ADNc da Applied Biosystems. TaqMan sondas e iniciadores de expressão do gene a partir da sonda biblioteca universal (Roche Diagnostics, Espoo, Finlândia) foram utilizados para estudar o receptor de androgénio (AR), antigénio específico da próstata (PSA), do ERG, myc e a expressão de ARNm β-actina. As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela S1. PCR em tempo real quantitativo foi realizado utilizando ABI Prism 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA). A quantificação foi realizada utilizando o

método ΔΔCT com o gerente de 1,2 software RQ (Applied Biosystems). β-actina foi utilizado como um controle endógeno. expressão média das amostras para controlo de DMSO exposta foi considerado para o cálculo das mudanças de dobragem. Dois a quatro amostras idênticas foram estudados para a quantificação da expressão de mRNA.

Western Blot Análise e subcelular Proteome Extração

Para a extração de proteínas e análise Western blot, as células VCaP foram semeadas a 70% de confluência e à esquerda para prender durante a noite antes dos tratamentos. Os lisados ​​celulares totais foram preparados usando tampão de lise (Tris 62,5 mM, SDS a 1%, 5%, β-mercaptoetanol, 10% de glicerol e azul de bromofenol). Três amostras replicativos foram estudados para a quantificação da expressão da proteína. Foram utilizados anticorpos específicos que reconhecem AR (1:1000 diluição, monoclonais rato, LabVision, Fremont, CA) ou PSA (1:1000, policlonais de coelho, DakoCytomation, Dinamarca). β-actina (1:4000, monoclonal de murganho, Sigma) foi utilizado como um controlo de carga. Os sinais foram detectados com 1:4000 diluições de anticorpos secundários conjugados com HRP apropriados (todos da Invitrogen Molecular Probes, Carlsbad, CA), seguido de visualização com reagente de quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido). Os sinais obtidos foram analisados ​​com o software densitometricamente GeneTools (SynGene, sinópticos Ltd, Cambridge, Reino Unido).

A expressão de A) AR, B) de PSA, C) ERG, D) ARNm MYC em resposta a dissulfiram ( DSF) e sunitinib (Su) exposições isoladamente e em combinação. E) a expressão da proteína AR e PSA em resposta às exposições compostos isoladamente e em combinação. F) Quantificação da expressão da proteína AR em resposta a 6 e 24 h exposições compostos. Os asteriscos indicam significância estatística: *, P 0,05; **, P 0,01; e ***, P . 0.005

E-caderina (vermelho) e F-actina expressões (amarelo) em resposta aos tratamentos compostos. DNA foi corado com DAPI (azul).

Imunofluorescência

Imunofluorescência coloração de células VCaP foi realizada como descrito anteriormente [12]. As imagens foram tiradas com 63 × ampliação usando um Zeiss Axiovert 200 M microscópio de fluorescência (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha).

Cicatrização Ensaio

O efeito do disulfiram (1 M) e sunitinib (5 ^ M) sozinho e em combinação sobre a migração de células de cancro da próstata foi estudada utilizando um ensaio de cicatrização da ferida. Células PC-3 foram plaqueadas em placas de 96 poços (Essen ImageLock, Essen Instruments, Birmingham, Reino Unido) e uma ferida foi riscado com a ferida coçador (Essen Instruments). Compostos e controlos apropriados foram adicionados imediatamente após a ferida arranhões e confluência ferida foi monitorada com o Sistema Incucyte Vivo-Cell Imaging and software (Essen Instruments). fechamento da ferida foi medida a cada hora, durante 24 horas, comparando a densidade ferida relativa média de três réplicas biológicas em cada experimento.

As células foram fotografadas automaticamente uma vez a cada hora após o ferimento coçar. efeito fechamento da ferida foi calculado como confluência de feridas em resposta 6- 12-, e 24 h a exposição dos compostos A) a cicatrização de feridas em resposta à exposição compostos durante 24 horas. área preta representa os bordos da ferida no início do ensaio. B) Quantificação das células entrarem na área da ferida. Os asteriscos indicam significância estatística: *, P 0,05; **, P 0,01; e ***, P . 0.005

A) morfologia celular no ensaio esferóide 3D em resposta às exposições compostos. B) A área de células nas imagens Incucyte (% da área total) em resposta aos tratamentos compostos. Os asteriscos indicam a significância estatística:. *, P 0,05

3D Ensaio

As células foram cultivadas em 3D no Matrigel em não revestidos angiogênese u-lâminas (Ibidi GmbH, Alemanha). Os poços inferiores foram cheias com 10 ml de Matrigel (50%) em meio de cultura e incubadas durante 30 minutos em 37 ° C. As células (1000 células /poço) foram plaqueadas e em seguida, deixar a aderir durante 1-2 horas em 37 ° C. Adicionou-se a segunda camada de Matrigel em meio de cultura (25%) e as placas foram incubadas em 37 ° C. O dissulfiram (1 uM), sunitinib (5 uM) ou dissulfiram sunitinib combinação foi adicionado após 4 dias de incubação e manteve-se até sete dias. Esferóides foram monitorados em tempo real por meio de imagens ao vivo de células (Incucyte, Essen Instruments; 10 × objetivo), a aquisição de imagem 1 /h. A área de estruturas 3D nas imagens foi comparada com a área total de imagem (em percentagem) para quantificar os potenciais efeitos dos compostos sobre o crescimento celular.

Resultados

composto Chemical Biology sensibilidade da tela Identifica sinérgica agentes com Disulfiram

biologia química abordagem tela composto foi utilizado para estudar o mecanismo de disulfiram reduziu a viabilidade celular em células de câncer de próstata e para explorar possíveis interacções sinérgicas de disulfiram e compostos selecionados. Biblioteca de 3357 compostos, incluindo a maior parte dos medicamentos conhecidos e compostos moleculares pequenos droga-like foi exibido sozinho e em combinação com disulfiram em células de câncer de próstata VCaP. Os resultados de viabilidade celular na ausência (controlo de DMSO) ou na presença de dissulfiram (CE

50, 90 nM) foram comparados. Como esperado, vários compostos inibiram o crescimento celular VCaP (Fig. 1). No entanto, apenas 15 compostos mostraram um efeito combinação com dissulfiram. No total, seis compostos sensibilizados células VCaP a dissulfiram: treo-1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol cloridrato, bortezomib, cloridrato de CGP-74514A, cloridrato de epirrubicina, de forbol 12-miristato 13-acetato e de sunitinib ( Tabela 1). Em contraste, 9 Compostos resgatado dissulfiram induzida efeito antiproliferativo (Tabela 2). Curiosamente, estes compostos incluídos compostos androgénicos 4-androsteno-3,17-diona, 5-alf a-androstano-3-alfa, 17-beta-diol e androsterona, bem como a astaxantina antioxidante. Assim, os resultados indicam que a proliferação celular dissulfiram reduzida pode ser antagonizada com a activação de androgénio ou anti-oxidantes. Além disso, PKC activador de forbol 12-miristato 13-acetato foi de entre drogas sensibilizantes efeito dissulfiram e PKC analógico inactivador de dequalínio, C-14 ligante, estava entre drogas resgatando efeito dissulfiram, indicando que a PKC pode desempenhar um papel na resposta do disulfiram. Além disso, o efeito de dissulfiram pode ser potenciado através da inibição da tirosina-quinases receptoras, proteassoma, da topoisomerase II, da sintase de glicosilceramida ou do ciclo celular (Tabela 1) enquanto que a inibição do receptor do factor de crescimento epidérmico não parece ser uma estratégia potente para aumentar o efeito de dissulfiram (Tabela 2).

sunitinib e Disulfiram co-tratamento Mostrar sinergismo

Curiosamente, sunitinib, um agente anti-angiogénico, potenciou o efeito inibidor do crescimento disulfiram induzido. Sunitinib inibe a actividade das várias cinases de tirosina, tais como o VEGFR-1, -2 e -3, PDGFR-α e -β, c-Kit, Ret e Flt-3 [17]. Tem sido demonstrado que possuem actividades anti-neoplásicas em uma variedade de doenças malignas como o cancro hepatocelular, tumores neuroendócrinos pancreáticos, e cancro do pulmão de células não-pequenas. Sunitinib está licenciado para carcinoma metastático de células renais e tumores gastrointestinais [18] – [20]. No cancro da próstata, sunitinib reduz significativamente o crescimento do cancro da próstata resistente à castração, tanto em ambientes clínicos e pré-clínicos [21], [22]. No entanto, um recente estudo de fase III de sunitinib no cancro da próstata falhou devido a falta de eficácia no cancro da próstata resistente à castração (identificador: NCT00676650). Desde sunitinib já foi estudada em ensaios clínicos em doentes com cancro da próstata, combinação sunitinib-disulfiram foi selecionado para mais

in vitro

estudos.

Para validar o efeito anti-proliferativo combinatória de sunitinib na próstata células de cancro, o efeito de dissulfiram e sunitinib sozinho e em combinação foi estudada em VCaP e células PC-3 de cancro da próstata. Os resultados indicaram que o dissulfiram e co-exposição sunitinib reduziu a viabilidade celular VCaP mais do que um dos compostos por si só (Fig. 2A). Em células PC-3, o efeito anti-proliferativo foi observado apenas em concentrações mais elevadas em resposta ao sunitinib ou dissulfiram-sunitinib co-exposição (Fig. 2B). Para identificar se o sinergismo em células VCaP é causado simplesmente devido ao aumento da citotoxicidade, o efeito de dissulfiram, sunitinib ou dissulfiram-sunitinib co-exposição foi estudada em RWPE-1 e da próstata EP156T células epiteliais não-malignas. Os resultados mostraram que a viabilidade celular foi reduzida apenas com mais elevada (10 mM) concentração em RWPE-1 e células EP156T (Fig. 2C e D), indicando que o aumento da toxicidade celular em geral não explica a resposta combinatória em células VCaP.

Para comparar os efeitos do disulfiram (1 M) e sunitinib (5 M) isoladamente e em combinação na morfologia celular VCaP, foi realizada análise de células vivas Incucyte. As células foram expostas aos compostos durante 48 horas. alterações morfológicas claras foram observadas em resposta a todas as posições do composto (Fig. 3a). Em particular, sunitinib causada células se fixem umas às outras, uma vez não há células individuais foram observados em células de exposição de sunitinib. Em resposta a co-tratamento com sunitinib dissulfiram, as células também foram ligados uns com os outros, mas ainda não foi claramente menos células viáveis ​​esquerda (Fig. 3a). índice de combinação (IC) foi determinada a diferentes concentrações de fármaco (500 nM, 1 pM, 5 pM e 10 uM) com base nos resultados de viabilidade celular em células VCaP. Os resultados indicaram que o dissulfiram e sunitinib mostrou sinergismo em todas as concentrações testadas (CI 1) (Fig. 3B). Os valores de CI mais baixas foram observadas em concentrações de 1 jiM e 5