Sumário

A maioria do genoma humano é transcrito e gera RNAs não-codificantes (ncRNAs) que falham para codificar informações de proteína. RNAs não-codificantes longos (lncRNAs) estão emergindo como uma nova classe de ncRNAs, mas o nosso conhecimento sobre esses ncRNAs é limitado. Anteriormente, nosso laboratório identificou que um 1 lncRNA, câncer urotelial associado (UCA1), desempenhou um papel importante no cancro da bexiga. Apesar do recente interesse em UCA1 como marcador de diagnóstico para câncer de bexiga, pouco se sabe sobre a sua regulação da transcrição. Para elucidar a regulação da expressão gênica UCA1, caracterizamos o promotor do gene UCA1 humano. Um fragmento de 2,0 kb da sua região flanqueadora 5 ‘foi clonada num vector repórter de luciferase. A deleção e análise de mutações sugerem que um sítio de ligação Ets-2 era crítico para a actividade do promotor do gene UCA1. Uma análise mais aprofundada deste site por deslocamento gel, cromatina precipitação imunológica (CHIP), e as experiências de co-transfecção mostrou que fator de transcrição Ets-2 diretamente ligado à região promotora UCA1 e estimulou a atividade do promotor UCA1 em células de cancro da bexiga. Tendo em conta a função de anti-apoptose da ETS-2, os nossos dados sugerem que Ets-2 regula processo de apoptose através da regulação da expressão de UCA1, além disso UCA1 podem estar envolvidos na activação de Akt sinalização por Ets-2 em células cancerosas da bexiga .

Citation: Wu W, Zhang S, Li X, Xue M, Cao S, Chen W (2013) Ets-2 Regula celular apoptose através da Akt, através do Regulamento de câncer urotelial Associated 1, um longo RNA não codificante, em células de câncer de bexiga. PLoS ONE 8 (9): e73920. doi: 10.1371 /journal.pone.0073920

editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de março de 2013; Aceito: 24 de julho de 2013; Publicação: 12 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela bolsa da Fundação de Ciência Natural da China (Grant No. 81.072.104). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

genomas eucarióticos não são os bem-ordem simples substratos de transcrição do gene, que uma vez que se acreditava. Sabemos agora los para transcrever um largo espectro de moléculas de RNA, que varia a partir de ARNm de comprimento de codificação de proteínas de transcritos não codificantes curtos, que se sobrepõem frequentemente ou são intercalados em qualquer das cadeias [1]. RNAs não-codificantes longas (lncRNAs) estão a emergir como uma nova classe de RNAs não-codificantes contendo mais do que 200 nucleótidos, mas o nosso conhecimento destes lncRNAs é limitada. LncRNAs são os que se assemelham transcritos mRNAs codificadores de proteínas em que são seladas, splicing e ARN poliadenilado transcrições polimerase II. Eles diferem de ARNm apenas na sua falta de grelhas de leitura abertas que codificam proteínas (ORF) [2].

Em contraste com a diversidade de espécies de ARN, apenas um pequeno número de lncRNAs foram identificados como apresentando experimentalmente derivado funções. Além disso, a desregulação da lncRNA tem sido demonstrado em vários tipos de cancro [3], [4], tais como malat-1 no cancro do pulmão [5], HULC no carcinoma hepatocelular [6], e HOTAIR no cancro da mama [7] , indicando que lncRNAs pode desempenhar um papel fundamental na tumorigénese ou a progressão do tumor.

Anteriormente, estabelecemos BLZ-211 e BLS-211 células que são um par de carcinoma de células transicionais da bexiga (CTP) linhas de células clonadas separadamente a mesma amostra do doente, mas com diferentes características biológicas [8], [9], [10]. Então Nós relatamos um romance expressa tag sequência (EST) (Genbank número de acesso DR159656) isolado a partir destas duas linhas celulares usando hibridização supressão subtrativa (SSH) técnica [11]. Com base nesta EST, clonado e identificado que um cancro urotelial ncRNA chamado associado 1 (UCA1) (número de acesso Genbank EU334869) [12]. UCA1 pertence à lncRNAs devido à falta de uma forte sequência de consenso de Kozak para iniciação da tradução em qualquer um dos codões ATG em múltiplos ORFs pequenas [12]. Muitos estudos sugerem que UCA1 pode actuar como um marcador molecular de cancro da bexiga devido à sua excelente especificidade e sensibilidade [13], [14]. Um estudo anterior em nosso laboratório também implicou que a expressão UCA1 elevada pode influenciar o crescimento de células de câncer de bexiga e promover a invasão das células cancerosas da bexiga [12], sugerindo que seria um novo gene alvo terapêutico de cancro da bexiga. Apesar deste interesse, pouco se sabe sobre o

cis

elementos -regulatory diretamente envolvidos na modulação da transcrição do gene UCA1 no cancro da bexiga. Além disso, o estudo de nosso laboratório mostraram que existem três variantes de splicing do gene UCA1 existente em células de cancro da bexiga [12], [15]. A expressão elevada de UCA1 no cancro da bexiga e da existência de splicing variantes fortemente indicam que a regulação da transcrição do gene UCA1 é rigidamente controlado. O UCA1

cis

regulamento pode moldar redes de expressão gênica complexos, que em última análise, conduzir processos biológicos, tais como apoptose celular.

Neste estudo, identificamos o promotor do gene UCA1 humana pela primeira vez e investigou a regulação do promotor UCA1 pelo factor de transcrição Ets-2. Ets-2 pode influenciar a apoptose de células de cancro da bexiga através da regulação da expressão de UCA1. Nós também descobrimos lncRNA UCA1 pode estar envolvida na activação da via de Akt. Esta pesquisa irá fornecer uma visão sobre o mecanismo de regulação da expressão UCA1 em estudos futuros.

Materiais e Métodos

Promotor Previsão

Anteriormente, o comprimento total do cDNA UCA1 e sua local de início da transcrição (TSS) foram identificados usando a tecnologia RACE do SMART [12]. Neste estudo, o programa megablast (NCBI) foi usada para mapear o gene UCA1 e as suas sequências flanqueadoras da região 5 ‘de DNA e foram transferidos a partir do GenBank (NC_000019.9). O TSS do gene UCA1 foi marcado como um. Para prever os fatores promotores e de transcrição putativo, a seguinte algum software on-line foram utilizados. O promotor e TSS prever ferramentas incluem o programa FPROM de software Softberry (https://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fprom group=programs subgroup=promoter) e um programa de PromoterInspector de Genomatix (http: //www.genomatix.de/online_help/help_gems/PromoterInspector_help.html) [16]. O programa MatInspector de Genomatix (https://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html) [17], [18] foi utilizado para a previsão fator de transcrição.

plasmídeo Construções

para gerar o plasmídeo pGL3-UCA1-2000, um fragmento de DNA contendo o

cis e região do gene UCA1 -1.800-200 pb foi amplificado por PCR (polimerase de ADN PrimeSTAR® SH, TaKaRa, Dalian ). O produto de PCR foi então excisado a partir do gel de agarose e isolado usando o kit de ADN do gel de agarose do fragmento de recuperação (Takara, Dalian). O fragmento de ADN purificado foi então inserido no vector de expressão de luciferase pGL3-Basic (Promega, EUA) através de

Kpn I e

Nhe I

locais. Outros fragmentos truncados foram feitas da maneira acima descrita. Os conjuntos de iniciadores utilizados para esta série de produtos foram fornecidos na Tabela 1. Os fragmentos de ADN amplificados foram inseridos no vector pGL3-basic através do mesmo endonucleases de restrição locais. Todas as construções de ADN foram sequenciadas.

dirigida ao local A mutagénese

mutação por substituição de ETS-2-sítios de ligação foi gerado por mutagénese dirigida ao local baseada em PCR (Byotime, China) . O vector pGL3-UCA1-1200 foi utilizado como o molde de ADN, e o local de ligação núcleo Ets-2 (GGGAAG) foi substituída a um

local de restrição Hind III

(AAGCTT) (Tabela 1). O vector mutante foi nomeado como pGL3-UCA1-1200-Mut. As mutações foram confirmadas por digestão com enzimas de restrição e sequenciação.

Cultura celular, transfecção transiente

carcinoma de células de transição da bexiga humano (CTP) linhas celulares BLZ-211 e BLS-211 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, EUA). linhas celulares BLZ-211 e BLS-211 foram estabelecidas por nosso laboratório em 1994. O tecido de cancro da bexiga era de espécimes cirúrgicos de um homem de 55 anos com o diagnóstico de grau II multifocal carcinoma de células transicionais papilar (TCC). Todo o procedimento foi administrado unber a aprovação do comitê de ética da Primeira Affiliated Hospital, Faculdade de Medicina da Universidade de Xi’an Jiaotong [8]. Células com mais de 80% de confluência foram usadas para transfecção.

BLZ-211 foram transfectadas com FuGENE®HD Transfection Reagent (Roche, EUA) na placa de 24 poços. Cada poço continha 2 x 10

5 células, 0,5 ug de pGL3-UCA1 série do vetor, 0,02 ug do vector de controlo interno de pRL-TK (Promega, EUA), 1 ul FuGENE®HD, e 500 ul de RPMI 1640 sem soro ou antibióticos. pGL3-basic (Promega, EUA) vector foi transfectado como controlo. Para siARN transfecção, as células foram transfectadas com X-tremeGENE siARN Transfection Reagent (Roche, EUA) na placa de 6 poços. Ambos Ets-2 siRNA e mexidos ARNsi de controlo são produtos comerciais (Santa Cruz, EUA).

luciferase Ensaios

Antes do ensaio as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 48 horas depois a transfecção e lisadas num tampão de lise passiva (Promega, EUA). A actividade da luciferase foi medida por um luminómetro (Promega, EUA) utilizando o kit de ensaio de repórter de luciferase dupla (Promega, EUA). O resultado foi normalizado com a actividade luciferase Renilla. dados relatados foram representados como a média de três experiências independentes.

eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA)

proteínas nucleares foram extraídas das células BLZ-211 utilizando o kit extrato de proteína nuclear (Byotime, China ). Em seguida, ensaio de desvio de mobilidade electroforética foi executada de acordo com a EMSA Kit (Pierce, EUA). Em seguida, as sondas foram preparadas com base no local de ligação Ets-2 no promotor do gene UCA1 e a sua sequência complementar correspondente (5′-TGTCCTCTGGGAAGAAATGACC-3 ‘) chamado UCA1-WT-ETS acompanhado com uma versão mutante (5′-TGTCCTCTGTATAGAAATGACC-3′ ), bem como, chamado UCA1-mUT-Ets. Uma modificação 5’-biotina foi incluída na sonda UCA1-wt-Ets. Para ensaios de competição, o excesso de 200 vezes de sondas não marcadas e não marcadas sondas mut antes foram incubados com a mistura reaccional antes de se adicionar a sonda marcada.

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) Ensaio

1 × 10

7 células foram reticulado com 1% de formaldeído, durante 10 min a 37 ° C. Em seguida, as células foram lavadas com PBS frio, colhidas por raspagem e ressuspensa em tampão de lise de células contendo inibidores de proteases (Roche, EUA). Após incubação durante 10 min em gelo, as células foram sonicadas para gerar cerca de 200-1000 pb fragmentos de ADN, e centrifugado durante 10 min a 4 ° C. Os sobrenadantes foram divididos e incubadas ou com 2-ETS-anticorpo anti (Santa Cruz, EUA), ou IgG (Boster, China) como um controlo negativo, a 4 ° C durante a noite com rotação, respectivamente. Os complexos imunes foram precipitados com o ADN de esperma de salmão /proteína G-agarose (Millipore, EUA) durante 2 h a 4 ° C, em seguida, foram recuperados, lavou-se, eluiu-se com o tampão de ChIP eluição e inverter reticulada por aquecimento a 65 ° C durante 4 h. O ADN foi purificado a partir de imunoprecipitação com o anticorpo ou a partir de amostras de entrada e foram analisadas por PCR, utilizando iniciadores que flanqueiam local de ligação Ets-2 no promotor do gene UCA1 (Tabela 1). ChIP ensaios foram realizados em duplicado.

Western Blot

As células foram sedimentadas e lisadas em seguida por tampão RIPA (Thermo Scientific, EUA). Após a resolução de SDS-PAGE e transferência de membrana, as proteínas alvo foram sondadas com anticorpo contra humano Ets-2 (Santa Cruz, EUA), Akt, pAkt (Cell Signaling, EUA), Bax (Epitomics, EUA) ou GAPDH (Abmart, China ), seguido por incubação com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano de imunoglobulina (Santa Cruz, EUA). Finalmente, as bandas foram visualizadas por quimiluminescência utilizando um kit de detecção de quimioluminescência (Pierce, EUA) e as bandas específicas foram registados num filme de raios-X.

Ensaio de Apoptose

Para quantificar a apoptose, as células eram coradas com anexina V e PI utilizando o kit de detecção de anexina V-FITC /PI apoptose (Keygene Biotech, China) seguindo as instruções do fabricante. A fluorescência foi detectada por microscópio de fluorescência (Olympus, Japão) e citometria de fluxo ciano ADP 9 cor da Beckman Coulter (Coulter Beckman Brea, CA). A citometria de fluxo experiências foram realizadas em triplicado e repetidas três vezes.

Análise estatística

Os dados foram apresentados como médias ± desvio padrão (DP) de três experiências separadas. As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 13.0. As diferenças entre os grupos foram analisadas utilizando o estudante

t

-teste.

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significante

Resultados

Clonagem e Análise Bioinformatial do Promotor Região UCA1

No estudo anterior, o local de início da transcrição (TSS) da UCA1 foi identificado por 5′-RACE [12]. O programa Megablast de NCBI foi utilizado para determinar a TSS de UCA1 gene, que foi localizado em 15.939.757 posição do CHR19 (GRCh37 /hg19). Marcação este local como um, um total de sequências de ADN de 3,0 kb da região de regulação que flanqueia o UCA1 5 ‘(+ -2000 BP- 1000 pb) foi obtido a partir do GenBank, que foi utilizado para análise bioinformatical. O resultado do programa FPROM sugeriu que a TSS está localizado na 135 bp, e uma TATA-box em 105 pb. A análise do programa PromoterInspector indicaram que a região promotora se situa entre -515 pb e 100 pb região. Considerando os resultados 5’-RACE anteriores e os resultados de previsão, nós escolhemos as sequências de -1800 pb para 200 pb para seguir pesquisa. Para avaliar a actividade do promotor UCA1, construções repórter contendo uma série dos flanqueante 5 ‘sequências (pGL3-UCA1-2000, pGL3-UCA1-1200, pGL3-UCA1-900, pGL3-UCA1-600, pGL3-UCA1-350) foram medidos por ensaio luciferase em células BLZ-211. As construções de pGL3-UCA1-2000, pGL3-UCA1-1200, pGL3-UCA1-900 e pGL3-UCA1-600 exibido actividade do promotor diferente. O pGL3-UAC1-1200 produziu a actividade do promotor mais forte nestas construções. Nomeadamente, quando o fragmento de DNA de -400 pb e entre -150 pb foi suprimida, a actividade do promotor foi quase aboliu (Fig. 1A), sugerindo a existência de um elemento regulador positivo crítica nesta região. Estas experiências sugerem que a supressão da actividade do promotor UCA1 detectada em células BLZ-211 é principalmente atribuível ao elemento regulador positivo entre -400 e -150 pb pb da região do promotor. Houve muitos factor de transcrição (TF) liga�o ao sites desta região predito pelo programa MatInspector bioinformática, incluindo a putativa Ets-2, C /EBP, SP-1, c-Myb,

et, ai

. (Fig. 1B). A partir desses fatores de transcrição, escolhemos Ets-2 como o TF potencial devido à sua maior pontuação previsão.

ensaio de luciferase (A). Cinco fragmentos de DNA truncadas de região promotora UCA1 em vetores PGL3, um vector de controlo negativo, pGL3-basic, e vetoriais controlo positivo, pGL3-controle, foram transfectados em células BLZ-211. actividades de luciferase foram medidas após 48 h após a transfecção. Os valores representam médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. *

P Art 0,05. (B) da transcrição fatores de previsão usando software MatInspector. Os fatores de transcrição com alta pontuação previsão estavam presentes.

Ets-2-vinculativo Sites Contribuir para o Promotor Activation

Para investigar se Ets-2 é fundamental para a atividade do promotor UCA1, substituímos os Ets-2 sites para

Hind

III locais de endonuclease de restrição em pGL3-UCA1-1200-mut vinculativo. Em comparação com a actividade repórter de luciferase de tipo selvagem pGL3-UCA1-1200, o pGL3-UCA1-1200-mut produziu uma actividade promotora muito mais baixa em células BLZ-211 (Fig. 2A), demonstrando que estas ETS-2 locais de ligação, de facto jogado um papel essencial na regulação da atividade do promotor UCA1. Para confirmar se o fator de transcrição Ets-2 pode ligar-se a esta região, extrato nuclear a partir de células BLZ-211 foi preparado e EMSA foi realizada. Os 22 oligonucleótidos bp a partir de -378 a -357 nt contendo os ETS-2 sítios de ligação foi usado como a sonda de tipo selvagem e a mesma região com os sítios de ligação mutados foi utilizado como a sonda mutante (Fig. 2B). Como mostrado na Fig. 2B, um complexo ADN-proteína proeminente foi formado com a sonda do tipo selvagem. A ligação foi competiu fora por um excesso de 200 vezes de sonda não marcada de tipo selvagem, mas não por um excesso de 200 vezes de sonda mutante não marcada. Os resultados indicaram que esta região era responsável pela formação do complexo ADN-proteína. Para investigar se Ets-2 pode ligar diretamente para o promotor UCA1 proximal

in vivo

, Chip foi realizada utilizando anticorpos contra Ets-2 para imunoprecipitar cromatina fixo-formaldeído a partir de células BLZ-211. Como mostrado na Fig. 2C, os produtos de PCR proeminentes contendo os Ets-2 locais de ligação foram detectadas utilizando ADN puxado para baixo pelo anticorpo contra Ets-2, ao passo que nenhuma amplificação foi observada no DNA imunoprecipitada por IgG, demonstrando que Ets-2 podem ligar-se directamente ao promotor UCA1 em BLZ-211 células.

(A) ensaio de luciferase. Os locais de ligação Ets-2 (GGGAAG) foram substituídos com

Hind

sítios III (AAGCTT) por mutagénese dirigida ao local (painel superior). actividades de luciferase relativas do tipo selvagem (wt) e dos vectores mutantes (mutantes) foram medidos por ensaio de luciferase. Os valores representam médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. *

P Art 0,05. (B)

In vitro

detecção de ETS-2 factor de transcrição de ligação à região do promotor do gene UCA1 por ensaio EMSA. Uma banda predominante foi observado quando a sonda Ets-2 marcado com biotina foi incubada com o extracto nuclear (pista 2). Ets-2 A ligação não pode ser inibida pela sonda mutante (pista 3), enquanto que foi competiu com a sonda não marcada frio (pista 4). (C)

In vivo

detecção de ETS-2 factor de transcrição de ligação à região do promotor do promotor do gene UCA1 por ensaio de chip. cromatina de entrada (entrada), o que representou porções de cromatina sonicada antes da imunoprecipitação, foi utilizado como um controlo positivo. IgG foi usado como um controle negtive de ensaio ChIP.

ETS-2 é essencial para a regulação da transcrição de UCA1

Para determinar se fator de transcrição Ets-2 poderia regular a expressão UCA1 , semi-quantitativo de RT-PCR foi realizada depois de derrubar Ets-2 por siARN específica em células BLZ-211. Os resultados da PCR mostraram que a expressão de ARNm de UCA1 foi diminuída em cerca de 50%, após a atenuação da expressão Ets-2 (Fig. 3A). Além disso, como os resultados do ensaio de luciferase mostrado, quando co-transf ectadas o siRNA específico Ets-2 ou mexidos com ARNsi de controlo pGL3-UCA1-1200 em células BLZ-211, knockdown da ETS-2 causou a diminuição da actividade de promotor em comparação UCA1 com o grupo de controlo scrambled siRNA (Fig. 3B). Estes resultados indicaram que Ets-2 pode regular a expressão de UCA1 por afectar a actividade do promotor UCA1.

(A) Expressão de ETS-2 e UCA1 foi medido por RT-PCR seguindo Ets-2 siRNA específico mexidos ou tratamento de siRNA em células BLZ-211. 18 S rRNA foi usado como um controlo interno. (B) ensaio da luciferase. Ets-2 siRNA específico mexidos ou ARNsi de controlo foi co-transfectado com pGL3-UCA1-1200 em células BLZ-211. Os valores representam médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. *

P Art 0,05. NSC: controle não-específica siRNA

UCA1 podem estar envolvidos na apoptose induzida por Ets-2 Knockdown em BLZ-211 Cells

O papel dos Ets-2 no cancro da bexiga. não é clara, assim, verificou-se a conseqüência funcional da Ets-2 knockdown em células de cancro da bexiga. Um nível de aumento de apoptose foi observada após um tratamento de 48 horas com o ETS-2 ARNic em células BLZ-211 através de microscópio de fluorescência. Os resultados de ensaios de apoptose de células mostrou um aumento do nível de apoptose em células BLZ-211 quando as células foram tratadas com o ETS-2 siRNA específica em comparação com o tratamento controlo scrambled siRNA (Fig. 4A). Para verificar se Ets-2 induzida a expressão do gene UCA1 estava envolvido em apoptose estudamos uma outra linha celular TCC da bexiga, chamado de BLS-211. BLS-211 é a falta de expressão UCA1 endógeno e é derivado do mesmo paciente, como linha celular BLZ-211. Curiosamente, depois de derrubar o gene Ets-2, nós não observada apoptose subsequente BLS-211 células (Fig. S1). Além disso, temos as células em apoptose por citometria de fluxo em ambas as linhas celulares separadamente. Consistente com os resultados de microscopia de fluorescência, citometria de fluxo resultados revelaram um aumento significativo de células pro-apoptose (quadrante direito superior) após Ets-2 em células knockdown BLZ-211 (12,49 ± 1,21%

vs. 6,40 ±

1,47%), enquanto não se observou qualquer aumento da pro-apoptose após Ets-2 em células knockdown BLS-211 (4,12 ± 0,28%

vs.

3,20 ± 2,50%) (Fig. 4B). Estes resultados sugeriram que UCA1 podem estar envolvidos na apoptose celular induzida pela supressão da Ets-2.

(A) A indução de apoptose após um tratamento de 48 horas de ETS-2 ARNsi de controlo ou ARNsi mexidos em células BLZ-211 foi examinada usando um microscópio de fluorescência. As células foram coradas com anexina V (verde) e PI (vermelho). Barra de escala 25? m. As imagens foram representativos de três experiências independentes. (B) A apoptose foi quantificada por citometria de fluxo (FCM). Os resultados FCM eram representativos de três experiências independentes. Os processos celulares pró-apoptose (quadrante direito superior) estavam aumentados após Ets-2 em células knockdown BLZ-211 (12,49 ± 1,21% vs 6,40 ± 1,47%, *

P

0,05) ao passo que não houve alteração significativa em BLS-211 células (4,12 ± 0,28% vs. 3,20 ± 2,50%,

P Art 0,05). NSC:. Controle não específica siRNA

UCA1 podem participar nas Inactivação de Akt no celular apoptose induzida por Ets-2 para baixo-regulação

Para determinar a supressão se de Ets -2 induzir a apoptose em células cancerosas da bexiga por meio de Akt, uma via de apoptose regulador privotal, investigou-se a nível de expressão da proteína de Akt total e Akt fosforilada (pAkt). Curiosamente, os resultados de transferência de Western mostrou que após o silenciamento do Ets-2, expressão de pAkt foi subsequentemente diminuiu, enquanto que a expressão de pró-apoptótica de proteínas Bax foi aumentada (Fig. 5, painel esquerdo). Os nossos resultados implicaram que Ets-2 knockdown activada para induzir a apoptose em células BLZ-211 através de inactivação de Akt e conduziu a alterações nas moléculas alvo a jusante. Assim, assumiu-se que a expressão do gene UCA1 pode estar associada com a activação de Akt, que está envolvida no processo mediado anti-apoptose Ets-2 em células cancerosas da bexiga. Para lidar com esse conceito, nós próxima estudaram o nível de expressão da proteína Akt, pAkt e Bax em células BLS-211. Como se mostra, não foi notável diferença entre o grupo tratado Ets-2 siRNA e mexidos siARN grupo tratado (Fig. 5, painel da direita). Os nossos resultados sugerem que a sub-regulação de ETS-2, um factor de transcrição do gene UCA1, podem induzir apoptose em células BLZ-211 diminuiu a expressão UCA1 e isto pode contribuir para a inactivação da via de Akt (Fig. 6).

ETS-2 e proteínas relacionadas com apoptose foram detectadas por Western blot. GAPDH foi usada como um controlo interno. NSC:.. Controle não específica siRNA

A linha tracejada a partir UCA1 para Akt indica que a associação entre UCA1 e Akt pode ser indirecta

Discussão

o câncer de bexiga é uma das neoplasias mais comuns na China, classificando como a primeira neoplasia frequente do trato urinário. Temos anteriormente demonstrado que UCA1 pode promover o crescimento celular e invasão no cancro da bexiga [12]. UCA1 é um lncRNA, uma vez que tem múltiplas pequenas ORF embora não há fortes sequências de consenso de Kozak foram encontrados em qualquer um dos codões ATG [12], [13]. Vários lncRNAs foram identificados que estão ligados a doenças humanas e têm funções específicas relacionadas com doenças humanas [19]. Anteriormente, demonstramos o padrão de expressão espacial e temporal da UCA1. No entanto, a regulação da transcrição da expressão do gene UCA1 não foi estudado. Aqui, para a primeira vez que se caracteriza a região do promotor do gene humano UCA1 e relataram a sua regulação pelo factor de transcrição Ets-2.

Em contraste com os genes codificadores de proteínas convencionais, as sequências, os locais de início da transcrição , as estruturas de exão, e os comprimentos desses genes longos não codificantes são todos altamente variável [20]. Com base na sua proximidade genómico de genes codificadores de proteínas, são classificados como lncRNAs sobreposição, cis-anti-sentido, bidireccional ou intrónica ncRNAs [21], [22] .Os mecanismos de expressão lncRNA são desconhecidas, embora haja muitas evidências que sugerem que lncRNAs são reguladas por mecanismos semelhantes aos genes codificadores de proteínas. Resumidamente, no estudo de Wang et ai, eles descobriram uma região promotor-núcleo do (dos nucleótidos -132 a -48) do gene lncRNA HULC e caracterizado um sítio entre os nucleótidos -67 e -53 de ligação na região do promotor-núcleo do CREB [ ,,,0],23]. Em outro estudo por Zhao et ai, analisaram um fragmento de ADN genómico de 5 kb a montante do primeiro exão do gene lncRNA MEG3, caracterizada um local CRE envolvidos na transcrição do gene MEG3 e também encontradas várias proteínas da família CREB se ligam directamente ao CRE local [24]. Além disso, muitos estudos sugerem que os mecanismos pelos quais a expressão é ncRNA alterados em cancros são semelhantes aos mecanismos de epigenética genes codificantes, incluindo a proteína [25], [26], [27], [28].

no nosso estudo, analisou-se a região promotora proximal do UCA1 qual localizado na -2000 nucleótidos a montante do sítio do início da transcrição do gene UCA1. Foi demonstrado por ensaio de actividade de luciferase e análise de deleção que a região entre os nucleótidos -400 a -150 pode contribuir para a actividade de promotor de base. E nesta região previmos muitos fator de transcrição conhecidos através de métodos de previsão de bioinformática. Também demonstramos pela EMSA e análise chip que os locais de ligação Ets-2 entre os nucleótidos -385 e -380 desempenhou um papel importante na regulação da atividade do promotor UCA1. Em nosso estudo utilizamos células BLS-211, que foram fracassadas para expressar o gene UCA1 embora eles expressaram o gene Ets-2. Quando se tratou as células com o ETS-2 de siRNA, a actividade do promotor UCA1 não foi completamente abolida. Ambas as observações sugerem que a expressão UCA1 pode ser controlado por outros factores de transcrição bem. Digno de nota que a região entre os nucleótidos -700 e -400 foi eliminado, a actividade do promotor consideravelmente diminuída. Ele sugere uma presença de alguns activadores transcricionais nesta região. Para esclarecimentos adicionais estudos futuros devem ser focado em outros TFs da região promotora do gene UCA1, que contribuem para a actividade do gene UCA1.

ETS-2 foi caracterizada inicialmente como um proto-oncogene. Ao longo dos anos, o factor de transcrição da família Ets tornou-se um elemento comum na tumorigénese [29]. Achados de Carbone

et al

sugeriu que a regulação baixa de Ets-2 em células de câncer de próstata foi associado com níveis reduzidos do anti-apoptótica da proteína Bcl-x (L), fatores reguladores de crescimento ciclina D1 e c-myc . Este estudo revelou o papel específico de Ets-2 na promoção do crescimento e sobrevivência das células cancerosas da próstata [30]. Em outro estudo, mostraram que a expressão transiente da ETS-2 protege as células da apoptose através do aumento da actividade do promotor de Bcl-XL e, por conseguinte, aumentando os níveis de ARNm e expressão de proteínas em linhas de células de mesotelioma [31]. Anteriormente, Hanke

et ai, achou que o rácio de ETS-2 mRNA de urocinase do activador de plasminogénio (uPA) ARNm na urina poderia ser um potencial marcador de cancro da bexiga [32]. Embora existam dados suportados que Ets-2 participa no desenvolvimento do câncer de bexiga, os papéis e mecanismos exactos de ETS TFs em câncer de bexiga são na sua maioria desconhecida.

Em nosso estudo, mostramos uma inibição da expressão induzida por UCA1 ets-2 silenciamento do gene. consequência funcional da ETS-2 silenciamento de genes conduziu a apoptose em células BLZ-211. Também demonstramos que Akt estava envolvido neste processo. A serina-treonina quinase Akt (também conhecida como proteína-quinase B) é um nó de convergência central de uma rede de sinalização amplamente influente. Akt regula as funções celulares essenciais, tais como migração, proliferação, diferenciação, apoptose, metabolismo e [33]. Além disso, a activação de Akt desempenha um papel central na inibição da apoptose induzida por uma série de estímulos incluindo a retirada do factor de crescimento, desprendimento de matriz extracelular, irradiação UV, a discordância do ciclo celular e a activação de FAS sinalização [34], [35] , [36]. Para testar se Ets-2 regula Akt através UCA1, utilizou-se uma outra linha celular de cancro da bexiga BLS-211, que não possui expressão de gene UCA1 e que é derivado a partir do mesmo paciente como BLZ-211. Mais interessante, após a expressão atenuada de Ets-2 em células BLS-211 não foi observada sub-regulação de pAkt e aumento da apoptose celular. Estes resultados mostraram que UCA1 pode estar envolvida na activação da via de pAkt por Ets-2 (Fig. 6). Estes resultados foram consistentes com nosso estudo anterior mostrou que pAkt é regulada nos UCA1 células knockdown estáveis ​​BLZ-211 [37]. LncRNAs foram mostrados para abrigar actividades biológicas. Tanto quanto se sabe, o amplo repertório funcional do lncRNAs inclui papéis na dinâmica cromossômicas de alta ordem, biologia dos telômeros e organização subcelular [22], [38]. Além do nosso estudo, outros estudos também sugeriram que lncRNA pode estar envolvido na regulação da via de sinal, tal como via Wnt, via de Ras [39], [40]. No entanto, o mecanismo que como Ets-2 regula Akt permanece incerto e se o Akt sinalização proteínas interagem diretamente com UCA1 precisa ser provado ainda.

Em resumo, nós olhamos elementos reguladores diretamente envolvidos na transcrição do gene UCA1 e descobriram que a actividade do promotor de UCA1 é principalmente atribuível ao local de ligação Ets-2 no interior da região promotora proximal. Foi demonstrado que o factor de transcrição Ets-2 podem ligar-se directamente a este local e é essencial para o controlo de transcrição de expressão UCA1. Além disso, os nossos resultados mostraram que UCA1 pode estar envolvido na regulação da via de Akt por Ets-2. Portanto, concluiu-se que Ets-2 regula a expressão de UCA1, além disso lncRNA UCA1 pode estar envolvida na activação da via de sinalização de Akt por Ets-2. Nossas descobertas defender para futuras pesquisas neste campo. Este é um campo novo, com continuamente crescente importância.