Abstract

é uma condição debilitante caracterizada por uma combinação de anorexia, perda de massa muscular, perda de peso, e desnutrição. Essa condição afeta a esmagadora maioria dos pacientes com câncer de pâncreas e é a principal causa de morte relacionada ao câncer. No entanto, existem poucos, se houver, terapias eficazes tanto para tratamento e prevenção da síndrome. A fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas para a caquexia do cancro do pâncreas, modelos animais apropriados são necessários. Neste estudo, foi desenvolvido e validado um singênica, metastático, modelo murino de caquexia associada ao câncer de pâncreas. Utilizando o nosso modelo, investigou-se a capacidade de factor de crescimento transformante beta (TGF-β) bloqueio para atenuar as alterações metabólicas associadas a caquexia. Verificou-se que a inibição de TGF-β 1D11.16.8 usando o anticorpo anti-TGF-β melhorou significativamente a mortalidade global, perda de peso, a massa de gordura, massa corporal magra, a densidade mineral óssea, e a proteólise do músculo esquelético nos ratinhos albergando cancro do pâncreas avançado. Outras estratégias de imunoterapia que empregados não foram eficazes. Coletivamente, nós validamos um modelo simplificado, mas útil da caquexia do cancro do pâncreas para investigar estratégias de tratamento imunológicas. Além disso, mostramos que a inibição de TGF-β pode diminuir as alterações metabólicas associadas a caquexia associada ao câncer e melhorar a sobrevida global

Citation:. Greco SH, Tomkötter L, Vahle AK, Rokosh R, Avanzi A, Mahmood SK, et ai. (2015) TGF-β bloqueio reduz a mortalidade e alterações metabólicas em um murino modelo validado de cancro do pâncreas A caquexia. PLoS ONE 10 (7): e0132786. doi: 10.1371 /journal.pone.0132786

editor: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Cancer Institute Mitchell, United States |

Recebido: 21 de novembro de 2014; Aceito: 18 de junho de 2015; Publicação: 14 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Greco et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte por doações da Associação America Hepato-biliar pâncreas (SHG), a Fundação alemã de Pesquisa (LT), Instituto Nacional de saúde concessões CA155649 (GM), e CA168611 (GM), e alemão Cancer Aid (AKV)

CONFLITO DE iNTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pâncreas ductal adenocarcinoma (PDA) é um câncer gastrointestinal agressivo, com uma taxa de sobrevivência de cinco anos de menos de 5% [1]. A maioria dos pacientes com PDA presente com doença metastática avançada e tem uma taxa de sobrevivência média de apenas 3-6 meses [2, 3]. Mortalidade e má qualidade de vida desses pacientes está relacionada com as alterações metabólicas e nutricionais significativos associados com a síndrome de caquexia associada ao câncer. Esta síndrome está presente em até 80% dos pacientes PDA e é responsável por até 22% de todas as mortes relacionadas com o cancro [4-6].

Uma característica proeminente da caquexia é o desenvolvimento de perda de peso não intencional de pelo menos 5% da massa corporal [7]. A perda simultânea de massa corporal magra e massa gorda distingue caquexia de fome, em que a massa muscular magra é inicialmente preservados. caquexia associada ao câncer engloba uma série de distúrbios metabólicos, incluindo aumento de alterações, incluindo metabolismo energético em proteína, gordura e metabolismo e glucose imunossupressão com o aumento da liberação de citocinas pró-inflamatórias e proteínas de fase aguda [6]. Além disso, os efeitos cognitivos de caquexia incluem fadiga, perturbações da memória e cognição, e diminuição da actividade física ocorre um aumento do gasto de energia em repouso [8, 9]. Colectivamente, estes transtornos reduzir a qualidade de vida em pacientes caquéticos, e pode mesmo contribuir para uma resposta terapêutica diminuída à quimioterapia [10].

Infelizmente, existem algumas estratégias de tratamento eficazes baseadas em evidências para caquexia associada ao câncer. Porque este processo de doença engloba uma variedade de desequilíbrios do hospedeiro, os tratamentos eficazes devem, idealmente, segmentar várias vias metabólicas. A caquexia tem sido tratado com a utilização de progestinas tais como acetato de megestrol e acetato de medroxiprogesterona para aumentar o apetite e ganho de peso, juntamente com corticosteróides para melhorar o humor e reduzir a inflamação [11, 12]. No entanto, os benefícios clínicos destes tratamentos têm sido marginal [11, 13]. Outros agentes terapêuticos potenciais que foram estudados incluem ciclo-oxigenase (COX-2) e inibidores da droga experimental, incluindo a grelina e grelina miméticos, factor de necrose tumoral combinada alfa (TNF-α) e a interleucina 6 (inibidores da IL-6), bem como β- agonistas do adrenoceptor e inibidores da miostatina [6]. No entanto, os resultados clínicos eficazes em pacientes com caquexia do câncer ter sido evasivo.

modelos animais validados de caquexia associada ao câncer de pâncreas são necessárias para desenvolver estratégias eficazes de tratamento baseadas em imunoterapia. linhas de células de indução de caquexia, tais como carcinoma do pulmão de Lewis (LLC) e tumores colo-rectais foram amplamente utilizados em modelos animais de caquexia do cancro [4, 14]. Estas linhas de tumor são implantados subcutaneamente em animais de experimentação e são deixadas a crescer até que os sintomas de caquexia são alcançados. Tais modelos heterotópicos também têm sido utilizados para estudar a caquexia em PDA [15, 16]. No entanto, uma limitação principal destes modelos é a sua incapacidade para metastizar [17]. modelos de xenoenxerto de PCA humana em que as linhas celulares PDA humanos são implantadas em ratinhos atímicos ou imunodeprimidos também foram empregues [17]. No entanto, embora os modelos de xenotransplante efetivamente imitam epigenética tumor /hospedeiro e pode metástase, eles alterar significativamente o meio imunológico e, portanto, prejudicar a capacidade de estudar as alterações imunológicas associadas a caquexia bem e todas as estratégias de imunoterapia [17, 18].

alvos imunológicos potenciais para o tratamento da caquexia no PDA, incluem receptores Toll-like (TLRs) e fator transformador de crescimento beta (TGF-β). receptores toll-like são uma família de receptores de reconhecimento de padrões nas células imunitárias inatas que ligam directamente estímulos ambientais a respostas inflamatórias inatas [19]. TLR pode ser activado por ligação não-patogénicos moléculas “perigo”, conhecidos como Damps, incluindo subprodutos de lesão inflamatória e necrose celular [20, 21]. TLRs ter sido implicada como desempenhando um papel significativo no PDA, como o nosso laboratório tem mostrado recentemente que TLR7 ligação acelera a carcinogénese pancreático e que o bloqueio de TLR7 protegido contra a progressão tumoral [22]. Além disso, a estimulação TLR9 tem sido correlacionada com o potencial invasivo e metastático de PCA humana, implicando, assim, este receptor como alvo potencial para o tratamento desta doença [23]. No entanto, para o nosso conhecimento nenhum TLR7 TLR9 nem foi estudada no tratamento de caquexia do cancro do pâncreas.

O factor de crescimento transformador beta (TGF-β) via desempenha um papel importante na diferenciação celular e inflamação [24]. a activação do receptor de TGF-β leva à fosforilação de proteínas incluindo Smad Smad2, Smad3, e Smad4, que por sua vez regulam a transcrição de inibidores do ciclo celular, incluindo p21 [25]. Em PDA, TGF-β, paradoxalmente sido mostrado que actua tanto como um supressor tumoral e promotor tumoral [26]. TGF-β pode inibir a proliferação, suprimir a transformação, e diminuir a progressão PDA [27]. No entanto, ao mesmo tempo o TGF-β bloqueio pode reduzir a capacidade invasiva de PDA [28]. No entanto, as mutações em mediadores a jusante de sinalização de TGF-β, incluindo Smad4 foram mostrados para promover a progressão PDA [29]. Além disso, embora o TGF-β tem sido implicada para promover a caquexia do cancro [30, 31], para o nosso conhecimento, o bloqueio de TGF-β não tem sido estudada como uma estratégia terapêutica no tratamento de caquexia do cancro do pâncreas. O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo metastático singênica da caquexia do cancro do pâncreas e para investigar as estratégias de tratamento de imunoterapia, incluindo TLR 7/9 bloqueio e bloqueio de TGF-β.

Materiais e Métodos

animais, as linhas celulares, e in vivo

Homem C57BL /6 (H-2k

b) e Toll-like receptor 9 knockout (TLR9 ​​

– /-) ratos foram adquiridos no Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Pdx1

Cre; Kras

LSL-G12D; Tp53

R172H (KPC) ratos foram um presente de Mark Philips (New York University) [32]. Os animais foram criados em casa e os ratos com a mesma idade de 6-8 semanas de idade foram utilizados para todas as experiências. A linha celular de murino Pan02 PDA (presente de Daniel Meruelo, Universidade de Nova Iorque), que é singeneicos para murganhos C57BL /6, foi cultivada em meio de cultura RPMI completo suplementado com soro fetal bovino a 10% e 1% de penicilina-estreptomicina. células tumorais FC1242 PDA derivadas de camundongos KPC eram um presente de David Tuveson (Cold Spring Harbor Laboratory). Os ratinhos foram injectados i.p. com 10 milhões de Pan02 ou 5 milhões FC1242 células para induzir a síndrome de caquexia associada ao câncer. grupos seleccionados foram adicionalmente administrados 2,6 mg /kg do receptor de tipo Toll 7 e 9 (TLR7 /9) inibidor IRS 954 (Dynavax, Berkeley, CA), três vezes por semana, ou 200 ug de factor de crescimento transformante beta (TGF-β) inibidor (1D11.16.8 clone, inibe TGF-β

1, β

2 e β

3) (Bioxcell, West Lebanon, NH) duas vezes por semana, começando imediatamente após a inoculação com Pan02 e continuando para o duração da experiência. Os animais foram monitorados duas vezes por dia. Os ratinhos foram sacrificados utilizando CO2 narcose seguido por deslocamento cervical no final do período de estudo de 60 dias, ou mais cedo, se eles pareciam moribundos ou exibiram maior do que 20% de perda de peso. Para induzir o crescimento do tumor por via subcutânea, os ratinhos foram injectados no flanco direito com 10 milhões de células Pan02. O crescimento do tumor foi medido utilizando um calibrador duas vezes por semana. Os níveis de citocinas no soro foram determinadas utilizando uma matriz de citometria de talão (BD Biosciences). A Faculdade de Medicina IACUC Universidade de Nova York aprovou todos os procedimentos

A medição do peso e composição corporal

O peso ea composição corporal, incluindo:. Massa gorda, massa magra,% de gordura corporal, o conteúdo mineral ósseo, e densidade mineral óssea foram medidos semanalmente utilizando dupla energia absortometria de raio-x (DEXA) com o dispositivo Lunar PIXImus (PIXImus, Fitchburg, WI) para pequenos animais. Todos os ratinhos foram anestesiados antes da recolha de dados DEXA utilizando 0,1 mg /g de cetamina e 0,01 mg /g de xilazina por injecção i.p. injecção. Os dados foram analisados ​​usando o software Lunar PIXImus versão 1.45. circunferência do braço foi calculada como 3,14 vezes o diâmetro do braço, medido utilizando um paquímetro com precisão ± 0,1mm. subescapular também foi medida utilizando um paquímetro.

Western blot e imunohistoquímica

Por Western blot, proteína total foi isolado a partir do quadríceps do mouse ou do tecido adiposo por homogeneização em tampão RIPA com cocktail completa inibidor de protease e cocktail de inibidores de fosfatase (Roche, Pleasanton, CA) [33]. quantificação de proteína foi determinada pelo ensaio de proteína de Bradford, e as amostras foram igualmente carregados em géis de poliacrilamida a 10% (NuPAGE, Grand Island, NY), a electroforese a 200V, electrotransferidas para membranas de PVDF, e sondadas com anticorpos para atrogina-1 (1: 500 ; ECM Biosciences, Versailles, KY), a miostatina (1: 200; Abcam, Cambridge, MA), MuRF1, ZAG (1: 500; ambos de Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), p21 (1: 200; Santa Cruz), β-actina, Smad2, p-Smad2 /3 (1: 1000; todos Cell Signaling, Danvers, MA), TGF-β (1: 1000; Abcam), e Ezrin (1: 1000; BD Transduction Laboratories, San Jose, CA). A quantificação foi realizada por medição da densidade integrada e normalizando a controlos de carga. Para análise imuno-histoquímica, secções de tecido embebidas em parafina foram coradas utilizando anticorpos policlonais anti-TGF-β (1: 100; Abcam, Cambridge, MA), anti-p21 (1: 100, Santa Cruz), ou anti-p Smad 2/3 (1:50, Santa Cruz) e os controlos de isotipo correspondentes [33].

qPCR e ensaio de proliferação celular

Para a análise de PCR, o ARN total foi isolado utilizando o Kit RNeasy Mini (Qiagen, Germantown, MD) e cDNA foi feita usando o High Capacity Transcrição reversa Kit (Applied Biosystems, Grand Island, NY). RT-PCR foi realizada em um sistema Mx3005P QPCR Stratagene (Agilent Technologies) utilizando iniciadores pré-concebido para rato e MuRF1 atrogina-1 (ambos Qiagen, Germantown, MD) [34]. Em tumor vitro a proliferação celular foi avaliada utilizando o ensaio XTT II de acordo com o protocolo do fabricante (Kit de Proliferação Celular II, Roche, Pleasanton, CA) e expressos como a proliferação% em relação ao controle (100%).

neurocognitivos Ensaios

para o teste rotarod, os animais foram colocados em uma haste (diâmetro 3,6 cm) aparelho para avaliar as diferenças na coordenação motora e equilíbrio medindo membro anterior e motor hindlimb coordenação e equilíbrio (rotarod 7650 modelo de aceleração; Ugo Basile, Varese , Itália), como já anteriormente descrito [35]. Cada animal foi testado para três sessões, com cada sessão separada por 15 min, e foram tomadas medidas para a velocidade de rotarod quando os animais caiu a partir do topo do tambor giratório.

O teste de reconhecimento de objecto espontânea (ORT) foi realizado em uma caixa campo aberto em forma de quadrado, elevou de 50 cm do chão como já descrito anteriormente [35]. Dois novos objetos foram colocados em cantos diagonais em campo aberto e o animal foi permitido explorar por 15 min. Para qualquer dado ensaio, os objectos num par eram 10 cm de altura e compostas do mesmo material, de modo que não podiam ser facilmente distinguidos pelo pistas olfactivas. O tempo gasto explorando cada objecto foi registada por um sistema de seguimento (San Diego Instruments, San Diego, CA), e no final da fase de formação com o rato foi removido da caixa para a duração do atraso de retenção (3 h). Durante testes de retenção, os animais foram colocados de volta na mesma caixa, em que um dos objectos familiares anteriores usados ​​durante o treino foi substituído por um novo objecto, e foram deixados a explorar livremente durante 6 min. Um par objeto diferente foi utilizada para cada ensaio para um determinado animal, ea ordem de exposição ao objeto pares, bem como a amostra designada e novos objetos para cada par foram contrabalançados dentro e entre os grupos. O tempo gasto explorando o romance e objetos familiares foi gravada para 6 min. O índice de teste de reconhecimento de objeto foi calculada como a proporção de tempo gasto explorando o objeto romance para o tempo gasto explorar tanto o romance e objeto familiar.

Estatísticas

Os dados são apresentados como média ± erro padrão . Sobrevivência foi medida de acordo com o método de Kaplan-Meier. A significância estatística foi determinada pelo Student

t

teste eo teste de log-rank usando GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA). P-valores. 0,05 foram considerados significativos

Resultados

Desenvolvimento de um modelo singênico de câncer de pâncreas avançado

Ratos administrados células Pan02 PDA por injecção ip desenvolvido carcinomatose peritoneal aberta (Figura 1A) com implantes peritoneais em superfícies incluindo o mesentério do intestino delgado, bem como metástases hepáticas microscópicas (Fig 1B) no prazo de três semanas após o tratamento. Estes resultados correlacionam-se com PDA avançado em seres humanos, a qual está associada com o fígado e /ou metástases peritoneais em quase todos os casos [36]. Aproximadamente 75% dos animais tratados com Pan02 morreram no prazo de 45 dias após o tratamento (Fig 1C). Além disso, de acordo com síndrome de caquexia PDA, os ratinhos tratados com Pan02 exibiu perda de peso progressiva começando aproximadamente 2 semanas após a inoculação do tumor (Figura 1D).

(A) Os murganhos administrados com Pan02 exibiu bruta e (B) de evidência microscópica peritoneal carcinomatose, bem como implantes de fígado microscópicas. Imagens representativas e dados de resumo são mostrados. Análise (C) de Kaplan-Meier de sobrevivência foi realizada em PBS e Pan02 animais tratados (n = 20 /grupo, p 0,05). (D) Os pesos médios corporais dos grupos de rato tratados com PBS ou Pan02 foram calculados a vários pontos de tempo, como foi a alteração de peso total durante o curso do estudo (n = 20; * p 0,05, *** p 0,001) .

Evidência de composição corporal alterada

Clinical caquexia associada ao câncer pancreático está associada não só com a perda de peso, mas também com a perda de gordura, músculo e osso conteúdo [6, 37] . Por conseguinte, verificou-se que os ratinhos tratados com Pan02 perdeu cerca de 1 g da massa de gordura por 24 dias (Fig 2A), e tinha reduzido significativamente por cento de gordura corporal, em comparação com ratinhos de controlo (Figura 2B). ratinhos portadores de tumor também exibiu massa corporal magra inferior (Fig 2C), e elevações reduzida em ambos conteúdo mineral ósseo (Figura 2D) e densidade mineral do osso em comparação com ratinhos de controlo (Figura 2E). Para quantificar ainda mais corpo muda de composição, medimos a circunferência superior do braço (Fig 2F) e subescapular (Fig 2G), e acharam a ser marcadamente diminuída nos ratos tratados com Pan02. Tomados em conjunto, estes resultados correlacionam-se com as alterações metabólicas associadas à síndrome de caquexia associada ao câncer de pâncreas clínica.

(A) de gordura médio de massa B) e gordura percentagem média de corpo de coortes de rato tratados com PBS ou Pan02 foi calculada em diversas épocas pontos, bem como a mudança total ao longo do curso do estudo. (C) As mudanças na massa magra, (D) o conteúdo mineral ósseo, (E) densidade mineral óssea, (F) circunferência do braço e dobras cutâneas (G) também foram calculados (n = 20; * p 0,05, ** p 0,01, *** p . 0.001)

Evidência de atrofia muscular e alteração inflamatória

Uma vez que a proteólise e atrofia muscular são marcas da caquexia associada ao câncer pancreático humano [38], nós marcadores medidos de atrofia muscular em ambos os ratinhos tratados com Pan02 e ratinhos de controlo. Ambos atrogin-1 e MuRF-1 são E3 ligases de ubiquitina expressos no músculo esquelético que têm como alvo proteínas para a digestão enzimática [39, 40] .que encontramos aumento dos níveis intramusculares de atrogin-1 (Fig 3A) e MuRF-1 (Fig 3B) no ratos do tumor-rolamento por qPCR. Western blot confirmou estes resultados e, adicionalmente, mostrou expressão muscular elevado de miostatina em animais tratados (Fig 3C), sugestivos de proteólise intramuscular [41]. Da mesma forma, alfa zinco glicoproteína (ZAG), um marcador de lipólise, foi também marcadamente elevados no tecido adiposo de murganhos tratados com Pan02 (Fig 3D). Consistente com um estado proteolítica, de peso quadríceps foi menor nos ratinhos portadores de tumor (Figura 3E). Os pacientes com cancro avançado-caquexia pâncreas normalmente exibem citocinas pró-inflamatórias elevadas, que estão associados com a sobrevivência pobre [42, 43]. Por conseguinte, os níveis de MCP-1 e IL-6 foram elevados no soro de hospedeiros com tumor (Figura 3F).

os níveis de (A) de ARNm de atrogina-1 e (B) em MuRF1 músculos quadríceps de ratinhos tratados com PBS ou Pan02 foram calculados por qPCR. (C) Similarmente, os níveis de atrogina-1, a miostatina, MuRF1, e β-actina de músculo quadriceps foram calculados por Western blotting. expressão (D) ZAG foi testado no tecido adiposo visceral a partir de grupos de ratinhos tratados com PBS ou Pan02. foi calculada (E) Peso do quadríceps de coortes de rato tratados com PBS ou Pan02. (F) os níveis de soro de MCP-1 e IL-6 foram comparados em PBS e os ratinhos tratados com Pan02 (n = 5; * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001)

.

Combinada TLR7 /9 inibição não atenua caquexia associada ao câncer de pâncreas

Nós relatado anteriormente que receptor Toll-like (TLR) ligadura acelera a progressão do câncer de pâncreas enquanto o bloqueio da escolha vias de sinalização TLR pode ser protetora [ ,,,0],22, 44]. Portanto, postulamos que a inibição TLR pode ser protetora contra a caquexia associada ao câncer de pâncreas. Para testar isto, os ratinhos foram tratados com IRS 954, uma combinação de TLR7 /9 inibidor oligonucliotide [45]. Tal como previsto, as citocinas do soro foram seleccionados inferior em IRS 954 ratinhos tratados (Fig 4A). No entanto, os animais tratados com Pan02 + IRS 954 tiveram uma sobrevida global semelhante em comparação com ratos tratados com Pan02 sozinho (Fig 4B). Além disso, não houve diferenças significativas na perda de peso cumulativo (Fig 4C), alterações na massa corporal magra (Fig 4D), massa gorda (Fig 4E), circunferência do braço e prega cutânea (Fig 4F), ou a densidade mineral óssea (Fig 4G ) entre os grupos tratados e de controlo. ratinhos portadores de tumores no entanto, tratadas com 954 IRS tinha maior teor de mineral do osso do que os ratos portadores de tumores não tratados (Fig 4H). deleção genética de TLR9 foi igualmente ineficaz em aliviar caquexia associada ao câncer de pâncreas em animais Pan02-challanged (S1 FIG). Tomados em conjunto, nossos experimentos empregando inibição selectiva ou combinados TLR não substantivamente melhorar experimental caquexia associada ao câncer de pâncreas

Mice (A) foram tratados com Pan02 ou Pan02 + IRS 954 e testados para citocinas séricas (n = 20; *. p 0,05) e sobrevivência (B) utilizando o método de Kaplan-Meier (n = 20; p = NS). (C) Da mesma forma, os ratos foram tratados com PBS, IRS 954, Pan02 ou Pan02 + IRS 954 e testado para a mudança de peso global, e as mudanças no (D) massa magra, (E) a massa de gordura, (F) circunferência do braço e prega cutânea espessura, (G), a densidade mineral óssea, (H) e conteúdo mineral do osso (n = 20 /grupo; * p 0,05).

O tratamento com inibidor da TGF-β protege contra caquexia do cancro do pâncreas

A superfamília do TGF-β tem um papel importante nas respostas imune de tumores [46]. β TGF- também tem sido implicado na caquexia, estimulando a degradação muscular e proteólise [47]. No entanto, a segmentação de TGF-β na caquexia do cancro do pâncreas não foi testado. Nós, portanto, primeiro determinar se o bloqueio TGF-β foi relevante em nosso modelo de caquexia associada ao câncer de pâncreas. TGF-β e o factor de transcrição de p21 a jusante e p-Smad 2/3 foram altamente expresso por tumores Pan02, bem como em modelos endógenos de cancro do pâncreas avançado murino (Fig S2). Confirmou-se que os ratos com tumores tratados com uma Pan02 neutralizante de TGF-β mAb (1D11.16.8) exibiram os níveis séricos mais baixos de TGF-β (Figura 5A), bem como os níveis mais baixos de TGF-β e marcador de sinalização a jusante de p-Smad2 /3 no músculo esquelético (figura 5B). Além disso, o tratamento de células tumorais com Pan02 1D11.16.8 não alterou a sua proliferação celular in vitro (Fig 5C) ou o crescimento tumoral in vivo por via subcutânea (figura 5D). Por último, verificou-se que o tratamento de camundongos com 1D11.16.8 sozinho em hospedeiros não tendo-tumorais não alterou a mudança de peso, massa corporal magra, massa gorda, circunferência do braço, ou a densidade mineral óssea (S3 Fig).

os níveis de (a) de soro de TGF-β foram medidos em ratos tratados com Pan02, Pan02 + 1D11.16.8, ou PBS + ID11.16.8 (n = 10 /grupo; * p 0,05). (B) os níveis de Smad2 intramusculares, p-Smad2 /3, TGF-β, e Ezrin (um controlo de carga) foram calculadas através de Western blotting. Análise de densidade foi feita com base em triplicado (* P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). proliferação celular (C) Pan02 foi medida após tratamento com doses crescentes de 1D11.16.8. (D) 10

7 Pan02 células foram implantadas subcutaneamente no flanco direito de ratinhos tratados com PBS ou 1D11.16.8. Os tumores foram medidos duas vezes por semana com um compasso e os tumores foram explantados para comparação do tamanho do tumor (n = 5 /grupo).

Em seguida, investigou-se o bloqueio farmacológico de TGF-β poderia atenuar caquexia do cancro do pâncreas. Os ratinhos tratados com Pan02 + 1D11.16.8 exibiram melhoria na sobrevivência (Figura 6A) e significativamente menos perda de peso (Fig 6B) em comparação com ratinhos de controlo. ratinhos portadores de tumor tratados com 1D11.16.8 também apresentaram maior massa gorda (figura 6C), espessura da dobra cutânea (Figura 6D), e densidade mineral óssea (Figura 6E), em comparação com os controlos. Além disso, encontramos evidências significativamente diminuída de proteólise em ratos tratados com 1D11.16.8, que é refletida por uma diferença notável no contorno corporal, em comparação com ratinhos de controlo (Fig 6F). Por conseguinte, houve redução marcadamente atenuada na massa corporal magra em ratinhos tratados com 1D11.16.8 (Fig 6G). Além disso, também confirmou que 1D11.16.8 atenua eficazmente caquexia associada ao câncer de pâncreas utilizando células FC1242 KPC-derivados. Especificamente, descobrimos que FC1242 ratos tratados com 1D11.16.8 também melhorou a sobrevida global, diminuiu a perda de massa gorda, maior densidade mineral óssea e diminuição da perda de percentual de gordura corporal em comparação com ratinhos de controlo (S4 Fig).

(a) Os ratos foram tratados com ou Pan02 Pan02 + 11D1.16.8 e testado para a sobrevivência utilizando análise de Kaplan-Meier. (B) As coortes de ratinhos foram também testados quanto à variação de peso, e alterações em (C), a massa de gordura, a espessura das dobras cutâneas (D), ou (E) A densidade mineral óssea (n = 10 /grupo; * p 0,05, ** p 0,01). (F) Os ratos foram tratados com ou Pan02 Pan02 + 11D1.16.8 e foram avaliados quanto à perda bruta de massa corporal magra. (G) As coortes de ratinhos foram também testados para a variação da massa corporal magra (n = 10 /grupo; * p 0,05).

A caquexia pode ser associado com o motor e disfunção cognitiva [48]. Na avaliação do comprometimento motor notamos melhora da função em ratos portadores de tumor tratados com inibidor de TGF-β medida pelo maior velocidade rotarod em execução em comparação com camundongos administrados Pan02 sozinho. Por outro lado, a ligeira melhoria no teste de reconhecimento de objetos em camundongos Pan02 de suporte que foram tratados com 1D11.16.8 não alcançou significância estatística (S5 Fig). Colectivamente, estes dados sugerem que a segmentação TGF-β é uma estratégia atraente para a segmentação caquexia associada ao câncer de pâncreas.

Discussão

Nós validado um modelo murino singeneicos da caquexia PDA metastático através de injeção peritoneal da célula Pan02 linha. Os ratinhos desenvolveu evidência de metástases de fígado peritoneais e implantes, o que corresponde com PDA clínica [1]. Além disso, a taxa de sucesso deste modelo é próxima a 100%, com quase todos os ratinhos tratados Pan02 desenvolver síndrome caquexia associada ao câncer como evidenciado pela significativa perda de peso, diminuição da gordura e massa corporal magra, proteólise e lipólise.

o presente estudo, mostramos que nem eliminação genética de TLR9 nem bloqueio de TLR7 /9 usando IRS 954 alteraram significativamente as alterações metabólicas associadas a caquexia associada ao câncer de pâncreas. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo para investigar especificamente a eficácia do bloqueio de TLR para o tratamento da caquexia no PDA, embora nós e outros têm mostrado previamente que TLRs desempenhar um papel importante na patogénese de cancro pancreático [49]. Por exemplo, Schwartz et ai. mostrou que TLR3 foi constitutivamente expressa em linhas celulares de cancro pancreático humano, e bloqueio com TLR phenylmethimazole inibiu o crescimento do tumor do cancro do pâncreas in vivo [26]. Além disso, a activação por LPS de sinalização TLR4 /MyD88 tem mostrado desempenhar um papel importante no crescimento do tumor do cancro do pâncreas e migração, e o bloqueio desta via diminui a capacidade do tumor invasivo [29]. Além disso, o nosso laboratório tem mostrado anteriormente que a activação de RST4 e TLR7 acelera carcinogénese pancreático [22, 50]. Outros mostraram que TLR9 se correlaciona com o potencial invasivo e metastático de linhas celulares de cancro pancreático humano [23].

Com base nos dados acima referidos e o facto de TLRs são mediadores centrais de produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF -α e IL-6, que desempenham um papel importante na patogénese da caquexia do cancro [43, 51], a hipótese de que o bloqueio de TLR pode ser terapêutico em caquexia do cancro do pâncreas. As citocinas liberadas após a ativação TLR pode, teoricamente, contribuir para a síndrome da caquexia do câncer através da indução de proteólise, lipólise, e outras alterações metabólicas por meio de transcrição NF-κβ [52]. No cancro do pâncreas avançado, as citocinas pro-inflamatórias são produzidas a partir das células cancerosas si, bem como pelo fígado, como parte da resposta de fase aguda. Curiosamente, níveis aumentados de citocinas são pensados ​​para ser pobres em factores de prognóstico caquexia, como estudos têm demonstrado que a IL-6 polimorfismos e níveis elevados de IL-6 está associada com o aumento da caquexia e diminuiu a sobrevivência em doentes com cancro pancreático [53]. Nosso modelo de caquexia associada ao câncer de pâncreas foi associada com aumentos acentuados nos níveis séricos de IL-6. No entanto, a IL-6 permaneceram elevados após TLR7 /9 bloqueio. Mais importante, nem TLR7 /9 bloqueio nem eliminação genética de TLR9 melhorou a mortalidade global ou as alterações metabólicas da caquexia pâncreas em nosso modelo de rato validado. Esses resultados negativos podem sugerir que uma maior segmentação jusante de vias de receptores Toll-like, como NF-κβ de sinalização, são obrigadas a alterar os efeitos da caquexia.

Mais crítico, descobrimos que os ratos tratados com TGF-β inibidor melhorou a sobrevida global, e protegidas da caquexia associada ao câncer, conforme medido pela perda de peso, massa corporal magra, massa gorda, dobras cutâneas, e densidade mineral óssea. Nós também mostrou que o tratamento com 1D11.16.8 diminuiu proteólise e melhoria limitada induzida em deficiência neurocognitiva em nosso modelo de rato Pan02, como evidenciado pela diminuição da massa corporal magra e pontuações melhoraram na velocidade rotarod em execução. Na verdade deficiências cognitivas têm sido bem descrita em pacientes caquéticos [48, 54, 55]. Além disso, mostrámos que os efeitos do bloqueio de TGF-β sobre caquexia não são específicos para Pan02 hospedeiros de tumor, uma vez que os nossos resultados validado em um modelo animal PDA KPC-derivado.

A superfamília do TGF-β, incluindo TGF -β

1, TGF-β

2 e TGF-β

3, está envolvida em diversos processos celulares, incluindo crescimento e diferenciação celular, angiogénese, imunossupressão, apoptose, e homeostase celular [25]. Além disso, o TGF-β desempenha um papel importante na supressão de tumores através da inibição do crescimento das células através da indução do inibidor de ciclo celular, p21 [56]. As proteínas Smad, são a principal família de factores de transcrição que se propagam sinalização de TGF-β. A família Smad consiste em R Smads, Smad 2 e Smad 3, que após fosforilação, associado com o Co-Smad, Smad 4, e entrar no núcleo para ativar a transcrição [26]. Interessante, mostramos que ambos p21 e Smad 2/3 eram altamente upregulated em ambos os nossos modelos de rato transgénico Pan02 e KPC de câncer de pâncreas. No entanto, verificou-se que o efeito de inibição de TGF-β na caquexia não foi relacionada com a inibição do crescimento do tumor, como evidenciado pela diferença na proliferação celular in vitro ou Pan02 crescimento do tumor subcutâneo.

O nosso estudo contribui para uma grande variedade de pesquisa que investiga o papel de TGF-β no PDA. Devido ao seu efeito em muitos processos celulares, alterações na sinalização de TGF-β têm sido implicados ter um papel importante na patogénese e progressão de muitas cancros [26, 57, 58]. É amplamente aceite, no entanto, que o TGF-β tem funções tanto como um supressor tumoral e promotor tumoral no PDA, dependendo da fase do tumor e meio celular [24, 59]. Por exemplo, quase 100% dos tumores pancreáticos têm uma mutação em pelo menos um dos genes da via de TGF-β, e mais de 50% têm deleção do gene em SMAD4 (DPC4) [26]. No entanto, ao mesmo tempo, os níveis séricos elevados de TGF-β

1 têm sido associados com um risco aumentado de desenvolvimento de PDA, e os pacientes de PDA com coloração nuclear baixa de TGF-βR2 e alta TGF-β

1 níveis podem ter menor sobrevivência global [58, 60]. Além disso, SMAD4 parece desempenhar um papel fundamental na progressão da PDA tumorig�ese através de efeitos sobre o microambiente do tumor.