Abstract

Fundo

T célula imunoglobulina-3 (TIM-3), foi estabelecido como uma molécula reguladora negativa e desempenha um papel crucial na tolerância imunológica. TIM-3 é regulada em exausto CD8

células T +, tanto a infecção crônica e tumor. Contudo, a natureza da TIM-3

+ CD4

+ células T no microambiente do tumor não é clara. Este estudo é caracterizar TIM-3 linfócitos expressando dentro dos tecidos de câncer de pulmão humanos e estabelecer significado clínico de expressão TIM-3 na progressão do cancro do pulmão.

Metodologia

Um total de 51 tecido de câncer de pulmão humano espécimes foram obtidos a partir patologicamente confirmado e recém-diagnosticados pacientes não-pequenas de câncer de pulmão de células (NSCLC). Leucócitos de tecidos tumorais, tecidos pulmonares normais e distais, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram analisados ​​por TIM-3 expressão à superfície por citometria de fluxo. TIM-3 expressão em linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) foi correlacionada com os parâmetros clínico.

Conclusões

TIM-3 é altamente regulada em ambos CD4

+ e CD8

+ TILs a partir de tecidos de cancro do pulmão humanas, mas insignificantemente expresso em células T do sangue periférico dos pacientes. Frequências de IFN-γ

+ células foram reduzidos em TIM-3

+ CD8

+ TIL comparação com TIM-3

-CD8

+ TIL. No entanto, o nível de expressão TIM-3 em CD8

+ TIL falhou para associar com qualquer parâmetro clínico patológico. Curiosamente, descobrimos que aproximadamente 70% da TIM-3

+ CD4

+ TIL expressa FOXP3 e cerca de 60% do FOXP3

+ TIL foram TIM-3

+. Importante, expressão TIM-3 em CD4

+ células T correlacionadas com os parâmetros clínico pobres de NSCLC, como metástase nodal e estágios de câncer avançado. O nosso estudo revela um novo papel de TIM-3 como um importante regulador imunológico no microambiente do tumor através da sua expressão predominante nas células T reguladoras

citação:. Gao X, Zhu Y, Li G, Huang H, Zhang L , Wang, F. et al. (2012) TIM-3 Expressão Caracteriza As células T reguladoras em tecidos tumorais e está associada com o câncer pulmonar progressão. PLoS ONE 7 (2): e30676. doi: 10.1371 /journal.pone.0030676

Autor: Michael P. Bachmann, Carl-Gustav Carus Technical University-Dresden, Alemanha |

Recebido: 13 de outubro de 2011; Aceito: 20 de dezembro de 2011; Publicação: 17 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Gao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é parcialmente suportado pelo NSFC (National Natural Science Foundation da China) concede 30528008, Programa de Changjiang Estudiosos e Equipe de Pesquisa inovativa em University (IRT0849) e um projecto financiado pela Prioridade Academic Programa de Desenvolvimento de Jiangsu Instituição de Ensino Superior (PAPD) (a BL e XZ). BL foi parcialmente apoiado pela Young Investigator Award da Cancer Research Institute e da Universidade de Pittsburgh fundo de arranque. QY é apoiada por onze Quinta Mega-Científica Projeto sobre “prevenção e tratamento da AIDS, hepatites virais e outras doenças infecciosas” (2008ZX10003-012). GL e XG são apoiados por uma bolsa da China Conselho de Bolsas de Estudo. YZ é suportado por NSFC concessão 31170866, Jiangsu Natural Ciência Fundo BK2011289 e Projecto Desenvolvimento Social Suzhou (SYS201009). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O desenvolvimento de tumores induz respostas imunes antitumorais. Tipo 1 adaptativas respostas imunes, mediadas por células Th1 e CTL, são pensados ​​para ser um componente crítico da imunidade mediada por células contra o cancro [1]. Tem sido bem estabelecido, no entanto, que as células T infiltrantes de tumor muitos estão num estado de incapacidade de resposta devido ao microambiente do tumor supressor imunitário [2], [3]. As células T reguladoras e exaustão de células T efectoras são considerados dois principais mecanismos intrínsecos células T que tornam as respostas imunitárias anti-tumor ineficazes [2], [4], [5]. Várias vias moleculares, tais como TGF-p, IL-10, membros da família B7, estão envolvidos no estabelecimento do estado de imunossupressão dentro do tumor [2], [6], [7], [8]. A compreensão do papel das novas vias inibitórias imunes na mediação da tolerância imunológica no microambiente tumoral deve ajudar a melhorar a imunoterapia do cancro.

TIM-3 é expressa em Th1, Th17 células, e as células T CD8 +, mas não as células Th2 [9], [10], [11]. Interacção entre a TIM-3 e o seu ligando de galectina-9 inibe respostas Th1 e Th17 [12] e induz a tolerância periférica [13], [14], apoiando um papel inibitório da TIM-3 em respostas de células T. TIM-3 expressão também identifica células T exaustos durante a infecção crónica. TIM-3 que expressam CD4

+ e CD8

+ T células produzem quantidades reduzidas de citocina ou são menos proliferativa em resposta ao antigénio. O bloqueio da via de sinalização TIM-3 restaura a proliferação e aumenta a produção de citocinas em células T específicas para HIV-1 [15]. Estudos recentes têm apoiado um papel importante da TIM-3 exaustão de células T no câncer. Tm-3 e DP-1, um outro marcador de exaustão de células T, são co-expressos em células CD8 TILs em ratinhos portadores de tumores transplantados, bem como sobre o NY-ESO-1-CD8 específicas,

+ de células T em pacientes com melanoma avançado [4], [5]. TIM-3

+

+ sup células DP-1 T apresentam o fenótipo exausto mais grave, tal como definido pela falta de proliferar e produzem IL-2, TNF, e IFN-γ. O bloqueio de ambos Tim-3 e PD-1 caminhos é mais eficaz no controle do crescimento tumoral do que a segmentação cada via sozinho, sugerindo que estes dois caminhos trabalham sinergicamente no estabelecimento de exaustão de células T [4], [5].

neste estudo, nós investigamos a expressão TIM-3 em TIL no cancro do pulmão de pequenas células nenhum (NSCLC). Descobrimos que a TIM-3 é expresso em ambos CD4

+ e CD8

+ TIL em tecidos de câncer de pulmão. Ambos TIM-3

+ CD4

+ e TIM-3

+ CD8

+ células T produzidas níveis muito reduzidos de IFN-γ em comparação com aqueles na TIM-3

-CD4

+ e TIM-3

-CD8

+ células T, respectivamente. Curiosamente, a expressão TIM-3 em CD4

+ células T mas não CD8

+ células T correlacionadas com os parâmetros clínico pobres de NSCLC, como metástase nodal e estágios de câncer avançado. Surpreendentemente, aproximadamente 70% da TIM-3

+ CD4

+ TIL expressa FOXP3 e cerca de 60% do FOXP3

+ TIL foram TIM-3

+. Em contraste, a TIM-3 foi minimamente expressa em células CD4 + periféricas células

T, Tregs e CD8

células + T. Estes dados sugerem um novo papel da TIM-3 em tumores associados células T reguladoras e sua importância na progressão do cancro humano.

Materiais e Métodos

Seleção de amostras de tecido

A total de amostras de tecido de câncer de pulmão 51 foram obtidos a partir patologicamente confirmado e diagnóstico recente de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) pacientes que receberam operação a partir de outubro 2009 a maio de 2011 em Cirurgia Cardiotorácica do Departamento de Primeira Affiliated Hospital, Universidade Soochow no presente estudo . Além disso, 51 casos de tecidos normais adjacentes a partir da parte não-maligno foram ressecados e escolhida como controlos. Os tecidos normais foram, pelo menos, 5 cm de distância da massa de tumor visível. células mononucleares autólogas do sangue periférico (PBMC) foram isoladas a partir de sangue total por centrifugação de Ficoll gradiente de densidade antes da operação. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Primeira Affiliated Hospital da Universidade de Soochow. Os dados foram analisados ​​de forma anónima e consentimento informado não era necessária.

Colheita de linfócitos infiltram no tumor (TIL)

O tecido tumoral e tecido normal adjacente do mesmo paciente foram picadas e digerida com solução de colagenase digestão (1 mg /ml de colagenase IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) em meio RPMI 1640) a 37 ° C durante 45 min. Os pedaços foram em seguida transferidos para a malha de aço e suspensões de células individuais foram obtidos por moagem mecânica. TILs foram ainda purificadas por gradiente de acordo com o protocolo do fabricante, lavadas e re-suspensas em meio de Hank para diversas análises.

Ratos

6-8 semanas de idade, fêmea C57BL /6 foram utilizado em experiências de tumores. Todos os animais foram mantidos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos no biotério da Universidade de Pittsburgh ou Universidade Soochow. Todo o trabalho animal tenha sido aprovado pelo Comité de Instituição animal Cuidado e Uso da Universidade de Pittsburgh (protocolo número 0906824). Para as experiências de modelo de tumor, os ratinhos foram desafiados com 2 × 10

5 B16F0 células d.i. e amostras de tumor foram retirados para análise em torno do dia 20, como descrito anteriormente [16].

In vitro T estimulação celular

células T naive foram purificados a partir PBMC de dadores saudáveis, utilizando anticorpos que destroem anti-CD45RO e kit de enriquecimento de células T humanas Stemsep® (tecnologias StemCell, Vancouver, British Columbia, Canadá). A pureza das células T foi mais do que 90%. As células foram estimuladas com 1 ug /ml de placa ligado anti-CD3 (clone OKT3) e 2 ug /mL de anti-CD28 mAbs por até 72 horas.

para isolar Tregs, as PBMC foram corados com ligado placa- ficoeritrina-cianina Dye7 (PECY7) conjugada com mAb anti-CD4 (T4-RPA) e anti-CD25 ficoeritrina (PE) (BC96). Um citômetro MoFlo (Beckman-Coulter, Brea, CA EUA) foi usado para isolar CD4

+ CD25

células de alta. Estas células foram depois estimuladas com anti-CD3 (1 ug /ml) e anti-CD28 (2 ng /ml) na presença de IL-2 (200 U /ml, R D Systems, Minneapolis, MN, EUA). 24, 48, e 72 horas mais tarde, as células foram colhidas para análise posterior

Os anticorpos e análise citométrica de fluxo

foram usadas directamente conjugado anticorpos anti-humanos contra as moléculas da superfície das seguintes:. Anti-CD4 (RPA-T4) e anti-CD8 (RPA-T8) foram obtidos a partir da Beckman Coulter. Anti-TIM-3 (344823), anti-DP-1 (2H7), e anti-CD25 (BC96) foram adquiridos a partir de R D Systems. Os seguintes anticorpos monoclonais específicos para antigénios de rato foram adquiridos à eBioscience (San Diego, CA, EUA): CD4 (GK1.5), CD8 (53-6,7), Tim-3 (RMT3-23) e Foxp3 (FJK-16) . Análise citométrica de fluxo foi realizada utilizando um FACS citómetro de fluxo.

Para a coloração de citocinas intracelulares, TILs humanos foram colhidas a partir de amostras de cancro do pulmão, estimuladas com ligado à placa anti-CD3 mAb (1 ug /ml) e placa-ligado anti-CD28 mAb (2 ug /ml) durante 16 horas e incubou-se durante as últimas 3 horas com Brefeldina a (10 ug /ml, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As células foram transferidas para uma placa de fundo em V, corados com anti-CD4 ou anti-CD8 em tampão de Hank (contendo 1% de FCS), em seguida, fixo com o meio de fixação, o que foi seguido por meio de permeabilização (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) . As células foram, subsequentemente, corados com anticorpo anti-IFN-γ (4S.B3, BioLegend, San Diego, CA, EUA). Células produtoras de IFN-γ foram examinados com citometria de fluxo.

Para a análise de expressão FOXP3, TIL foram primeiramente coradas com os anti-CD4-PECY7, anti-CD25-PECY5 e anti-TIM-3-PE ou anti -PD-1-PE, após fixação e permeabilização, as células foram incubadas com conjugado com FITC FOXP3 anti-humano (259d, BioLegend, San Diego, CA, EUA), com base nas recomendações do fabricante e submetidas a análise citométrica de fluxo.

A análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism pacote 5.0 software (GraphPad software, Inc., San Diego, EUA). Teste t de Student, ANOVA one-way e diferença mínima significativa (LSD) teste -t ​​foram usados ​​quando apropriado. Os valores de p inferior a 0,05 foi considerado como sendo estatisticamente significativo.

Resultados

Desde TIM-3 está envolvida em exaustão de células T, decidimos investigar a sua expressão no TIL em amostras de câncer de pulmão. Leucócitos de tecidos tumorais, tecidos pulmonares normais distais, e as PBMC foram analisadas por TIM-3 expressão à superfície por citometria de fluxo. A coloração não específica foi controlada pelo anticorpo de controlo do isotipo IgG (Figura S1). Mais de 90% de CD4

+ células foram positivas para CD3, após o nosso procedimento de purificação e selecção dos linfócitos durante a análise de citometria de fluxo. No nosso grupo de doentes do cancro do pulmão, verificou-se que a TIM-3 foi expressa, em média, cerca de 30% das células CD4

+ TIL e CD8

+ TIL (Figura 1A e 1B). A percentagem de TIM-3

+ CD4

+ e TIM-3

+ CD8

+ TIL nos tecidos pulmonares normais distais reduzida para aproximadamente 18% e 15% respectivamente (Figura 1A e 1B) . Em contraste, não havia expressão insignificante de TIM-3 nas células T do sangue a partir desses doentes (Figura 1A e 1B). Portanto, a TIM-3 foi especificamente expressão sobre-regulada em células T nos tecidos pulmonares normais e ainda aumentada no tecido de cancro. Um relatório recente mostrou que, em CMSP isoladas a partir de doentes de melanoma avançado, uma fracção de DP-1

+ NY-ESO-1-CD8 específicas,

+ células T co-expressa TIM-3 e DP-1 e estes As células foram mais disfuncional do que TIM-3

-PD-1

+ e TIM-3

-PD-1

– homólogos [4]. Em seguida, estudaram a expressão PD-1 e TIM-3 em TIL de tecidos de câncer de pulmão. PD-1 foi expresso em mais de 65% de TIL de ambos os tecidos pulmonares normais e de cancro (Figura 1C). Maioria da TIM-3

+ TIL foram PD-1

+ nos tecidos pulmonares. Em contraste, 10% das células T do sangue periférico foram positivos para a DP-1 (Figura 1C). Assim, descobrimos que um grande número de TIM-3

+ PD-1

+ T células foram enriquecidos em tecidos de câncer de pulmão. Isto é consistente com o fato de que muitas das células T nos tecidos cancerosos são disfuncionais provavelmente devido a exaustão ou anergia.

tumor infiltrando linfócitos (TIL) foram colhidas a partir de tecidos de câncer de pulmão, os tecidos normais adjacentes, e sangue periférico monouclear células (PBMC) a partir de sangue total de doentes. As células foram então coradas para CD4, CD8, a TIM-3 e DP-1. A. representativos dot-gráficos mostram expressão TIM-3 em CD4

+ e CD8

células + T em vários tecidos de pacientes com câncer de pulmão. Os linfócitos foram fechado para posterior análise das células T CD4 e CD8. Mais de 90% CD4

+ ou CD8

+ células foram CD3

+. B. Resumido resultados da porcentagem (%) de expressão TIM-3 em CD4

+ e CD8

células + T de pacientes com cancro do pulmão são mostrados. As barras horizontais representam a percentagem média de expressão TIM-3 em CD4

+ e CD8

células + T. As barras de erro: S.E.M. C. expressão dupla da TIM-3 e PD-1 em CD4 fechado

+ e CD8

+ T células é mostrado. Os valores de p foram calculados usando o one-way ANOVA.

Uma vez que foi mostrado que antígeno-específica TIM-3

+ CD8

+ células T são funcionalmente esgotado na crónica pacientes com infecção e câncer, decidimos estudar se TIM-3 também marcou as células T disfuncionais em TIL em tecidos de câncer de pulmão. TILs foram estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28 durante 16 h, e analisadas para a produção de IFN-γ por citometria de fluxo. Verificou-se que, em média, 5% TIM-3

-CD8

+ TIL são IFN-γ

+ após estimulação ex vivo com anti-CD3 (Figura 2A, 2C). Em contraste, a frequência de produtores de IFN-y foi significativamente reduzida na TIM-3

+ CD8

+ TIL (Figura 2A, 2C). Assim, nossos dados são consistentes com a ideia de que a TIM-3 marcas de exaustão funcional de células T CD8 em tecidos de câncer humano, em manter com a recente descoberta utilizando modelo de tumor do rato transplante [5].

TIL foram colhidas a partir tecido de câncer de pulmão. As células foram então estimuladas com ligado à placa anti-CD3 mAb (1 ug /ml) e em forma de placa ligado anti-CD28 mAb (2 ug /ml) durante 16 horas e incubou-se durante as últimas 3 horas com Brefeldina A (10 ug /ml ). As células produtoras de IFN-γ foram examinados com coloração citoquina intracelular e citometria de fluxo. (A e B). gráficos de pontos representativos de um paciente mostrou a percentagem de TIM-3

+ IFN-γ

+ e TIM-3

-IFN-γ

+ dentro CD8

+ ou CD4

+ compartimento de células T. Os dados apresentados são representativos de seis experiências independentes. C. O percentual médio de IFN-γ-produzir CD8

+ ou CD4

+ T células entre TIM-3

+ e TIM-3

– frações é mostrado

.

Além CD8

+ TIL, TIM-3 foi expressa em células CD4

+ TIL no cancro humano do pulmão (Figura 1), bem como no tumor transplantado rato [5]. Tm-3 também foi altamente expressa em células Th1 e Th17 e importante para a inibição da função destas células [10]. Se TIM-3 marcas CD4 disfunção das células T +

é, no entanto não é certo. Em seguida, defina a examinar a frequência de IFN-y produtoras de CD4

TIL + com respeito a TIM-3 a expressão de superfície. Foram encontradas cerca de 2% da TIM-3

-CD4

+ TIL eram produtores de IFN-gama após estimulação ex vivo com anti-CD3 (Figura 2B). Em contrapartida, a percentagem de IFN-γ

+ células foi significativamente reduzida no TIM-3

+ CD4

+ TIL (Figura 2B e 2C).

É bem estabelecidas que regulamentar As células T são uma população predominante de células CD4

+ células T entre TIL [3]. Porque Tregs também são funcionalmente anérgicas, nós então decidido determinar se TIM-3 é expressa em células T reguladoras entre os TILs FOXP3 utilizando como marcador. Para nossa surpresa, embora cerca de 17% do CD4

+ TIL foram FOXP3

+ Tregs, cerca de 70% da TIM-3

+ CD4

+ TIL foram FOXP3

+ (Fig. 3A). Além disso, cerca de 60% do FOXP3

+ CD4

+ TIL expressa TIM-3 na sua superfície (Fig. 3A). Assim, TIM-3

+ CD4

+ células T eram predominantemente Tregs e mais de Tregs no prazo de câncer de pulmão TIL altamente regulado para cima expressão TIM-3. De acordo com esses dados, todos FOXP3

+ CD4

+ TIL expressar PD1 (Fig. 3B). Em contraste com a expressão elevada de TIM-3 em TIL, expressão mínima de TIM-3 foi encontrado em células T convencionais nem nem Tregs no sangue periférico (dados não mostrados).

TILs foram colhidas a partir de tecido do cancro do pulmão. As células foram então coradas para CD4, TIM-3, e FOXP3 (A) ou CD4, PD-1, e FOXP3 (B). Os linfócitos foram fechado para posterior análise das células T CD4 e CD8. A percentagem de cada população dentro CD4 foi indicada compartimento da célula

+ T. Os dados apresentados são representativos de cinco experiências independentes.

Desde TIM-3 mostrou ser regulada positivamente em células T após a cultura in vitro na presença de estimulação de TCR [10], decidimos analisar se Tregs poderiam ser estimulados a expressar TIM-3. Como um controlo, CD4 humano

+ e CD8

+ células T foram estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28 durante 72 horas. A cada 24 horas, examinámos TIM-3 e DP-1. Ambos PD-1 e TIM-3 foram regulados positivamente em cerca de 48 horas e mais up-regulada a 72 h, tanto CD4

+ e CD8 +

T (Fig. 4A e 4B). Em seguida, testou-se se a TIM-3 pode ser semelhante regulados positivamente em células T reguladoras. Nós enriquecido Tregs humanos através do isolamento de CD4

+ CD25

células T utilizando elevadas de células activadas por fluorescência (FACS). Em seguida, estas células T estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28 na presença de IL-2 durante 72 h. A expressão de TIM-3 e FOXP3 foi examinada às 48 h e 72 h. TIM-3 é expressa em níveis negligenciáveis ​​em ambos não estimulada naïve CD4

+ T e células Tregs (dados não mostrados). Em comparação com as células T não estimuladas, a TIM-3 expressão foi significativamente regulada para cima em 48 h e ainda aumentada às 72 h (Fig. 4C). Às 72 horas de cerca de 25% do FOXP3

+ células T foram TIM-3 positiva (Fig. 4C). Colectivamente, estes dados sugerem que a TIM-3 é sobre-regulada em ambas as células T convencionais e Tregs após estimulação via TCR.

(A e B). células T naive humanas foram purificadas a partir de PBMC de doadores de saúde. As células foram então estimuladas com ligado à placa anti-CD3 mais anti-CD28 mAb. 24, 48 e 72 horas mais tarde, as células foram recolhidas e coradas para CD4, CD8, a TIM-3 e DP-1. A expressão de DP-1 e TIM-3 foi analisada por citometria de fluxo em células CD4 fechado

+ (A) ou CD8

+ (B) As células T. C. CD4

+ CD25

células T elevados foram isolados a partir de sangue periférico por FACS. Estas células foram então estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28 na presença de IL-2 (200 U /mL). 24, 48 e 72 horas mais tarde, as células foram colhidas e coradas para CD4, TIM-3 e FOXP3. A expressão da TIM-3 em CD4

+ FOXP3

+ células T é mostrado. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Desde TIM-3 é altamente expressa em TILs isolados a partir de tecidos de cancro do pulmão, que, em seguida, determinar se TIM-3 expressão tinha qualquer significado clínico por expressão correlacionando TIM-3 com os parâmetros patológicos clínicos. Nós descobrimos que o percentual de CD4

+ e CD8

+ células T dentro TIL não foi associado com os parâmetros patológicos clínicos. A proporção de células T CD4 CD8 contra também não mostraram qualquer significância clínica (Tabela 1). Além disso, a frequência de TIM-3 nas células T CD8 + não mostraram qualquer significância clínica (Tabela 2). Em contraste, a maior frequência de TIM-3

+ CD4

+ TIL mostrou associação significativa com metástases em linfonodos e estágios do câncer mais avançados (Tabela 2). Assim, a expressão TIM-3 em CD4

+ TIL está associada com a progressão do câncer de pulmão.

Além de FOXP3 humana

+ TIL, examinamos a Tim-3 expressão no rato Foxp3

+ TIL. Usamos o modelo B16, porque Tim-3

+ CD4

+ TIL foram recentemente descritas neste modelo [5]. Dentro do tumor B16, encontramos cerca de 50% do Foxp3

+ CD4

+ TIL expressa Tim-3 (Fig. 5). Em contraste, Foxp3

-CD4

+ TIL expressaram níveis insignificantes de Tim-3 (Fig. 5). Tim-3 foi expresso em níveis mínimos no baço e linfonodos CD4

+ T células independentemente da expressão Foxp3 (Fig. 5). Assim, Tim-3 é predominantemente presente em um subconjunto de Foxp3

+ CD4

+ células T reguladoras em ambos os tumores humanos e de rato.

6-8 semanas de idade C57BL /6 foram inoculados com 2 x 10

5 B16F0 células de identificação, amostras de tumor, baço e gânglios linfáticos foram removidos quando os tamanhos de tumor atingiram cerca de 15 mm de diâmetro no dia 20. Tils, esplenócitos e células de nódulos linfáticos foram isolados para análise por fluxo citometria. Tim-3 expressão no rato CD4

+ Foxp3

+ ou CD4

+ Foxp3

– células T é mostrado. Os dados apresentados são representativos de cinco experimentos independentes.

Discussão

Neste estudo, nós examinamos a expressão TIM-3 em TIL partir de amostras de NSCLC. Encontramos níveis elevados de expressão TIM-3 em ambos CD4

+ e CD8

+ TIL. É importante ressaltar que, embora a expressão TIM-3 superfície foi relatado para indicar um estado funcionalmente an�gicas de CD8

+ TIL, descobrimos que a expressão TIM-3 em CD8

+ TIL não se associar com os parâmetros clínico em câncer de pulmão, no entanto, a frequência de expressão TIM-3 em CD4

+ TIL se associar com metástases em linfonodos e estágios do câncer mais avançados. Uma análise posterior revelou que a TIM-3

+ CD4

células + T foram predominantemente FOXP3

+ e maioria dos FOXP3

+ células T CD4 +

manifestou TIM-3. Nosso estudo revela um novo papel da TIM-3 no microambiente do tumor através da sua expressão predominante nas células T reguladoras.

É interessante que temos encontrado expressão da TIM-3 em uma grande proporção de Tregs no prazo de câncer de pulmão tecidos. Nossa mineração de dados também revelou que mRNA Tim-3 foi expressa em naturais Foxp3

+ CD4

+ células T que foram adoptively transferidos para camundongos deficientes RAG1 e Foxp3 é necessária para a expressão Tim-3 nestas células Treg (Figura S2) [17], sugerindo expressão Tim-3 em Tregs pode ser uma parte integrante da rede de Foxp3-regulamentada no prazo Tregs natural. Temos ainda mostrado que a TIM-3 não é expresso constitutivamente por Tregs no sangue periférico humano, mas pode ser induzida por estimulação de TCR. A razão que a TIM-3 é altamente expressa em FOXP3

+ CD4

+ TIL pode ser devido a estimulação constante por antígenos associados a tumores no local do tumor.

O papel exato da TIM-3 em o tumor infiltrando Tregs ainda não é conhecido. Nossos dados sugerem que a TIM-3

+ Tregs em tecidos de câncer de pulmão pode ser derivado de Tregs naturais com a estimulação TCR crônica por antígenos tumorais. PD-1 ligando B7-H1 e TIM-3 ligantes tais como a galectina-9 e células em apoptose no tecido tumoral pode ser importante para a manutenção do número e função das TIM-3

+ PD-1

+ Tregs. Na configuração de transplante, Tim-3 foi mostrado para regular a activação Treg aloespecifica [14]. Foi demonstrado que, via Tim-3-Tim-3L-sensíveis estava envolvida na geração de Tregs funcional específica do doador com a administração de tratamentos tolerizante [14]. Consistente com esta ideia, Tim-3 foi recentemente relatado para ser expresso em cerca de 15% de Foxp3

+ Treg células do baço durante a alo-transplante [18]. O nosso estudo, ao revelar níveis elevados de expressão TIM-3 em Tregs dentro de tumores humanos, sugere que a TIM-3 pode desempenhar um papel directo na maturação funcional do tumor infiltrating Tregs, fornecendo um sinal dentro Tregs ou pode ser importante para a manutenção do imunossupressor função destes Tregs no microambiente tumoral.

Além Tregs natural, TIM-3 e DP-1 pode também desempenhar um papel na geração de Tregs adaptativa. Na verdade, PD-1 ligando foi mostrado estar envolvida na geração de Tregs adaptativo na drenagem do tumor nódulos linfáticos [19]. foi mostrado galectina-9 para aumentar modestamente a expressão de Foxp3 modelo in vitro de indução Tregs por TGF-β [18], [20]. Se o Tregs encontrada em nossos estudos são adaptáveis ​​ou naturais Treg estará sujeito a um estudo mais aprofundado.

TIM-3 emergiu como um alvo promissor para imunoterapia de câncer [21]. Estudos recentes têm-se centrado no papel da expressão TIM-3 em CD8

+ células T no sangue periférico, bem como no interior dos tumores [4], [5]. Estes estudo demonstrou elegantemente que a TIM-3 marcas funcionalmente esgotado células T +

CD8 e é provável responsável pelo fracasso da vigilância imunológica e tumor vacinação. Nosso estudo mostra que a expressão da TIM-3 em CD4

+ células TIL significativamente associada a piores parâmetros patológicos clínicos em câncer de pulmão. Portanto, a TIM-3 desempenha provavelmente um papel significativo na progressão do tumor através da manutenção do ambiente imunossupressor tumoral através Tregs. Além disso caracterização da TIM-3 expressão e função dentro de vários subconjuntos Tils deve melhorar o nosso conhecimento dos mecanismos subjacentes da imunossupressão TIM-3 mediada por dentro microambiente do tumor.

Informações de Apoio

Figura S1.

expressão TIM-3 por citometria de fluxo. os linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) foram colhidas a partir de tecidos de cancro do pulmão, os tecidos normais adjacentes, e células monouclear do sangue periférico (PBMCs) a partir de sangue total de doentes. As células foram então coradas para CD4 e TIM-3 ou células CD4 além de um anticorpo IgG de controlo. As células na delimitação de linfócitos foram ainda analisados ​​para CD4 e expressão TIM-3

doi:. 10.1371 /journal.pone.0030676.s001

(PPT)

Figura S2.

expressão Tim-3 em Tregs nativas e sua dependência de Foxp3. banco de dados de perfil NCBI GEO foi consultado para a expressão Tim-3 em Tregs. Um resultado mostrou que Tim-3 é regulada para baixo no Foxp3 Tregs nativas deficientes imediata. DataSet Grave GDS2525

doi:. 10.1371 /journal.pone.0030676.s002

(PPT)

Reconhecimentos

Os autores agradecem os Drs. Olivera Finn, Larry Kane, e Lujun Chen para a leitura do manuscrito e discussão útil.