Abstract

O efeito de nanopartículas de ouro em células de câncer de pulmão ainda não está claro. Neste estudo, investigou-se a actividade de citotoxicidade celular e a invasão de células do cancro do pulmão, depois do tratamento com nanopartículas de ouro e mostraram que pequenas nanoparticulas de ouro pode ser sujeita a endocitose pelas células de cancro do pulmão e que eles facilitam a invasão celular. O crescimento de células A549 foi inibida após o tratamento com nanopartículas de ouro 5 nm, mas a invasão celular aumentada. Endocytosed nanopartículas de ouro (tamanho, 10 nm) nomeadamente promoveu a actividade invasão de 95D células. Todos estes efeitos de nanopartículas de ouro não foram observados após tratamento com partículas de maiores dimensões (20 e 40 nm). A actividade melhorada invasão pode ser associada com a expressão aumentada de metaloproteinase da matriz 9 e a molécula-1 de adesão intercelular. Neste estudo, foram obtidas provas para o efeito de nanopartículas de ouro sobre a actividade a invasão de células do cancro do pulmão in vitro. Além disso, da metaloproteinase de matriz 9 e a molécula-1 de adesão intercelular, moduladores chave da invasão celular, foram encontrados para ser regulada por nanopartículas de ouro. Estes dados também demonstram que as respostas da A549 e as células 95D para as nanopartículas de ouro têm uma notável relação com as suas propriedades f isico-quimicas dependem do tamanho original. Portanto, este estudo fornece uma nova perspectiva para investigação em biologia celular na nanomedicina

Citation:. Liu Z, Wu Y, Z Guo, Liu Y, Shen Y, Zhou P, et al. (2014) Efeitos da internalizado de nanopartículas com respeito a citotoxicidade e Invasion Atividade em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 9 (6): e99175. doi: 10.1371 /journal.pone.0099175

editor: Hidayatullah G. Munshi, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de fevereiro, 2014; Aceite: 12 de maio de 2014; Publicação: 05 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiada por doações do National Science Foundation da China (No.81270428 e 81.300.999). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

estudos anteriores identificaram que nanopartículas de ouro (Au-NPS) mostram pouca citotoxicidade apesar de sua captação eficiente em células humanas por endocitose [1], [2], tornando-os candidatos adequados para a nanomedicina. Para além da sua biocompatibilidade, o facto de serem fáceis de sintetizar, caracterizar, modificar e superfície contribuiu para atrair muita atenção em várias aplicações biomédicas. Au-NPs têm sido investigados como veículos de entrega de drogas e terapia fototérmica e ferramentas de imagem molecular para o potencial biodiagnosis [3], [4]. estratégias terapêuticas à base de partículas para o tratamento do cancro baseiam-se essencialmente na administração de agentes quimioterapêuticos para induzir apoptose [5]. As principais razões para a utilização de nanopartículas como veículos para a entrega terapêutica são para habilitar funcionalidades multimodais, tais como imagens ou direcionamento específico, para aumentar a permeabilidade dos tecidos e acumulação do fármaco específico do site, e para reduzir os efeitos colaterais para tecidos saudáveis ​​[6]. Actualmente, Au-NPs são utilizados em diferentes aplicações biomédicas: não só eles podem ser utilizados como suportes para a entrega de droga de cancro cada vez mais potente, mas que também podem servir como agentes de transfecção para a terapia genética selectiva e agentes antineoplásicos como intrínsecas [7] – [9] . Dreaden et ai. [8] demonstraram que o alvo Au-NPs são capazes de alterar o ciclo celular, incluindo a divisão celular, sinalização e proliferação.

Apesar de a aplicação generalizada de Au-NPs, uma compreensão clara de como os sistemas biológicos responder para as nanopartículas é vital, e a caracterização das propriedades físico-químicas dependentes de tamanho únicas do Au-NPS é um componente crítico. Um estudo anterior demonstrou que o tamanho da superfície de Au-NPs desempenha um grande papel no seu efeito terapêutico [10]. Au-NPs de diâmetro muito pequeno ( 2 nm) podem penetrar nas células e compartimentos celulares, tais como o núcleo e ser extremamente tóxicos [11]. Por exemplo, verificou-se que esférica Au-PN com um diâmetro de 1,4 nm induzir a necrose e o dano mitocondrial em várias linhas de células por meio de mecanismos de estresse oxidativo, que pode estar associada com a sua actividade catalítica conhecida em que o tamanho [12]. Um estudo recente realizado por Connor et al. [1] relataram que quantidades significativas de maior Au-PN (por exemplo, 18 nm de diâmetro) penetrar nas células, mas que estes Au-PN não são intrinsecamente tóxicos para as células humanas. Chithrani et ai. [13] estudaram a relação entre as células Au-PN e HeLa e sugere que Au-NPs entrado nas células através de endocitose mediada pelo receptor com um tamanho limite de aproximadamente 50 nm. Como não existem normas de segurança, no entanto, o efeito de Au-NPs em células ainda requer um estudo mais aprofundado.

invasão e metástase são importantes características patológicas de células cancerosas. capacidade invasiva é a única característica mais importante que distingue lesões benignas de malignas [14]. De fato, as células tumorais invasivas podem escapar a ressecção cirúrgica e ser responsável pela recorrência do tumor. Apesar dos avanços na cirurgia, quimioterapia, radioterapia e, recaída é quase inevitável na presença de uma metástase agressiva [15], [16]. O processo de invasão e metástase inclui a proliferação de células, a dissociação das lesões primárias, a degradação, e de permeação na matriz extracelular (ECM), a migração no sangue ou linfa fluxo, a adesão e crescimento de um órgão secundária [17]. Os anteriores relatórios descreveram que a molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e da metaloproteinase 9 da matriz (MMP-9) está envolvido na adesão celular de cancro, invasão, migração e, que contribuem para metástases do cancro [18]. Esses fatores têm sido considerados como biomarcadores de prognóstico para a progressão do câncer de pulmão [19]. Outros estudos sobre os efeitos do Au-NPs sobre a expressão destas proteínas são necessários.

Desde citotoxicidade pode não ser o único efeito que as nanopartículas podem induzir, neste estudo, que incidiu sobre a proliferação celular, atividade invasão, e a expressão da proteína, os quais podem ser afectadas pela presença de Au-PN. Para investigar a importância do tamanho de partícula na nanomedicina, escolhemos quatro tamanhos diferentes Au-PN (ou seja, 5 nm, 10 nm, 20 nm, 40 nm) para uma análise aprofundada deste sistema.

Finalmente , optamos por estudar esses efeitos em duas linhas de células de câncer de pulmão humano (isto é, A549 e 95D), porque o cancro do pulmão é um grande tumor maligno na China e tem incidência crescente na maioria das cidades. Em 2010, havia cerca de 600.000 novos casos de câncer de pulmão na China [20]. As taxas de morbidade continuam a subir rapidamente por causa da grave poluição do ar [21]; No entanto, o conhecimento das interações biológicas e respostas de Au-NPs com cancro do pulmão células humanas é muito limitado. Além disso, para obter uma compreensão fundamental dos processos envolvidos, sentimos que era importante concentrar-se inicialmente sobre os efeitos das nanopartículas nas células cancerosas individuais, em vez de em órgãos inteiros, onde outros fatores podem complicar a interpretação dos resultados. Portanto, o objetivo desta pesquisa foi o de fornecer uma base importante para a aplicação de Au-NPs na terapia do câncer de pulmão.

Métodos

Preparação e caracterização de citrato-tampado Au-NPs

Au-PN (5 nm e 10 nm) foram sintetizados utilizando um /uma solução de citrato de ácido tânico, ácido tânico em que desempenha o papel de um agente redutor e actos citrato como um agente de estabilização [22]. Para cada síntese, foram necessárias duas soluções iniciais: (a) 1 mL de 1% (w /v) de HAuCl

4 solução, a qual foi adicionada a 79 mL de água; e (b) uma mistura que consiste em 4 mL de 1% (w /v) de solução de citrato, 0,7 ml ou 0,1 ml de ácido tânico 1%, e água (para alcançar um volume final de 20 mL). Ambos (a) e (b) as soluções foram aquecidas a 60 ° C em banho de água e, em seguida, a solução (b) foi adicionado a (a), sob agitação constante. O resultante Au-NPs foram arrefecidos até à temperatura ambiente (TA) para as experiências subsequentes.

Sínteses de 20 nm e 40 nm Au-NPs estabilizadas por iões de citrato foram conduzidos utilizando o método de redução de citrato clássico [23] . Para cada síntese, com 100 mL de 0,01% HAuCl

4 solução foi aquecida até à ebulição. volumes seleccionados (4,5 ml ou 1,0 ml) de solução de citrato a 1% foram adicionados e a ebulição foi continuada até que a cor da solução virou para vermelho rubi. A solução Au-NPs cobertas de citrato foi arrefecida naturalmente para RT

A morfologia do Au-NPs foi observada por meio de microscopia eletrônica de transmissão. (TEM; JEM-2100EX, JEOL, Tóquio, Japão) a tensão de aceleração de 200 kV. espectros de ultravioleta-visível (UV-Vis) foram adquiridos com um espectrofotômetro Shimadzu UV-3600 na faixa de 300-1100 nm.

Cultura de Células

A549 e 95D células (Xangai Institutos de Ciências Biológicas Ciências, Academia chinesa de Ciências) foram cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% (v) de soro v /fetal de bovino (FBS), 100 unidades /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina (todos da GIBCO, Invitrogen) a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. As células foram pré-cultivadas no meio durante a noite e depois tratou-se com ou sem 50 ug /ml solução Au-NPs por um adicional de 48 h. As células foram colhidas por tripsina-ethylenediamintetraacetic ácido acético (EDTA; GIBCO, Invitrogen) desprendimento na fase de crescimento logarítmica e centrifugado. As células foram então ressuspendidas em DMEM com FBS 10% para a subcultura ou outros usos.

Captação e MET Estudos

A absorção de Au-NPs também foi examinada usando TEM. Antes da exposição à UA-NPs, as células A549 e 95D células foram plaqueadas a uma concentração de 1 × 10

6 células por prato em uma placa de cultura de 100 mm (Corning, EUA) contendo o meio de crescimento e incubadas a 37 ° C com 5% de CO

2 durante 24 h. A UA-NPs foram então adicionados. Após a exposição ao Au-NPs durante 48 h, as células foram fixadas em 3,7% (v /v) de paraf ormaldeído em salina tamponada com fosfato (PBS) durante 20 min à temperatura ambiente. Subsequentemente, foram preparadas células para análise de TEM como se segue: as células foram fixadas em 1% (w /v) de tetróxido de ósmio durante 2 h, desidratados numa série graduada de 30%, 50%, 70%, 80%, e 90% de etanol , e tratou-se três vezes com etanol a 100% durante 15 min cada. As amostras foram, em seguida, incorporado numa mistura de resina de óxido de propileno polimerizados a 80 ° C. Secções ultrafinas para TEM foram preparados utilizando uma faca de diamante e as amostras foram analisadas utilizando um microscópio electrónico de transmissão.

Ensaio de viabilidade celular

A549 95D e as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma baixa confluência (2000 células /poço), deixadas a ligar durante a noite, e tratado com Au-PN (controlo, 5 nm, 10 nm, 20 nm e 40 nm). Após 24 h, 48 h e 72 h, de um reagente de ensaio de viabilidade celular (contagem celular Kit-8, Kaiji, Nanjing) foi adicionado a cada poço e incubado durante 1, 2, 3, e 4 h, respectivamente. Os valores de absorbância a 450 nm foram registados utilizando um leitor de placas de microcultura (BioRad) e a viabilidade celular expressa como uma percentagem do controlo não tratado (a viabilidade celular 100%). O efeito do Au-NPs com diferentes tamanhos sobre a viabilidade das células foi medida em triplicado, e as experiências foram repetidas pelo menos três vezes.

Detecção de apoptose por anexina V /iodeto de propídio (PI) Coloração

as células na fase log foram semeadas numa placa de cultura de 6 poços a uma densidade de 1 x 10

5 células por poço, incubada a 37 ° C num

2 incubadora de CO, e permitiu ligar durante a noite. Após o tratamento com Au-PN (controlo, 5 nm, 10 nm, 20 nm e 40 nm) durante 48 h, a apoptose e necrose foram analisados ​​com a Anexina V-PI (BD Biosciences) kit de detecção de apoptose, seguindo as instruções do fabricante. As amostras foram analisadas utilizando um instrumento BD FACS CantoII (BD Biosciences).

Análise por Citometria de Fluxo do Ciclo Celular

As células foram colhidas utilizando 0,25% de tripsina com uma solução de EDTA mM e fixado para 12 h em 70% de etanol a 4 ° C. As células fixadas foram, então, centrifugadas a 3000 rpm durante 15 min para remover o etanol completamente. As células foram então lavadas duas vezes com 3 mL de PBS, ressuspensas em 1 mL de solução de coloração de PI, e incubadas durante 15 min à TA. A solução de coloração consistiu de 20 ug /ml de PI e 0,2 mg /ml de RNase A em PBS. As amostras foram posteriormente analisados ​​usando um instrumento BD FACS CantoII (BD Biosciences). Vinte mil eventos foram recolhidas a partir de cada amostra. As percentagens de células em G0 /G1, S, e /Tablet

Invasão Ensaio

Para o ensaio de invasão G2 e M as fases do ciclo celular foram determinados utilizando o software ModFit (BD Biosciences). , inserções de cultura de células em suspensão (8,0 mícrons de tamanho de poro) foram pré-revestidos com 50 ug /ml de Matrigel (BD Biosciences) na superfície superior. As células foram pré-cultivadas no meio durante a noite e depois tratou-se com ou sem 50 ug /ml solução Au-NPs durante mais 48 h, em seguida, as células foram colhidas e 2,5 × 10

5 as células foram plaqueadas em 200 ul de DMEM suplementado com 0,2% de albumina de soro bovino (BSA) na parte superior da câmara. O fundo do poço, adicionou-se 750 ul de DMEM contendo 5% de FBS. O ensaio de invasão foi levada a cabo durante 48 horas na incubadora de cultura de células.

As células foram fixadas através da substituição do meio de cultura na parte inferior e superior da câmara com formaldeído a 4% dissolvido em PBS. Após a fixação, durante 15 min à temperatura ambiente, as câmaras foram lavadas em PBS e coradas com violeta de cristal a 0,2% durante 10 min. Após lavagem das secções de cinco vezes mergulhando-as num grande copo cheio com dH

2O, as células (agora de cor azul) na parte superior da membrana de Matrigel foram removidos usando vários cotonetes. As células foram removidas até que não haja mais corante azul pode ser removido com os cotonetes. Em seguida, as células que permaneceram foram aqueles que tinham invadido e tinha atingido a parte inferior da membrana.

também quantificada nas células utilizando a invasão celular QCM ™ de 24 poços Invasão Fluorometric Assay (Millipore) com ECMatrix-revestido insere, de acordo com as instruções do fabricante. Este ensaio proporciona um sistema eficiente para a avaliação quantitativa da invasão de células tumorais através de um modelo de membrana basal. As células A549 e 95D foram cultivadas durante 2 d em meio completo, quer na ausência (controlo) ou na presença de Au-PN (5 nm, 10 nm, 20 nm, 40 nm). No final do tratamento, as células foram suspensas em meio isento de soro e cultivadas (2,5 x 10

5 células /250 ul) de cada inserção de uma câmara de placa alveolar. Soro (10%) foi adicionado ao meio sem soro na câmara inferior como quimioatractor. Após um período de incubação de 48 h a 37 ° C, as células não invasoras foram removidos a partir do topo das inserções. Em seguida, as pastilhas foram colocadas numa cavidade contendo uma solução de separação celular pré-aquecida limpa e incubou-se a 37 ° C durante 30 min. As inserções foram removidas dos poços, e solução tampão de lise /corante foi adicionado ao meio contendo as células isoladas, durante 15 min à TA. As misturas foram então lida com um leitor de fluorescência de placas (Bio-Tek, Synergy HT), utilizando um conjunto de filtros de 480/520 nm. As medições de fluorescência foram relatados como valores unitários fluorescência relativa (RFU).

quantitativa Transcrição Reversa de Reacção em Cadeia da Polimerase (qRT-PCR)

O ARN total foi isolado a partir de não tratada e Au-NPS-tratada A549 e 95D células utilizando Trizol Reagent (Invitrogen Life Tecnologia). reacção de transcrição reversa (RT) foi realizada utilizando 1 ug de ARN total, que foi transcrito de forma inversa em ADNc utilizando iniciador oligo dT, e, em seguida, qRT- PCR foi realizada utilizando o SYBR Verde mistura (Applied Bio-Systems). As sequências dos iniciadores utilizados para a PCR foram como se segue: ICAM-1, ACACTAGGCCACGCATCTGAT para a frente, reverso AGCATACCCAATAGGCAGCAA; MMP-9, GGCTACGTGACCTATGACATCCT para a frente, reverso TCCTCCCTTTCCTCCAGAACA; gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC para a frente, reverso GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT. A PCR foi realizada a 95 ° C durante 30 s, a 60 ° C durante 30 s, e 1 min a 70 ° C durante 35 ciclos. O método Ct comparativa foi utilizada para calcular a abundância relativa do ARNm e os resultados para a expressão do gene alvo foram comparados com aqueles para a expressão de GAPDH. Os resultados foram obtidos a partir de três experiências independentes.

quantitativa de proteína Ensaios

a expressão da proteína de MMP9 no sobrenadante e lisado celular foi medida utilizando um kit de painel MMP 2 esférulas magnéticas com base na tecnologia Luminex. Resumidamente, os anticorpos de captura MMP9 (Millipore) foram conjugados a esferas (grânulos Luminex região 33). anticorpos de detecção MMP9 (Millipore) foram conjugados com biotina através de um serviço personalizado fornecido pela Millipore. As células foram lisadas em tampão de MAP MILLIPLEX lise (Millipore) e diluiu-se com igual volume de tampão de ensaio da célula MILLIPLEX MAP (Millipore). MMP9 de captura de esferas de anticorpo foram diluídos em 25 uL de tampão de ensaio da célula MILLIPLEX MAP e adicionados a uma placa magnética (Millipore). Em seguida, 25 ul de lisado celular ou sobrenadante de cultura de células diluído foi transferido para cada poço da placa sólida e incubou-se durante 2 h à TA com agitação. Após a incubação, as esferas foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem, e 25 uL de anticorpos de detecção foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 1 h à TA com agitação. Depois disso, foram adicionados 25 ul de MILLIPLEX MAP estreptavidina-ficoeritrina (Millipore) e incubadas durante 30 min à TA com agitação. Finalmente, fluido de revestimento foi adicionado após a lavagem, eo sinal foi lido utilizando um Luminex FLEXMAP 3D ™.

Western Blot Analysis

Para a análise de western blot, A549 e 95D células foram semeadas em frascos de cultura e tratou-se com Au-PN (controlo, 5 nm, 10 nm, 20 nm e 40 nm). Após 48 h, 5-10 × 10

6 as células foram colhidas e lisadas com tampão de lise arrefecido com gelo. Quantidades iguais de proteína foram separados por electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidas electroforeticamente para membranas de fluoreto de polivinilideno. As membranas foram bloqueadas com leite seco não gordo a 5% durante 2 h e incubou-se durante a noite a 4 ° C com-MMP-9, anticorpo anti coelho (1:1000, Abcam), 1-anti-ICAM anticorpo de coelho (1:500, Cell Signaling), ou mouse anticorpo anti-GAPDH (1:10000, Abmart). GAPDH foi usada como o controlo de gene de manutenção e os níveis de expressão da MMP9 e ICAM-1 foram normalizados com respeito a GAPDH. As proteínas foram detectados com anticorpos anti-coelho ou anti-ratinho conjugados com peroxidase de rábano e visualizados secundárias com reagentes quimioluminescentes fornecidas com o kit ECL (BioRad, EUA). bandas imuno foram detectados por quimioluminescência aumentada e quantificada usando um imager molecular XRS ChemiDoc (BioRad).

Análise Estatística

analisa GraphPad Prism 5 estatística software foi utilizado em todas as análises estatísticas realizadas neste estudo ( GraphPad Prism versão 5.00 para Windows, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA). Todos os resultados foram apresentados como média desvio ± padrão (SD). As comparações estatísticas foram realizadas utilizando-se análise de variância (ANOVA), seguida pelo de Dunnett

t

-test para comparação com o grupo de controlo. As diferenças foram consideradas significativas para P . 0,05

foram usadas

Resultados

Síntese e Caracterização de Au-NPs

Au-NPs sintetizado com o método de redução de citrato sem qualquer modificação adicional para todos os estudos e são aqui referidos como nanopartículas não modificados. Para determinar a relação entre o tamanho e a função biológica das nanopartículas, foi utilizado Au-NPs de quatro tamanhos diferentes (5, 10, 20, ou 40 nM) e caracteriza-se-lhes por TEM e espectros UV-Vis (Figura 1). As partículas foram mostrados para ser todas as esferas com distribuições de tamanho estreitas. As altas densidades de elétrons de Au-NPs, bem como a homogeneidade da sua forma e tamanho fez altamente evidente sob o microscópio eletrônico de transmissão.

microscopia eletrônica de transmissão (TEM) imagens de Au-NPs com diâmetros de (A ) 5 nm, (B) de 10 nm, (C) de 20 nm, ou (D) de 40 nm. As inserções mostram imagens de alta resolução. Barras de escala, 20 nm e 100 nm (conforme marcado). E: UV-vis espectros do Au-NPs com 5-nm, 10 nm e 20 nm e 40 nm diâmetros

Internalização de Au-NPs

. para investigar se a Au-NPs com vários tamanhos atravessou a membrana celular e onde se localiza, células A549 e 95D foram incubadas durante 48 h na presença de Au-PN (5, 10, 20, e 40 nM) em meio de cultura celular completo . A Figura 2 mostra a internalização da forma diferente tamanho Au-PN. A maioria das partículas foram encontrados em vesículas ligadas à membrana ou na região perinuclear dentro das células.

imagens de TEM com uma ampliação de 200 nm, mostrando a internalização de 25 ug /mL de Au-NPs com vários tamanhos (5 nm , 10 nm, 20 nm e 40 nm) em (a) A549 e (B) 95D células após 48 horas de tratamento.

Medição da citotoxicidade de Au-NPs

em seguida, buscou-se determinar o efeito dessas Au-NPs sobre a proliferação de duas linhas diferentes de câncer de pulmão de células, A549 e 95D células. O efeito citotóxico sobre as quatro Au-NPs com diferentes diâmetros foi testada na mesma concentração. Os nossos resultados demonstraram que 5 nm Au-NPs de desempenhar um papel central na inibição da proliferação de ambas as células A549 e 95D às 48 h e 72 h (Figuras 3A e B). Au-NPs com diâmetros de 20 nm e 40 nm exibiam eficácia notável de 24 h em diante na promoção da proliferação de células A549, enquanto que nenhuma foi observada na promoção 95D células (Figuras 3A e B). Au-PN com um diâmetro de 10 nm, não teve nenhum efeito sobre a proliferação de ambas as células A549 e 95D. A inibição da proliferação de células, aumentando a apoptose celular, e prendendo o ciclo de células em G0 /G1 manifesta a citotoxicidade de 5-nm Au-PN. Não houve diferença significativa (P 0,05) na apoptose e a distribuição do ciclo celular para a 10 nm, 20 nm e 40 nm grupos tratados com AUNP (Figuras 3C-H). Estes resultados indicaram que a pequena Au-PN pode ser citotóxico e que o diâmetro não é o único factor a influenciar a proliferação celular e a interacção entre Au-PN, que é um processo muito complexo, que garante mais investigação

.

A célula linhas A549 (a) e 95D (B) em fase de crescimento logarítmico foram expostas a Au-NPs durante 24 h, 48 h e 72 h. A viabilidade celular foi calculada como a percentagem de células viáveis ​​em comparação com os controlos não tratados. Cada resultado representa a viabilidade média ± desvio padrão (DP) de três experiências independentes. Apoptose (C-D) e do ciclo celular (E-H) as análises dos A549 e 95D células tratadas com diferente tamanho Au-PN. As barras de erro indicam valores SD de quatro experiências independentes. * P 0,05, ** P 0,01, *** P . 0.001

Invasion Ensaio

Um modelo de membrana basal foi utilizado para avaliar a actividade invasão das células. Os resultados são apresentados na Figura 4. Os resultados indicaram que a invasão de células foi promovida de forma significativa após o tratamento com 5 de A549 nm Au-NPs e de células 95D com 10 nm Au-PN (P 0,05). Em contraste, as células internalizadas com 20 nm ou 40 nm Au-NPs não foram significativamente afetados pela atividade de invasão (Figura 4). Estes resultados sugerem claramente que os efeitos eram tamanho- invasão das partículas e dependente do tipo de célula.

As imagens representam células A549 (A) e (B 95D células) que tenham atravessado os poros da câmara de invasão de Matrigel e correspondentes resultados de intensidade de fluorescência. * P 0,05. As barras de erro indicam os valores SD de três experiências independentes.

Efeitos do Au-NPs na expressão de MMP9 e ICAM-1 em células de câncer de pulmão

Para ganhar uma compreensão mais profunda este fenómeno, qRT-PCR foi realizado para medir os níveis de ARNm de MMP9 e ICAM-1 após tratamento com Au-PN. Os resultados mostraram que 5 nm e 10 nm Au-NPs nomeadamente facilitar a expressão de ARNm de ICAM-1 em ambas as linhas celulares (Figuras 5B e D, P 0,05). A expressão de ARNm de MMP9 aumentada em células A549 nm Au-5-NPS-tratada e de 10 nm, Au-NPS-95D células tratadas, mas as diferenças não foram estatisticamente significativas (Figura 5A e C). Em seguida, realizada uma experiência baseada em Luminex na presença de MMP9 esferas magnéticas para quantificar a expressão da proteína de MMP9 tanto no lisado celular e do sobrenadante da cultura. Os resultados ilustraram que o tratamento com 5-nm Au-NPs marcadamente aumentou os níveis de MMP9 no ligado de células A549, enquanto MMP9 foi nomeadamente supra-regulada no lisado de células 95D, por tratamento com 10-nm Au-NPs (Figuras 6 A- B). As comparações com o nível de MMP9 no sobrenadante revelou que não houve diferença significativa (p 0,05). Entre o A549 Au-NP-tratada e Au-NP-tratada e 95D (figuras 6 C-D)

Os resultados de qRT-PCR para (A-B) A549 e (C-D) 95D células após 48 h de incubação com 5 nm, 10 nm, 20 nm, ou 40 nm Au-PN. * P 0,05, *** P 0,001 versus controlo. As barras de erro indicam os valores SD de três experiências independentes.

Quantificação da expressão de MMP9 no lisado de células (A-B) e o sobrenadante (C-D) de células A549 e 95D, respectivamente , foi realizada usando a tecnologia Luminex. * P 0,05. As barras de erro indicam os valores SD de três experiências independentes.

Além disso, foi investigada a expressão de proteína utilizando Western blotting. Os resultados mostraram que a MMP9 e ICAM-1 foram regulados positivamente nos lisados ​​de células A549 e 95D, por tratamento com 5 nm e 10 nm Au-NPs, respectivamente (Figura 7); Em contraste, MMP9 e ICAM-1 foram regulados negativamente por tratamento com 40-nm Au-NPs, sugerindo que Au-NPs de tamanho de partícula desempenha um papel importante na regulação destas proteínas. Estes resultados forneceram a evidência que MMP9 e ICAM-1, moduladores chave da invasão celular, pode ser regulada por Au-PN.

Os resultados representativos que mostram o efeito do tratamento Au-NPs sobre a expressão de ICAM-MMP9 e 1 em A549 (a) e células 95D (B). Densidade Relativa banda de MMP9 e ICAM-1 para o valor médio do grupo de controlo (C-H). Os valores são expressos como intensidade relativa normalizada de intensidade e de GAPDH são dadas como média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05, ** P 0,01, *** P . 0,001 vs. controlo

Discussão

O baixo custo de produção e relativa facilidade para sintetizar Au-NPs fazer -los viáveis ​​para futuras aplicações biomédicas. No entanto, com a transição de Au-NPs da bancada à clínica, tanto mais é necessário o conhecimento sobre as interacções fundamentais entre materiais em nano-escala e sistemas biológicos. A biossegurança e biocompatibilidade de Au-NPs são preocupações vitais que deve ser demonstrada antes de tais materiais são aplicados a sistemas biológicos. Semelhante a muitos outros relatórios [24], [25], neste estudo, Au-NPs foram facilmente absorvido pelas A549 e 95D células via endocitose não específica e localizada no interior de vesículas citoplasmáticas. Neste estudo, foi demonstrado que pequena Au-PN com um diâmetro de 5 nm apresentam uma elevada eficácia na inibição da proliferação, promovendo a apoptose, e prendendo o ciclo celular na fase G0 /G1 em duas linhas celulares de cancro de pulmão. Em contraste, nenhuma citotoxicidade óbvio foi observada em 10 nm, 20 nm, e de 40 células tratadas com Au-NP nm, o que está de acordo com os resultados de outros grupos de pesquisa. Estudos anteriores mostraram que o tamanho da superfície, e não a carga superficial, desempenha um grande papel no efeito terapêutico de Au-PN [26]. Geralmente, Au-NPS para aplicações de entrega de drogas e terapias fototérmico têm dimensões maiores do que 10 nm, o que é suficiente para diminuir a reactividade de superfície e, assim, fazer núcleos de ouro benigna. Um tamanho maior do que 6-8 nm também é óptimo para impedir a excreção renal e, consequentemente, diminuir a semi-vida circulatória [27]. Inesperadamente, os nossos resultados mostraram que a proliferação de células A549 foi promovida após 24 h de tratamento com Au-NPs de 20 nm ou 40 nm de diâmetro. Este fenómeno não foi observado nas células 95D. Além disso, 5-nm Au-NPs de 10 nm e promoveu significativamente a invasão de células A549 e 95D, respectivamente, enquanto que a capacidade invasiva não foi afectada na presença de partículas com um tamanho maior do que 20 nm. Estes resultados suportam a visão de que Au-NPs não universalmente como alvo todos os tipos de células [28]. Coulter et ai. descobriu que a fracção sobrevivente de células tratadas com Au-NPs mostrou uma forte dependência do tipo de célula em comparação com a de células não tratadas no que respeita ao potencial radiossensibilização [24].

No nosso estudo, a capacidade de invasão foi melhorada acompanhada por uma regulação positiva notável da expressão de ICAM-1 e MMP-9 de expressão. Invasão através da ECM é um passo importante para a metástase do tumor. As células cancerosas iniciar a invasão por adesão e propagação ao longo da parede do vaso sanguíneo. As metaloproteinases de matriz são as endopeptidases que são capazes de degradar componentes da matriz extracelular, o que permite que as células cancerosas para aceder à vasculatura e sistemas linfáticos [29] – [31]. MMP-9 tem atraído muita atenção à sua capacidade para degradar o colagénio tipo IV, o componente de base da membrana basal [32]. O aumento da expressão de MMP-9 em pacientes com cancro do pulmão de não pequenas células tem sido relatada [33], [34]; por conseguinte, os agentes que suprimem a expressão das MMP pode inibir a migração de células de cancro e invasão [35]. ICAM-1 é uma molécula de adesão representante envolvido na interacção entre células de tumor, o endotélio, e de ECM. Alta expressão de ICAM-1 em amostras de câncer de pulmão humanos foi correlacionada com um maior risco de cânceres em estádios avançados (III e IV). /células de ICAM-1 A549 foram mostrados para induzir na invasão de células vitro e in vivo a metástase tumoral [36]. Denissenko et ai. observou-se que a ICAM-1 na regulação negativa de ARNm e os níveis de proteínas conduziu a uma forte supressão de invasão de células de mama humano através de uma matriz Matrigel [37]. Descobrimos que 5 nm e 10 nm Au-NPs efectivamente promovida a expressão de ICAM-1 e de MMP9 em A549 e células 95D, respectivamente, o que explica em parte a uma acção reforçada das partículas sobre a invasão de células do cancro.

uma vez que os efeitos de regulação positiva de Au-NPs sobre a MMP-9 e ICAM-1 em A549 e células 95D sugeriu que as pequenas partículas podem possuir a capacidade de facilitar a invasão de células do cancro do pulmão, estudos in vivo são necessários para confirmar os mecanismos. Em resumo, o tratamento com 5-nm Au-NPs inibiu eficazmente a proliferação de células e promoveu a apoptose, mas também regulada positivamente a expressão de ICAM-1 e de MMP9, bem como o aumento da invasão de células A549. Em contraste, Mukherjee et ai. relataram que Au-PN (5 nm de diâmetro) exibiu propriedades anti-angiogénicas (por exemplo, inibiu o crescimento tumorigénico de novos vasos sanguíneos), tanto in vitro como in vivo [38].