Abstract

Contexto

carcinoma adrenocortical (ACC) é uma glândula endócrina rara e altamente agressivo neoplasia, com opções terapêuticas limitadas. Activar β-catenina mutações somáticas são encontrados em ACC e têm sido associados com um mau resultado clínico. De facto, a activação da via de sinalização Wnt /β-catenina parece desempenhar um papel importante na agressividade ACC, e pode, assim, representar um alvo terapêutico promissor.

Objectivo

Semelhante ao paciente tumor espécime a linha de células H295 derivado de um ACC abriga um activador natural, mutação β-catenina. Nós aqui avaliar a

in vitro

e

in vivo

efeito da inativação β-catenina usando um doxiciclina (DOX) plasmídeo shRNA induzível em H295R linha de células de câncer adrenocortical (clone chamado shβ).

resultados

Após o tratamento dox uma profunda redução no

β-catenina

expressão era detectável em clones shβ em relação ao controle clones (CTR). Assim, observou-se uma diminuição na atividade repórter Wnt /dependente de βcatenin luciferase, bem como uma diminuição da expressão de

AXIN2

representando um

β-catenina

gene alvo endógeno. Concomitantemente,

β-catenina

silenciamento resultou em uma proliferação celular diminuiu, alterações no ciclo celular com acumulação de células na fase G1 e aumento da apoptose

in vitro

.

In vivo

, em xenoenxertos de tumores estabelecidos em ratinhos nus atímicos, 9 dias de

β-catenina

silenciamento resultou em uma redução significativa de

CTNNB1

e

AXIN2

expressão. Além disso, contínuo

β-catenina

silenciamento, a partir de 3 dias após a inoculação de células tumorais, foi associada a uma ausência completa do crescimento do tumor no grupo shβ enquanto que os tumores estavam presentes em todos os animais do grupo de controlo.

Conclusão

em resumo, estes experimentos fornecem evidências de que a inibição da via Wnt /β-catenina em ACC é um alvo terapêutico promissor

Citation:. Gaujoux S, Hantel C, Launay P, Bonnet S, Perlemoine K, L Lefevre, et ai. (2013) Silenciando Mutante

β-catenina

inibe a proliferação celular e estimula a apoptose na linha celular de cancro adrenocortical H295R. PLoS ONE 8 (2): e55743. doi: 10.1371 /journal.pone.0055743

editor: Hans A. Kestler, da Universidade de Ulm, Alemanha |

Recebido: 14 de setembro de 2012; Aceito: 30 de dezembro de 2012; Publicação: 07 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Gaujoux et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela Contrat d’Initiation à la Recherche Clinique (concessão CIRC 05045 – AP-HP), o Plano Hospitalier de Recherche Clinique (AOM06179) para a Rede COMETE, o Recherche Translationnelle DHOS /INCA 2009 (RTD09024), FSE (07-RNP-067), Association pour la Recherche sur le câncer (SFI20111203542), a Weigand Confiança Alemanha, a Sander Stiftung (2011.003.1) e da Ligue contre le cancer (RS12 /75-105). Além disso, investigação conducente a estes resultados foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro (FP7 /2007-2013) ao abrigo do acordo de subvenção número 259.735 (ENS @ T-CANCER). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma adrenocortical (ACC) é uma neoplasia endócrina rara e altamente agressivo, com um 5 anos de sobrevivência global de cerca de 40% [1] – [4]. As opções terapêuticas para estes pacientes são escassos e disponíveis quimioterapias de eficácia limitada. Uma melhor compreensão da biologia do tumor e fatores prognósticos moleculares ajudaria a selecionar alvos terapêuticos relevantes e desenvolver estratégias terapêuticas inovadoras.

A ativação da via de sinalização /β-catenina Wnt na tumorigênese adrenocortical foi recentemente investigada em detalhe [ ,,,0],5] – [10], e parece desempenhar um papel principal no prognóstico de carcinoma adrenocortical. Em modelos animais, a activação constitutiva da via /β-catenina Wnt no córtex supra-renal de ratinhos transgénicos leva ao desenvolvimento de tumores adrenocorticais com características malignas [11]. Nos seres humanos, esta via é frequentemente activado gene β-catenina principalmente calha (

CTNNB1

, ou seja Catenina (proteína associada a caderina), beta-1) mutações [5], [7], e está associada com clínico específico e as características patológicas e um mau resultado [8]. Da mesma forma, uma assinatura transcriptomic específico de tumores com

CTNNB1

mutação foi recentemente mostrado [12], e pode ser responsável pelo mau prognóstico particular de pacientes afetados. No geral, estas observações sugerem Wnt /β-catenina inactivação via de sinalização como um alvo terapêutico promissor no ACC.

O objetivo deste estudo foi avaliar a

in vivo

e

in vitro

efeitos da inactivação específica Wnt /β-catenina via de sinalização usando RNA curto hairpin (shRNA) em um modelo de tumor de carcinoma adrenocortical (H295R).

Materiais e Métodos

Cultura de células e geração de clones H295R

linha celular de carcinoma adrenocortical H295R estavelmente transfectadas com o repressor Tet (H295R /TR) foi gentilmente cedido pelo Dr. Lalli [13]. As células foram cultivadas como anteriormente descrito [14]. vetor pter-β-catenina, que expressa um doxiciclina indutível shRNA alvo

CTNNB1

(

β-catenina

; sequência alvo: 5′-GTGGGTGGTATAGAGGCTC-3 ‘) de ARNm, e o vector de controlo ( pter) foram obtidas do Dr. van de Wetering [15]. H295R /TR foram transfectadas com o pter-β-catenina ou PTER e os clones foram seleccionados pela zeocina (50 ug /ml, Invivogen). Três clones shRNA-βcatenin (shβ) foram selecionados em que

CTNNB1

expressão foi regulada para baixo, pelo menos, 5 vezes em um doxiciclina (DOX, 0,2 ug /ml, Sigma) forma dependente em comparação com três clones de controle ( CTR) transfectadas com pter vetor. Todos os clones de células foram investigados quanto à sua capacidade para expressar genes específicos (esteroidogênicas

STAR

e

CYP11B1) e as suas respostas para a via AMPc /PKA que se verificou ser comparável ao do pais A linha celular, H295R [16] (dados não mostrados). S45P

CTNNB1

(

β-catenina

) mutação activadora do gene, previamente identificado na linha celular parental H295R [5], [8], foi confirmada por sequenciação directa em todos os clones e Ctr shβ (dados não mostrados). Enquanto os dados são apresentados para um único Ctr e shβ clonar todo o

in vitro

experimentos foram confirmados com resultados equivalentes em 2-3 clones individuais (CTR e shβ).

A análise dos níveis de RNA e proteínas

total de ARN ou proteína extracções e análise de linhas de células foram realizados como previamente descrito [14] com os iniciadores e os anticorpos descritos na Tabela S1.

ensaios

transfecção de células, e repórter

Como um /β-catenina via de construção repórter de Wnt expressão do gene da luciferase de condução, utilizou-se o plasmídeo TopFlash (superior), que contém duas cópias dos locais de ligação de TCF /factor de células T β-catenina, enquanto que o plasmídeo FopFlash (FOP) contém duas cópias mutadas dos locais de ligação de /TCF β-catenina [5]. vírus do sarcoma de Rous (RSV) -Renilla (Promega) foi utilizado como um controlo de eficiências de transfecção. As células foram co-transfectadas e pirilampo e Renilla actividades de luciferase foram medidas sequencialmente como anteriormente descrito [14].

A proliferação celular, ciclo celular e apoptose análise

A proliferação foi medida pelo ensaio de MTT (Promega). O ciclo celular e apoptose foram analisados ​​por citometria de fluxo como descrito anteriormente [17].

Xenoenxerto, exame patológico e imuno coloração

atímicos fêmea NMRI nu /nu (6-8 semanas) foram adquiridos a Harlan Winkelmann (Borchen, Alemanha) e alojados sob condições isentas de agentes patogénicos. Todos os experimentos foram realizados seguindo protocolos aprovados pelo Regierung von Oberbayern e em conformidade com as directrizes alemão para estudos com animais. 15 × 10

6 células dos clones individuais foram inoculadas num volume de 200 ul de PBS por via subcutânea no pescoço de cada rato. Para experiências terapêuticas de curto prazo DOX tratamento foi iniciado quando os diâmetros mais longos tumorais variaram entre 0,2-0,9 cm de tamanho (depois de 21-31 dias). Doxiciclina foi adicionada numa concentração final de 2 mg /ml para a água potável em garrafas de água âmbar. Após 9 dias de tratamento de tumores DOX foram excisados, fixados em formalina, embebidos em parafina, e 4 uM secções cortadas e coradas com hematoxilina-eosina-açafrão. A imuno-histoquímica para β-catenina foi realizada como previamente descrito [5]. Células para experiências terapêuticas de longo prazo foram inoculadas e 3 dias após a indução do tumor ratos foram a partir de então tratado continuamente com água dox. O tamanho do tumor foi medido a cada dois dias utilizando um compasso de calibre, como descrito anteriormente [18]. No dia 31 dias após a indução do tumor, quando as primeiras tumores atingiram um diâmetro de tumor mais longo de 1,5 cm, os ratos foram sacrificados e os tumores extirpados.

A análise estatística

Todos

in vitro

de dados com análises estatísticas representam a quantificação de pelo menos três experiências. condições de controlo foram definidos como 100% e os dados foram analisados ​​pelo teste de Fisher. A análise estatística para a comparação do peso do tumor após a experiência terapêutica de longo prazo

in vivo

foi realizada pelo teste de Mann-Whitney. Significância foi estabelecido em P 0,05 (representado por * nas figuras); P 0,01 (**) e P 0,001 (***)

Resultados

inativação eficiente de

CTNNB1

por shRNA em células cancerosas adrenocorticais

células H295R, abrigando um heterozigótico

CTNNB1

mutação genética no local de fosforilação da GSK3β (S45P), exibem uma actividade de transcrição constitutiva de β-catenina-LEF /TCF [5]. Os clones celulares que expressam um doxiciclina indutível shRNA segmentação β-catenina foram gerados. Dois dias após a indução shRNA-β-catenina por tratamento de doxiciclina (DOX),

CTNNB1

ARNm (-85%, p 0,01) e os níveis de proteína foram diminuiu significativamente (Figura 1-A). Esta diminuição no

CTNNB1

níveis de mRNA e proteína persistiu com o tratamento dox até 10 dias. Em contraste, o tratamento dox não teve efeito sobre

expressão CTNNB1

no clone de controlo (CTR) (Figura 1-A).

A, histograma e ocidentais painéis blot representam

CTNNB1

(

β-catenina

) de ARNm e proteína de acumulação, no CTR e os clones shβ após 2, 5 ou 10 dias após a adição de doxiciclina (DOX) no meio de cultura (0,2 ug /ml). B-esquerda, as células foram co-transfectadas transientemente com um Wnt /-β-catenin construç artificial repórter via (Top) ou seu controle mutado (FOP). Após 24 h, as células foram tratadas por veículo ou DOX (0,2 ug /ml) durante 24 h e a actividade da luciferase foi medida. -à direita, Histograma representam

AXIN2

acumulação de ARNm após 2 dias de tratamento dox. C-esquerda, curva de sobrevivência celular de células, como avaliado pelo ensaio de MTT, sem ou com DOX (0,2 ug /ml) durante 1, 4, 8 ou 12 dias. -Center, a distribuição de células nas várias fases do ciclo celular foi analisado por análise de citometria de fluxo de coloração com iodeto de propídio ou após veículo DOX tratamento para 2, 5 e 10 dias. Western blots mostram β-catenina, níveis de proteína CyclinA e CDK2 em 10 dias. -right, Histogramas representam células apoptóticas medidos por citometria de fluxo de anexina V, após a incorporação do veículo ou DOX o tratamento de 2, 5 e 10 dias, com ou sem co-tratamento estaurosporina para últimas 6 h (0,5 ug /ml). Western blot mostram a caspase clivada 3 (CC3) na mesma condição.

CTNNB1

silenciamento diminui Wnt /β-catenina-LEF /TCF transcrição

dependente

A Wnt /β-catenina-LEF transcrição /TCF dependente foi estudada usando os plasmídeos Top-flash /Fop-flash (Top e Fop). Como esperado, as células H295R transfectadas apresentaram maior actividade transcricional do β-catenina-LEF /TCF dependente repórter de luciferase construção superior em comparação com a construção Fop mutada (Figura 1-B, Ctr-Fop: 5% em comparação com Ctr-Topo: 100 %, p 0,01; e shβ-Fop: 9% em relação ao shβ-Top: 100%, p 0,01). H295R células que expressavam shRNA-β-catenina (shβ com DOX) mostrou uma menor actividade transcricional do repórter construir Topo (shβ-Topo: -53%, p 0,01). tratamento Dox não afetou a atividade do Top construir no clone de controlo (CTR-Top) ou na Fop construir com mutantes locais LEF /TCF em ambos os clones (CTR-Fop e shβ-Fop)

.

Além disso ,

CTNNB

1 silenciamento por dois dias diminuiu significativamente o nível de mRNA de um gene alvo a jusante canônica endógena de Wnt via /β-catenina, ou seja,

AXIN2

, no clone shβ (figura 1-B , shβ: -82%, p 0,01) em relação ao controle clones (Ctr,

ns

)

CTNNB1

proliferação altera silenciando, ciclo celular e apoptose

um estudo curso de tempo de

CTNNB1

silenciamento na linha de células H295R demonstrou uma diminuição significativa na proliferação (-45,8% em 12 dias, p 0,05) em comparação com shβ clone sem

CTNNB1

silenciamento (-dox) ou do clone de controlo (Figura 1-C), determinado por conversão de MTT.

análise citométrica de fluxo de ciclo celular por coloração com iodeto de propídio mostrou nenhum efeito sobre o ciclo celular até 5 dias. Todavia, após 10 dias de tratamento com DOX,

CTNNB1

silenciamento resultou na acumulação de células nas fases G1 e uma diminuição da percentagem de células na fase S (Figura 1-C, shβ-10D-G1: 55,3 ± 0,4%

vs

65,8 ± 2,2%; S: 27,5 ± 0,2%

vs

16,5 ± 1,6%, p 0,05). Não se observou tal diferença no clone de controlo (CTR). Neste ponto do tempo, observou-se uma redução de duas proteínas importantes para o G1 /S de transição, ciclina A e CDK2 apenas em células silenciadas para

CTNNB1

(figura 1-C).

Da mesma forma, nenhum efeito sobre a apoptose ensaiada por análise de citometria de fluxo de annexine V incorporação em células, observou-se até 5 dias enquanto que 10 dias de DOX induzida

CTNNB1

silenciamento aumentou a proporção de células em apoptose (Figura 1-C, shβ- 10D: 167%, p 0,05) quando comparado com as células sem tratamento com DOX. Não se observou tal diferença no clone de controlo. Este aumento da apoptose por

CTNNB1

silenciamento também foi confirmado pelo ganho de um nível de proteína pró-apoptótica, caspase3 clivado (CC3), que foi já detectável em um ponto de tempo mais cedo (dia 5, Figura 1-C). Da mesma forma,

CTNNB1

silenciamento aumentou o efeito apoptótica de estaurosporina (figura 1-C; shβ-5d + stau: 224%

vs

377%, p 0,05), enquanto não houve diferença significativa em clones de controle.

CTNNB1

silenciamento abolir o desenvolvimento de xenotransplante de linha de células ACC

Para avaliar o significado funcional de β-catenina knock-down no desenvolvimento do tumor, procedeu com a investigação em um modelo de tumor xenoenxerto subcutâneo em ratos pelados atímicos.

em uma primeira etapa, as experiências curto prazo com

CTNNB1

inactivação de tumores estabelecidos (21 a 31 dias após a xeno) para uma duração de 9 dias foram realizados para espelhar a evolução no tempo do nosso

in vitro

experiências (Figura 1-C). Similar ao

in vitro

definição análise da expressão de mRNA revelaram um dox diminuição significativa dependente tumoral

CTNNB1

e

AXIN2

expressão no clone shβ (figura 2-A;

CTNNB1

: -89%, p = 0,007;

AXIN2

: -87%, p 0,001), enquanto clones de controle permaneceram inalterados pelo tratamento dox. Além disso, e de acordo com as experiências de cultura de células, a análise imuno-histoquímica (figura 2-B) revelou uma redução dependente tratamento de DOX proteína β-catenina. Mas, não se observaram quaisquer diferenças de Ki67 e a expressão caspase3 clivada por análises de imuno-histoquímica (dados não mostrados), sugerindo que 9 dias de DOX não é suficiente

In vivo

para induzir efeitos sobre a proliferação e sobre a apoptose . Porque este curso tempo é muito curto para investigar um potencial efeito sobre o crescimento do tumor em um

in vivo

modelo, foi realizado tratamento dox longo prazo. Ctr e clones shβ foram injectados por via subcutânea e 3 dias após a indução do tumor os ratinhos foram tratados com DOX de uma maneira contínua. Não há nenhuma diferença significativa após 31 dias em tamanho do tumor entre shβ e clones Ctr em ausência de tratamento com DOX, mas parece que o clone shβ crescem mais lentamente que o clone Ctr, provavelmente por causa de um efeito clonal. Por este motivo o sistema de doxiciclina indutível adequado é, porque os clones são o seu próprio controlo. Embora o tratamento DOX não afectou o crescimento do tumor e peso do clone de controlo (Figura 2-C-esquerda, medianas peso: 112 mg

vs

162,7 mg,

NS

), houve uma significativa impacto de

CTNNB1

silenciamento mediante tratamento DOX no clone shβ (figura 2-C-á direita). Na verdade, para o clone shβ, durante os primeiros 10 dias, o crescimento do tumor foi observada em ambos os grupos (sem ou com DOX), mas, após 13 dias, nenhum dos tumores era detectável em qualquer um dos ratos do grupo de shβ tratados com DOX, incluindo após a dissecação e análise patológica (Figura 2-C-rigth, peso médio de 67,4 mg

vs

0 mg, p 0,001).

A, histogramas representam

CTNNB1

(

β-catenina

) e

AXIN2

acumulação de ARNm de xenoenxerto para ambos Ctr (-dox n = 6; + DOX, n = 5) e shβ (-dox, n = 5; + DOX, n = 5) clones de tumores estabelecidos e após 9 dias de tratamento dox. B, hematoxilina-eosina-açafrão e β-catenina, coloração (x 20) em tumores representativos do clone shβ sem e com tratamento DOX (mesma experiência como B). C, Boxplots representam os tamanhos dos tumores de xenoenxertos e Ctr shβ em ratinhos continuamente tratados com veículo ou DOX após 3 dias de indução tumoral. Boxplots no canto esquerdo representam os pesos dos tumores extirpados. Ctr (-dox n = 7, + dox n = 8), shβ (-dox, n = 7; + dox, n = 8)

Discussão

Em muitos. cancros, a via de sinalização /β-catenina Wnt desempenha um papel importante regulação do crescimento celular, motilidade, diferenciação e [19]. Nós e outros autores anteriormente demonstraram a importância da /β-catenina a activação da via de sinalização de Wnt na tumorigénese córtex adrenal [5] – [10]. Esta activação está associada com uma assinatura molecular específica e um resultado pior com a sobrevivência global inferior [12]. Doghman e colegas mostraram anteriormente que um antagonista TCF inibe a proliferação de células do córtex adrenal H295R, sugerindo um papel central da via Wnt /β-catenina em tumorigénese adrenocortical [20]. No entanto, esta abordagem farmacológica pode não ser específico para a sinalização de Wnt. Nós aqui, usando tanto

in vitro Comprar e

in vivo

experimentos, demonstram que a inactivação de chumbo directo e específico β-catenina a alterações de proliferação, ciclo celular e apoptose que levam a uma diminuição drástica do o desenvolvimento do tumor em um modelo de tumor para a ACC. São necessários mais estudos, a fim de saber se β-catenina inactivação suprime o crescimento ou impede o enxerto das células. No entanto, estes resultados confirmam 1 /a consequência biológica de Wnt /β-catenina ativação da via na tumorigênese adrenocortical e 2 /o grande interesse terapêutico para alvejar esta via.

A inibição da Wnt via /β-catenina em um subgrupo da ACC agressivo parece ser um alvo terapêutico interessante e deve ser avaliado em mais detalhe no futuro.

Informações de Apoio

Tabela S1. condições

PCR e anticorpos usados ​​

doi:. 10.1371 /journal.pone.0055743.s001

(XLS)

Reconhecimentos

Dr. E Lalli para o dom generoso de células H295R /TR e Dr. H Clevers para o presente generoso do pter-sh

βcatenin

vetor.