Abstract
O câncer colorretal é um dos cancros mais comuns em países desenvolvidos e é o resultado de tanto ambientais e genéticos factores. Muitas das lesões genéticas observadas no câncer colorretal alterar a expressão de genes homeobox, que codificam fatores de transcrição homeodomain. O
MEIS1
gene homeobox é conhecida por estar envolvida em várias doenças malignas hematológicas e tumores sólidos e evidências recentes sugerem que a expressão do
MEIS1
transcrição é alterada no cancro colorectal. Apesar deste potencial ligação, pouco se sabe sobre o papel do gene nos intestinos. Nós sondado amostras de tecido gastrointestinal de murídeo com um anticorpo MEIS1 N-terminal, revelando a expressão de duas isoformas previamente descritas, bem como duas novas produtos MEIS1. Um produto de 32 kDa MEIS1 foi expressa nos núcleos de células não epiteliais do estômago e do cólon, enquanto que um produto de 27 kD foi expresso no citoplasma das células epiteliais do cólon proximal. Os nossos dados sugerem que as 27 kD e 32 kD MEIS1 são as duas formas da proteína Meis1d, uma isoforma menos homeodom�io-cuja transcrição foi previamente identificados em rastreios de ADNc. Tanto o
MEIS1D
transcrição e proteínas foram expressas na mucosa do cólon humano. A expressão da proteína MEIS1D foi regulada negativamente em 83% (10/12) das amostras de cancro colorrectais primários em comparação com a mucosa normal correspondente, indicando que MEIS1D é um biomarcador de tumorigénese colorectal. A expressão diminuída de MEIS1D em tumores do cólon também sugere que esta isoforma homeodom�io-menos conservada pode actuar como um supressor tumoral no cancro colo-rectal humano
citação:. Crist RC, Roth JJ, Waldman SA, Buchberg AM (2011) a conservada Tissue-Specific Homeodomínio-Menos de isoformas de MEIS1 é regulada negativamente no câncer colorretal. PLoS ONE 6 (8): e23665. doi: 10.1371 /journal.pone.0023665
editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América
Recebido: 20 de maio de 2011; Aceito: 22 de julho de 2011; Publicação: 17 de agosto de 2011
Direitos de autor: © 2011 Crist et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [T32-CA09678 a RCC, T32-CA09683 para JJR] e do Instituto Nacional do Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação deste manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal para cerca de 10% de ambos os diagnósticos de câncer e mortalidade nos Estados Unidos (www.cancer.org). A taxa de mortalidade diminuiu nas duas décadas anteriores, refletindo principalmente maiores níveis de compatibilidade com exames de colonoscopia recomendadas, bem como a melhoria da eficácia das opções terapêuticas [1]; No entanto, cancro colorrectal ainda tem a segunda maior incidência de mortalidade nos Estados Unidos, atrás apenas do cancro do pulmão. Como muitos tipos de cancro, cancro colo-rectal tem ambos os componentes ambientais e genéticos [2], [3], [4]. Ambas as formas esporádicos e hereditários da doença estão associados com uma acumulação de múltiplas lesões genéticas [5], [6], o que pode resultar em níveis reduzidos de apoptose [7], a perda de regulação do ciclo celular [8], e a activação constitutiva de a via de
WNT
sinalização [9]. Como reguladores de activação da transcrição a jusante, fatores de transcrição são frequentemente desregulado no cancro colorectal [10], [11].
Os genes homeobox codificam proteínas com domínios de ligação de ADN conhecidos como homeodomains. Estas proteínas homeodomain atuam como fatores de transcrição, ligando regiões promotoras e activar a transcrição [12].
HOX
membros da família de genes são os genes homeobox protótipos.
HOX
genes estão envolvidos na segmentação e modelagem embrionária, bem como o desenvolvimento de vários sistemas de órgãos, incluindo o tracto gastrointestinal [12]. genes de desenvolvimento são muitas vezes ectopicamente expressa durante a carcinogênese [13] e vários
HOX
genes têm sido associados ao câncer colorretal.
HOXB6
,
HOXB8
,
HoxC8
,
Hoxc9
, e
HOXD13 Quais são sobre-expressos em ambas as linhas celulares de cancro colorrectal e primária tumores do cólon [14], [15], [16].
HOXB13
, no entanto, é normalmente expressa na mucosa do cólon mas é regulada negativamente em tecido tumoral [10]. Desregulamentação dos não-
HOX
genes homeobox também tem sido observada em carcinomas colo-rectais.
CDX1
e
CDX2 Quais são reprimidos durante a carcinogênese colorretal [17], [18], enquanto aberrante
PROX1
expressão nos resultados do cólon em aumento da displasia [19].
Homeodomínio fatores de transcrição, muitas vezes ligam regiões promotoras tanto como complexos homodim�icas ou heterodiméricos [20]. Esta dimerização proporciona uma maior especificidade de activação da transcrição [21]. A proteína de homeodomínio MEIS1 é um parceiro de ligação conhecido de várias outras proteínas, incluindo homeodomain HOXA7, HOXA9, e PBX1 [22].
MEIS1
desempenha um papel no desenvolvimento normal da linhagem hematopoiética e é sobre-expresso num subconjunto das leucemias mielóides agudas [23]. O aumento da
MEIS1
expressão também tem sido observado em neuroblastomas e ao nível do
MEIS1
transcrição expressão é um indicador de prognóstico no câncer de mama [24]. Regulação negativa do total
MEIS1
transcrição foi observada em adenomas colorretais, sugerindo um papel para
MEIS1
na tumorigênese intestinal [25].
Devido às ligações entre genes homeobox e colorretal cancro, nós examinamos o estado de MEIS1 no cólon. Neste estudo, descrevemos dois novos produtos MEIS1 expressas no tracto gastrointestinal de murino. Estas duas proteínas são expressas em diferentes tipos de células e compartimentos subcelulares. Ambas as proteínas são traduzidas a partir do
Meis1d
transcrição, uma variante de processamento homeodomain menos de
MEIS1
.
MEIS1D
, o homólogo humano de
Meis1d
, foi identificado em tecido do cólon humano normal, tanto a nível de proteína mRNA e. Além disso, observa-se a regulação negativa da
expressão MEIS1D
nos cancros colo-rectais humanos. Estes dados sugerem que
MEIS1D
é um romance supressor de tumorigênese colorretal e um potencial alvo terapêutico para o câncer de cólon.
Materiais e Métodos
Mouse colónia
/6J (B6) murganhos C57BL foram obtidos do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Os ratos foram mantidos no biotério TJU credenciada-AALAC. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo, 343C, foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use da Universidade Thomas Jefferson, licença de número A3085-01.
Retroviral Infecção
células HCT116 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Cat. N ° CCL-247), em que a identidade da linha de células foi confirmada por análise de STR. MSCV-
Meis1d
e MSCV-
Neo
plasmídeos foram transfectados em células Phoenix, utilizando o kit de profecção de fosfato de cálcio (Promega, Madison, WI). As células foram incubadas a 37 ° C durante 24 horas para produzir meios viral. meios viral foi adicionado a células HCT-116 em placas de seis poços e centrifugadas a 1800 rpm durante 45 minutos. As células foram então incubadas a 32 ° C durante 3 horas, o meio foi removido viral, e foi adicionado novo meios viral. As células foram novamente centrifugados a 1.800 rpm durante 45 minutos e incubou-se a 32 ° C durante mais 3 horas. meios virai foi substituído com DMEM e as células foram transferidas para 37 ° C durante 48-72 horas para permitir a tradução da sequência inserida. Os ratinhos B6
Western blot análise
aos 120 dias de idade foram sujeitos a eutanásia por CO
2 asfixia seguido por deslocamento cervical. As amostras de tecido e de células foram lavados em 1 x PBS e homogeneizaram-se em tampão de lise (Tris-HCl a 50, pH 7,4; NaCl 150 mM; EDTA 2 mM; glicerol a 10%; 1% de Triton-X-100) com inibidores de protease (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). A concentração de proteína foi quantificado utilizando Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). 20 ug de cada amostra foi separada por SDS-PAGE (acrilamida 10%) e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com leite seco sem gordura 5% em 1 × TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; NaCl 150 mM; 0,05% de Tween 20). Os anticorpos primários foram usadas durante a noite a 4 ° C: MEIS1-N; Meis1d-C; GAPDH (Abcam, Cambridge, MA); actina, histona H1, e citoqueratina 18 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Vector Laboratories, Berlingame, CA) foi utilizado a uma diluição 1:2500 durante 1 hora à temperatura ambiente. As proteínas foram visualizadas usando o substrato quimioluminescente SuperSignal (Thermo Scientific, Rockford, IL).
subcelular fraccionamento
As amostras de tecido e de células foram lavados em 1 x PBS e homogeneizaram-se em tampão de lise (Tris 10 mM HCl, pH 7,4; MgCl 5 mM de
2; 1 mM de DTT; 1 mM de PMSF) com inibidores de protease (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Os lisados foram então passados através de uma agulha 25½g e centrifugado a 600 x g a 4 ° C durante 10 min. O sobrenadante foi marcado a fracção citoplasmática. O sedimento foi ressuspenso em tampão de lise e rotulado a fracção nuclear.
isolamento de células epiteliais
proximal e distai do cólon amostras foram cortadas em tiras de 1 mm de largura. As amostras foram incubadas em 1 × PBS com 0,15% de DTT, durante 30 min à temperatura ambiente com agitação constante por barra de agitação para remover o muco. tiras da mucosa e barra de agitação foram lavados em 1 x PBS e depois incubadas em 1 × PBS com 1 mM de EDTA, pH 7,2 agitação durante 60 min à temperatura ambiente para remover as células epiteliais. A solução de EDTA foi recolhido e centrifugado a 470 x g durante 5 min. tecido restante foi incubado na solução de EDTA para remover as células epiteliais residuais e, em seguida, homogeneizado em tampão de lise como acima descrito. O sedimento foi ressuspenso epitelial em meio RPMI 1640 e incubado com colagenase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 50 unidades /mL durante 30 min a 37 ° C, vortex suavemente a cada cinco minutos. As amostras foram centrifugadas a 200 x g durante 5 min. O sedimento foi ressuspenso em 1 × PBS, centrifugadas novamente, e ressuspensas em meio RPMI. A suspensão de células RPMI foi revestida sobre uma mistura de 50% de Percoll /PBS. O gradiente de Percoll foi centrifugado a 470 x g durante 20 min. As células epiteliais foram tomadas a partir do topo do gradiente, diluída com RPMI, e centrifugado a 830 x g durante 5 min. O sedimento celular foi ressuspenso em RPMI e centrifugado de novo a 470 x g durante 5 min. O pelete de células final foi homogeneizado em tampão de lise western blot usando uma agulha 25½g.
RT-PCR
As amostras de tecido foram homogeneizados em 1 mililitro de TRI Reagent Solution (Ambion, Inc., Austin, TX) e centrifugou-se a 12000 × g durante 15 min a 4 ° C. 200 mL de clorofórmio foram adicionados. As amostras foram misturadas durante 15 segundos, incubadas à temperatura ambiente durante 3 minutos, e centrifugou-se a 12000 × g durante 20 min a 4 ° C. A camada superior foi misturada com 500 mL de 2-propanol, incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos, e centrifugou-se a 12000 × g durante 20 min a 4 ° C. O sedimento de ARN foi lavado com 75% de etanol e centrifugado a 7500 x g durante 5 min. O ARN foi, então, seco ao ar e ressuspenso em água tratada com DEPC. Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi utilizado para gerar ADNc. Todas as transcrições MEIS1 foram amplificados em amostras de murideo, enquanto que os iniciadores específicos do MEIS1D foram utilizados em amostras humanas.
A imuno-histoquímica
Os tecidos foram fixados em solução fresca Formalde-formalina a 10% tamponada (Fisher Scientific) durante a noite a 4 ° C e armazenada em 70% de EtOH. tecidos fixados foram embebidos em parafina e tecidos foram cortadas e montadas em lâminas de vidro pela instalação KCC Translational Research Core. Os tecidos foram desparafinadas, utilizando tampão de citrato, pH 6,0 (Vector Laboratories, Berlingame, CA) e coradas com anticorpo MEIS1-N durante a noite a 4 ° C. Anti-coelho de anticorpo secundário (Vector Laboratories, Burlingame, CA) foi utilizado a uma diluição 1:200 durante 1 hora a 37 ° C, seguido de kit ABC Linker (Vector Laboratories, Berlingame, CA) durante 30 min a 37 ° C. As amostras foram desenvolvidas utilizando o DAB Peroxidase Substrate Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). A coloração foi visualizada em um microscópio Nikon Eclipse E600 em cada 4 × ou 20 × ampliação.
Ética
Os pacientes foram consentido usando um formulário de consentimento cirúrgico escrita que afirma o desperdício de uma cirurgia seria usado para fins de pesquisa. Todas as amostras foram obtidas a Thomas Jefferson University Hospital. O Thomas Jefferson University Institutional Review Board (IRB) isentos deste estudo de revisão porque considerou que o estudo não constituem sujeitos humanos pesquisa e dispensou a necessidade de consentimento, devido ao fato de que as amostras recebidas foram codificados para remover identificação.
Resultados
Duas novas isoformas MEIS1 estão presentes no trato gastrointestinal murino
Apesar de regulação baixa de
MEIS1
no cancro colorectal humano tem sido observado recentemente, o papel do gene no tracto gastrointestinal (GI) a homeostase e tumorigénese é mal compreendida. Para determinar a expressão de isoformas de murídeo MEIS1 no tracto GI, uma transferência de Western foi realizada em murganhos C57BL /6J (B6) GI lisados usando um anticorpo policlonal voltado para o terminal N de MEIS1 (MEIS1-N). Os produtos de 43 kD e 51 kD, foram observados na maioria das amostras (Figura 1A). Estes pesos moleculares de correspondência com os tamanhos conhecidos de duas isoformas previamente descritas, e Meis1a Meis1b, respectivamente. Duas bandas adicionais foram observadas em algumas das amostras: uma proteína ~32 kD presente no estômago e cólon e uma proteína ~27 kD expresso no cólon proximal e ceco (Figura 1a). O produto ~27 kD é o mesmo que o peso previsto para Meis1d, outra isoforma MEIS1. A transcrição para
Meis1d
foi previamente identificados durante as telas de cDNA murino [26], [27]. A isoforma carece de toda a do exão 8, resultando num codão de terminação prematuro no exão 9 e um produto teórico truncada da proteína (Figura 1C, d). A existência de um
in vivo
produto de proteína, no entanto, nunca foi confirmada.
A) análise de Western blot de lisados gastrointestinais B6 utilizando o anticorpo MEIS1-N. GAPDH foi usada como um controlo de carga. PSI, MSI, e DSI indicam lisados da proximal, médio e intestino delgado distal, respectivamente. PC e DC indicam lisados a partir de dois pontos proximal e distal. B) Amplificação do
MEIS1
isoformas de cDNA cólon proximal B6 usando RT-PCR. Diagramas dos C) transcrições e D) produtos de isoformas Meis1a, Meis1b e Meis1d estão incluídos. As localizações dos dois domínios Meinox (M1 e M2) e o homeodom�io (HD) são rotulados.
Meis1d, uma isoforma truncada MEIS1, é expresso no ceco e no cólon de murino proximal
Se o produto 27 kD MEIS1 é Meis1d, então o
Meis1d
transcrição deve ser detectável no cólon proximal. Para determinar se o
Meis1d
transcrito está presente,
MEIS1
variantes de splicing foram amplificados a partir de amostras de ADNc cólon proximal B6 utilizando RT-PCR. Os iniciadores foram concebidos para amplificar através exon 8, distinguindo
Meis1d
das isoformas Corpo Inteiro,
Meis1a
e
Meis1b
. Os produtos amplificados da reacção de PCR de aproximadamente 758 e 904 pb de comprimento, o tamanho previsto de produtos a partir de
Meis1d
e
Meis1a /b
transcritos (Figura 1B). A diferença de tamanho entre os dois produtos corresponde com o comprimento conhecido do exão 8 (146 pb), o que sugere que o produto menor que falta o exão. Extracção e sequenciação do produto de PCR menor confirmou a ausência de exão 8 a partir do produto de PCR (dados não mostrados), demonstrando a presença de
Meis1d
transcrição no cólon proximal murino.
Remoção do exão 8 a partir do
Meis1d
transcrição provoca um desvio de enquadramento na exão 9. o resultado deste desvio de enquadramento, é a produção do produto de proteína truncada com cinco novos aminoácidos na extremidade C-terminal (Figura 1D). Uma vez que estes resíduos não estão presentes na isoformas MEIS1 comprimento completo, foi gerado um anticorpo de segmentação personalizada o epitopo original (Meis1d-C). Para determinar se o anticorpo reconhece o produto personalizado ~27 kD MEIS1, lisados de cólon de ratinhos B6 foram sondados com os anticorpos Meis1d-C e N-MEIS1. cólon proximal e distai do cólon lisados foram utilizados como controlos positivos e negativos, respectivamente. Como esperado, o anticorpo MEIS1-N pegou a banda kD previamente identificada ~27 no cólon proximal, mas não o cólon distai (Figura 2a). O mesmo padrão de expressão foi observado nas amostras sondados com o anticorpo Meis1d-C, demonstrando que o anticorpo Meis1d-C detecta o produto ~27 kD MEIS1 e indicando que o produto é Meis1d (Figura 2a). Para determinar o padrão de expressão espacial da proteína Meis1d, lisados a partir de um painel de órgãos B6 foram sondadas com o anticorpo Meis1d-C. expressão Meis1d limitou-se ao ceco e cólon proximal (Figura 2b, c).
A) análise de Western blot de proximal B6 e lisados cólon distal com os anticorpos MEIS1-N e Meis1d-C. As posições de MEIS1, Meis1b, e os dois novos produtos MEIS1 são rotulados. B) e C) Os lisados a partir de um painel de órgãos B6 foram sondadas com o anticorpo Meis1d-C. GAPDH foi usada como um controlo de carga.
modificação pós-tradução de Meis1d correlaciona-se com a localização subcelular
isoformas Homeodomínio-menos de outras proteínas homeodomain foram mostrados para funcionar por meio de dois mecanismos. As proteínas homeodomain-less pode sequestrar isoformas de comprimento total no citoplasma por meio de interações negativas dominantes. isoformas Homeodomínio-inferior podem também actuar como parceiros de ligação nucleares para outros factores de transcrição, que altera a activação de genes alvo a jusante. Portanto, a localização subcelular de Meis1d pode indicar o papel funcional da isoforma no cólon. Para determinar a localização subcelular de Meis1d, B6 lisados cólon proximal foram separadas em fracções nucleares e citoplasmáticos e sondadas com anticorpo MEIS1-N. Como esperado, de comprimento completo MEIS1 estava presente na fracção nuclear (Figura 3a). O produto de 32 kD MEIS1 também estava presente no núcleo. A proteína de 27 kD Meis1d, no entanto, só foi observada na fracção citoplasmática (Figura 3a). Estes dados de localização indicam que Meis1d não está a actuar como um factor de transcrição ou sequestrantes de comprimento completo MEIS1 fora do núcleo, sugerindo que a isoforma possui novas funções citoplasmáticos.
a) Amostras de cólon proximal B6 foram separados em fracções nucleares e citoplasmáticos e sondadas com o anticorpo MEIS1-N. A histona H1 foi utilizado para confirmar o fraccionamento subcelular. B) Análise de transferência de Western de cólon proximal B6 e células HCT116 que expressam o Meis1d ORF, utilizando o anticorpo MEIS1-N. C) Células HCT116 foram infectadas com retrovírus com a ORF Meis1d ou um vector vazio MSCV. As células foram retiradas 72 horas após a infecção, fraccionados, e sondadas com o anticorpo MEIS1-N. Os cargos de Meis1a, Meis1d nuclear (Meis1d
32), e citoplasmática Meis1d (Meis1d
27) são rotulados quando aplicável.
Para estudar os efeitos do
Meis1d
expressão
in vitro
, o quadro de leitura aberta (ORF) de
Meis1d
foi retrovirally infectados na linha de células de câncer de cólon HCT116. A análise Western blot dos lisados celulares revelou a presença de uma proteína de 32 kDa que foi detectada pelo anticorpo MEIS1-N, mas não o anticorpo Meis1d-C (Figura 3b). Este produto
in vitro
Meis1d é ~ 5 kD maior do que a proteína esperado 27 kD previsto pela transcrição Meis1d e observou
in vivo
(Figura 3b). No entanto, o peso molecular corresponde a novel 32 kD MEIS1 isoforma anteriormente observada em lisados B6 estômago e cólon (Figura 1a). O peso molecular de
In vitro
Meis1d foi confirmada em ambos os murinos 3T3 e células de símio COS-1, indicando que o aumento de tamanho não é uma linha celular específica (dados não mostrados). modificação pós-tradução de
In vitro
produtos Meis1d pode ser a causa do aumento do peso molecular, bem como a incapacidade do anticorpo Meis1d-C para detectar a proteína.
Ao contrário dos 27 kD Meis1d produto, a isoforma de 32 kDa MEIS1 está localizada para o núcleo no cólon proximal. Para determinar se
In vitro
Meis1d está também localizada no núcleo, as células HCT116 que expressam Meis1d Foram fraccionadas. Os 32 kD
in vitro
Meis1d produto estava presente nos lisados nucleares, recapitulando a
in vivo
localização subcelular do romance de 32 kDa isoforma (Figura 3c). Estes dados sugerem que ambos os 27 kD e 32 kD isoformas MEIS1 observadas no trato GI murino são traduzidos a partir do
Meis1d
transcrição. A forma citoplasmática (Meis1d
27) é o peso molecular previsto de Meis1d, enquanto que a forma nuclear (Meis1d
32) é maior, provavelmente devido a modificação pós-tradução.
nuclear e citoplasmática são Meis1d mutuamente exclusivo no cólon
o cólon é constituído por uma única camada de células epiteliais que cobrem a lâmina e várias camadas musculares. O cancro do cólon é derivado a partir de células-tronco localizadas na camada epitelial [28]. Para determinar se qualquer Meis1d
27 ou Meis1d
32 são expressos no epitélio do cólon, células epiteliais foram isolados a partir de amostras do cólon proximal e distal B6. Os lisados das células epiteliais isoladas e camadas da lâmina própria /musculares foram sondadas com anticorpo MEIS1-N. O
Meis1d proteína 27 foi exclusivamente expressa em células epiteliais do cólon proximal (Figura 4a). Meis1d
32, no entanto, foi expressa na lâmina própria camadas /musculares, tanto do cólon proximal e distal (Figura 4a). As isoformas MEIS1 completos, Meis1a e Meis1b, também estavam presentes em apenas as amostras propria /musculares lâmina (Figura 4a). Estes dados indicam que as formas nucleares e citoplasmáticos de Meis1d não estão presentes nas mesmas populações de células no cólon murino. Além disso, Meis1d
27 é expressa em células epiteliais do cólon, na ausência de comprimento completo MEIS1. Para confirmar ainda mais a expressão de células epiteliais de Meis1d
27, as amostras de cólon B6 foram coradas com anticorpo MEIS1-N. coloração citoplasmática forte foi observada no epitélio do cólon proximal, mas não o cólon distai (Figura 4b). Este padrão de expressão recapitula a expressão de Meis1d
27, novamente sugerindo que Meis1d
27 está presente nas células epiteliais do cólon proximal.
amostras A) proximais B6 e cólon distai foram separados em epitelial e fracções não-epiteliais. As fracções não-epiteliais consistem em lâmina própria e musculares camadas do cólon. As fracções e os lisados de células inteiras a partir de ambos os segmentos do cólon foram sondadas com o anticorpo MEIS1-N. As células COS-1 expressando Meis1d foram usadas para comparar o
in vitro
In vivo
pesos moleculares de Meis1d
32
e. B) proximal B6 e amostras de cólon distal foram coradas com anticorpo MEIS1-N. A coloração foi visualizada a 20 × ampliação.
A expressão da proteína MEIS1D é regulada negativamente em cancros colorrectais humanos
MEIS1 é altamente conservado nos eucariotas e remoção do exão 8 a partir do ARNm humano MEIS1 que codificam um produto proteico previsto com 99% de homologia com Meis1d murino. Com base na conservação evolutiva da MEIS1, procurou-se caracterizar a expressão da MEIS1D no cólon humano. Uma transferência de Western foi realizada em lisados de cólon humano utilizando o anticorpo MEIS1-N. Uma banda do tamanho previsto de MEIS1D
27 foi observada em amostras de cólon humano (Figura 5b). Para confirmar a expressão do transcrito MEIS1D, RT-PCR foi realizada em ADNc do cólon humano (Figura 5a). A banda de 758 pb foi amplificado, indicando que
MEIS1D
mRNA é transcrito no cólon humano.
A) amplificação RT-PCR de
MEIS1D
transcrição do cDNA do cólon humano. B) Análise de transferência de Western de lisados de tumores colorrectais humanos (T) e de mucosa normal combinado (N), utilizando o anticorpo MEIS1-N. GAPDH foi usada como um controlo de carga. As amostras representam todas as quatro seções do cólon humano:. Ascendente, transverso, descendente e sigmóide
A expressão de MEIS1 comprimento total é conhecido por ser desregulada em vários tumores sólidos [29], [30]. Para determinar o estado de MEIS1 no cancro colo-rectal, transferências de Western foram realizadas em cólon normal de correspondência e os lisados de tumor colorectal primário, utilizando o anticorpo MEIS1-N. MEIS1A e MEIS1B foram expressos tanto em amostras de tumor e normais, enquanto MEIS1D
32 não estava presente em um dos conjuntos de amostras (dados não mostrados). No entanto, 83% (10/12) de amostras de mucosa de cólon normais expressaram níveis detectáveis de MEIS1D
proteína de 27 (Figura 5b). A expressão foi reduzido ou completamente perdido em todas as amostras de tumor correspondentes destes pacientes (Figura 5b). Os dois pacientes restantes expressaram níveis indetectáveis de MEIS1D
27, tanto na mucosa e tecido de tumor normal (Figura 5b). Estes
in vivo
dados indicam que MEIS1D
27 expressão é regulada negativamente durante tumorigênese intestinal.
Discussão
O splicing alternativo é conhecido por produzir dois
MEIS1
isoformas,
Meis1a
e
Meis1b
, em ambos os ratos e seres humanos. Ambas as proteínas são Meis1a e Meis1b comprimento completo, que contém os dois domínios Meinox envolvidos em interacções proteína-proteína e o (Figura 2D) homeodomínio de ligação de ADN. Os produtos de proteína destas variantes de processamento diferem no terminal C, devido ao splicing para fora do exão 12 do
Meis1b
sequenciação de codificação (Figura 2c, d). A evidência sugere que as duas isoformas semelhantes podem activar a transcrição de diferentes subconjuntos de genes [31]. Telas de bibliotecas de ADNc indicam que um grande número de transcritos de splicing alternativo adicionais são produzidos a partir do
MEIS1
locus de [26], [27], [32]. Ao contrário de
Meis1a
e
Meis1b
, no entanto, as proteínas para outro
MEIS1
transcrições não foram observadas
in vivo
. Portanto, ainda não está claro se essas transcrições são artefatos funcionalmente relevantes ou simplesmente geradas por splicing alternativo incorreto.
Neste trabalho, nós descrevemos dois produtos proteicos da
Meis1d
variante de processamento, uma isoforma previamente identificados em rastreios de ADNc. O
Meis1d
transcrição não tem o exão 8, resultando numa proteína prevista de 27 kD sem a homeodom�io (figura 2c, d). Este produto de 27 kD foi observada no citoplasma das células epiteliais do cólon proximal (Figuras 3A, 4A). Uma segunda, 32 kD produto Meis1d ocorre no núcleo de células não epiteliais do estômago e cólon (Figuras 3A, 4A). As formas citoplasmáticos e nucleares de Meis1d foram nomeados Meis1d
27 e Meis1d
32, respectivamente. O peso molecular maior e localização nuclear do Meis1d
32 proteínas são recapituladas em células transfectadas com o
Meis1d
ORF (Figura 3b). Expressão de MEIS1D
27 em amostras de cólon humano foi também observada, demonstrando conservação evolutiva desta nova isoforma (Figura 5).
Meis1d
só é o terceiro
MEIS1
isoforma para o qual um produto de proteína traduzida foi confirmada e é também o primeiro produto MEIS1 homeodom�io-menos observada tanto em ratos ou tecidos humanos.
isoformas Homeodomínio-menos foram descritas para diversos homeobox genes, incluindo vários membros da família Hox. Apenas algumas destas isoformas, no entanto, foram identificadas nos genes da superfamília conto, um grupo incluindo MEIS1. A perda do homeodomínio previne a ligação directa a sequências alvo de ADN e de activação da transcrição normal. isoformas Homeodomínio-menos de factores de transcrição HISTÓRIA, no entanto, ter sido mostrado previamente para ainda regular a transcrição através de dois mecanismos distintos. As isoformas truncadas pode ter efeitos negativos dominantes, sequestrando proteínas completas no citoplasma e impedindo a ativação da transcrição de alvos a jusante [33], [34]. As proteínas-homeodomain menos indirectamente também podem interagir com o ADN por ligação de outros factores de transcrição para formar heterodímeros. A presença das proteínas truncadas altera sítio de ligação de ADN do complexo de proteína, activando um subconjunto distinto de alvos a jusante [35].
Desde isoformas homeodomain-menos de genes relacionados têm mecanismos distintos no citoplasma e núcleo, as localizações subcelulares de Meis1d e quaisquer parceiros de ligação potencial pode sugerir uma função celular. No presente estudo, Meis1d foi observada tanto no núcleo ou citoplasma, dependendo do tipo de célula. Meis1d
27 é expresso no citoplasma das células epiteliais do cólon proximal (Figuras 3, 4). isoformas de comprimento completo está presente na fracção nuclear de lisados cólon proximal, indicando que Meis1d
27 não sequestram outras isoformas MEIS1 no citoplasma (Figuras 3, 4). Outras evidências indicam que Meis1d
27 não é expressa nas mesmas células ou como Meis1a Meis1b, impedindo qualquer tipo de interacção negativa dominante (Figura 4). A forma citoplasmática de Meis1d ainda podem ligar-se outros factores de transcrição e desconhecido impedir localização nuclear. A isoforma também pode ter um romance função independente de homeodomain alheios a activação da transcrição.
A função potencial da Meis1d
27 está claro porque os dados não cabe qualquer mecanismo conhecido de proteínas da cauda homeodomain-less. A proteína não pode estar a actuar como um dominante negativo, uma vez que não é expressa nas mesmas células como outras isoformas MEIS1. Meis1d
27 também não pode ser activadora da transcrição a jusante no interior do núcleo, porque a proteína está localizada no citoplasma. A forma nuclear de Meis1d, no entanto, ainda pode caber qualquer um desses mecanismos na lâmina ou músculo em torno do cólon. A localização nuclear de Meis1d
32 significa que a proteína poderia estar atuando como um parceiro de ligação para outros fatores de transcrição. Meis1d
32 ainda mantém os motivos necessários para PBX interação e homodimeriza�o [36]. Estes dados sugerem que a isoforma truncada ainda pode funcionar como um co-factor com estas outras proteínas homeodomain. O Meis1d
32 proteína pode também estar agindo isoforma negativo como dominante dentro do núcleo, impedindo associação entre proteínas MEIS1 completos e regiões promotoras no DNA. Além disso dissecção da lâmina e da camada muscular subjacente é necessária para determinar se Meis1d
32 e quaisquer potenciais parceiros de ligação são expressas na mesma população de células. Identificação dos papéis funcionais tanto para Meis1d
32 e Meis1d
27 irá ajudar a explicar a importância de
MEIS1
splicing na função intestinal e homeostase.
Apesar da falta de uma função definida