Abstract

O EGF-família de receptores de tirosina-quinase ativa as vias citoplasmáticos envolvidos na proliferação celular, migração e diferenciação em resposta a ligantes extracelulares específicos. Ao lado destas vias canônicas, a localização nuclear do ErbB receptores em tumores primários e linhas celulares de cancro levou a investigar o seu papel como reguladores da transcrição de genes do cancro. A localização nuclear de ErbB3 foi avaliado em vários tecidos de cancro e linhas de células, mas as funções nucleares e a correlação com a progressão tumoral putativo e resistência à terapia permanecem obscuros. Em primeiro lugar, avaliaram a expressão de ErbB3 em tecidos normais e tumorais da próstata. A coloração nuclear foi devido principalmente a uma isoforma combinando o domínio C-terminal de comprimento completo a ErbB3

receptor de 185kDa. A coloração nuclear foi também restrito a células cancerosas e foi aumentada no cancro da próstata resistente à castração avançado quando comparado com tumores localizados, sugerindo que pode estar envolvido na progressão do cancro da próstata até à fase resistente à castração terminal. experimentos ChIP-on-chip foram realizadas em linhas de células imortalizadas e tumorais seleccionadas sobre caracterização da expressão nuclear endógena de um ErbB3

80 kDa isoforma. Entre os promotores-alvo identificados 1840, 26 foram seleccionadas antes ErbB3

80 kDa a expressão do gene-dependente foi avaliada por em tempo real quantitativa de RT-PCR, fornecendo indícios de que ErbB3

80 kDa exercida controlo transcricional em esses genes. Alguns alvos já são conhecidos por estar envolvidos na progressão do cancro da próstata, mesmo que nenhuma ligação foi previamente estabelecido com membrana ErbB3 e /ou de sinalização nuclear. Muitos outros, ainda não associados com câncer de próstata, poderia fornecer novas possibilidades terapêuticas para pacientes que expressam ErbB3

80 kDa. Detectando ErbB3

80 kDa poderia, assim, constituir um marcador útil de prognóstico e resposta terapêutica

Citation:. El Maassarani M, Barbarin A, Fromont G, Kaissi O, Lebbe M, Vannier B, et al. (2016) integrado e Análise Genómica Funcional Valida a relevância do Nuclear Variant ErbB3

80 kDa no cancro da próstata progressão. PLoS ONE 11 (5): e0155950. doi: 10.1371 /journal.pone.0155950

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 20 de julho de 2015; Aceito: 07 de maio de 2016; Publicado: 18 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 El Maassarani et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Dados Microarray estão disponíveis no ArrayExpress: E-MTAB-3499, E-MTAB-3504

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Ligue contre le cancer, LCC PS /2012-13-14 para PS; Groupe Pasteur Mutualidade a AB; e Ministère de l’éducation nationale de la recherche et des technologies 2010-2014 para MEM. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A família EGF de receptores consiste de quatro tirosina-quinase (TK) receptores (EGFR /ErbB1, HER2 /ErbB2, HER3 /HER4 ErbB3 e /ErbB4) com um domínio de ligação ao ligando extracelular, um domínio transmembranar e um domínio intracitoplasmática. Após ligando específico de ligação na superfície da célula, receptores ErbB dimerizar e desencadear vias intracelulares envolvidas na proliferação celular, migração e diferenciação [1]. A desregulamentação do ErbB vias a jusante, através de três mecanismos mains -Aumento expressão do receptor, o aumento da expressão ligando ou ativando mutação do domínio- TK está frequentemente envolvido na tumorigênese [2]. Em adição à sua localização na membrana do plasma, receptores ErbB foram também descritas no núcleo e várias funções têm sido atribuídos aos receptores ErbB translocados entre as quais a proliferação celular, a reparação do ADN e a transcrição de controlo [3-8]. A este respeito, o receptor de comprimento completo ErbB1 no núcleo está associado ao aumento da expressão de genes proliferativas e metastáticas [9-11]. A expressão da proteína pro-apoptótica e pró-angiogénico de COX-2 é modulada em cima na

COX-2

promotor em células de tumor mamário de [12] de ligação de ErbB2. ErbB2 também funciona como um co-ativador transcricional da proteína Stat3 no promotor

CCND1

(ciclina D1) [13] e colabora com ErbB1 para regular

a expressão do gene STAT1

[14] . O comprimento total ErbB3

proteína de 185kDa ou isoformas curtas foram descritos no núcleo das células normais mamárias epiteliais [15] e células de Schwann [16], bem como em várias linhas celulares de cancro humano: mama (SKBR3, células MCF-7 et BT474), pulmão (H226 et SCC6) de cabeça e pescoço (SCC6 et SCC1) e cólon (LoVo et CaCO2) [15, 17-19]. No cancro H358 não-pequenas células do pulmão (NSCLC) e linhas de células da mama SKBR3, ErbB3 foi mostrado exercer função como um activador da transcrição para a co-

CCND1

expressão do gene [17,19]. O forte potencial de transativação de ErbB3 depende quase exclusivamente no domínio do terminal C do receptor [19].

O câncer de próstata (PCA) é o tumor maligno urológica mais comum ea segunda causa de morte por cancro nos países industrializados . Tumor recorrência após ablação cirúrgica ou radioterapia ocorre frequentemente em uma fração significativa de pacientes que desenvolvem doença disseminada agressivo. Como as células CaP contar com receptor de andrógeno (AR) atividade para o crescimento e proliferação, terapia retirada de andrógeno foi aprovado nos casos avançados [20]. Os efeitos benéficos são observados durante cerca de 24 meses antes de o paciente desenvolve resistente à castração-câncer de próstata fatal (CRPC). Os mecanismos moleculares envolvidos na resistência à terapia ainda não são claras. Uma explicação para a recidiva de um paciente após o tratamento poderia vir de conversa cruzada entre os sinais de AR e a família do factor de crescimento epitelial de receptores (EGFR) vias [21]. Os receptores ErbB e os seus ligandos são expressos na próstata normal de adulto para manter a homeostase do órgão e ErbB1, ErbB2 e ErbB3 são frequentemente aumentada durante a progressão CaP [22]. Em CRPC, aumentou receptor ErbB2 e /ou ErbB1, ErbB2 ou expressão ErbB3-ligantes está associada com mau prognóstico e metástase [23-25].

Para contornar os mecanismos de resistência ao andrógeno-terapia, ErbB1 e ErbB2 TK-inibidores foram testados ao lado de terapia a base de hormônios em pacientes com alto grau, tumores CRPC. No entanto, os ensaios não foram bem sucedidos como células tumorais desenvolvido vias compensatórias pela regulação da expressão ErbB3 e localização [18,26]. Na verdade, vários estudos têm relatado a localização nuclear de ErbB3 em tecidos da próstata e linhas celulares de CaP potencialmente correlacionados com a progressão da doença [18,27] mecanismos .A proteína ErbB3 nuclear poderia, assim, desempenhar um papel fundamental na CaP progressão e terapia de resistência, mas a moleculares envolvidos ainda permanecem inexploradas.

o presente estudo demonstra a relevância funcional de localização nuclear ErbB3 em APC e fornece novas pistas para a compreensão dos caminhos associados com a progressão do cancro e resistência à terapia.

Materiais e Métodos

pacientes Tissue microarrays

consentimentos informados por escrito foram obtidas de pacientes de acordo com os requisitos da comissão de ética institucional do Centro hospitalo-Universitaire de Poitiers que aprovou o estudo. 169,, tecidos de arquivamento embebidos em parafina fixadas em formol de pacientes atendidos no “Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers” para a APC, foram incluídos. 137 amostras de tecidos foram obtidas de pacientes sensíveis ao hormônio (SH) que foram submetidos a prostatectomia radical para câncer clinicamente localizado, nenhum desses pacientes receberam terapia hormonal privação antes da cirurgia. Destes, 97 foram palco pT2 e 40 pT3. A pontuação de Gleason foi, respectivamente, 6 em 38 pacientes, 7 em 83 pacientes, e 8 ou mais em 16 pacientes. 32 amostras de tecido foram obtidas por ressecção trans-uretral de pacientes CRPC. tecido da próstata com aparência normal de 50 pacientes tratados por prostatectomia radical, também foram incluídos. A imunocoloração foi realizada utilizando os seguintes anticorpos: ErbB3 C-ter (policlonal de coelho sc-285, Santa Cruz Biotechnology 1/200), ErbB3 N-ter (rato monoclonal Ab-5 H3.105.5 Clone, Neomarkers, 1/50), CCND1 (Rabbit monoclonal, clone EP12, DAKO, 1/50) e Ki67 (monoclonal mouse, clone MIB-1, DAKO, 1/100). Os controlos negativos foram obtidos através da utilização de um anticorpo irrelevante. Tecido de linfoma de zona do manto foi utilizado como controlo positivo para Ki67 e CCND1. As lâminas foram analisadas por 2 observadores de uma forma cega. Para ErbB3C-ter, CCND1 e coloração de Ki67, cada núcleo de tecido foi determinado um valor constante que representa a percentagem de células tumorais que apresentam uma coloração nuclear. Para cada paciente, o núcleo com o maior percentual foi selecionado.

As linhas celulares

células da próstata RWPE Humanos (ATCC

® CRL11609 ™), células epiteliais normais imortalizados por HPV-18, foram mantidas em queratinócitos isento de soro suplementado com extracto de pituitária de bovino (BPE, 0,05mg /ml), factor de crescimento epidérmico humano recombinante e (EGF, 5 ng /mL) (Invitrogen). próstata humano linha celular LNCaP (ATCC

® CRL1740 ™) derivada a partir do nodo linfático e PC3 (ATCC

® CRL1435 ™) A linha celular derivada de metástase óssea, foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de vitelo e 1% penicilina /estreptomicina.

foram realizados

western blotting

extractos de proteína e a análise de western blot, tal como descrito em [17]. Os extractos nucleares e não nucleares foram preparados como se segue: as células foram ressuspensas em Tris-HCl pH 7,5 10 mM, NaCl 120 mM e lisadas com NP40 a uma concentração final de 0,3%. Após centrifugação durante 5 min a 2500 g, os sobrenadantes foram suplementadas com EDTA 1 mM, DTT 1 mM, SDS a 0,1%, PMSF PIC 1/50 e 1/100 para constituir a fracção não nuclear. O sedimento de núcleos correspondente foi lavada três vezes em Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 120 mM, NP40 a 0,3% para eliminar os resíduos citoplasmáticos, em seguida, lisadas como acima.

Chip-on-chip

as células foram tratadas com 1% de formaldeído e extracção da cromatina foi realizada com o simples ChIP enzimática cromatina IP kit (Cell Signaling Technology, CST) de acordo com a recomendação do fabricante. A cromatina recuperado foi digerido por Micrococo nuclease para obter fragmentos de cromatina em torno de 500pb tamanho. Neste passo, uma amostra de DNA total (de entrada) foi recolhido para utilização subsequente. A imunoprecipitação foi realizada utilizando anticorpos anti ErbB3 C-Ter (SC-285 ou SC-7390, SCBT) ou H3 anti-(controlo positivo, Histona H3 anticorpo ChIP formulado # 2650, CST) e para a incubação com o coelho normal não relevante IgG (controle negativo CHIP). O ADN total e ChIP-ADN foram amplificados utilizando o kit de amplificação do genoma inteiro (WGA-2, Sigma-Aldrich) e, respectivamente, marcado com Cy-3 ou Cy-5 fluorocromos usando BioPrime matriz kit Genomic Rotulagem (Invitrogen). amostras marcadas foram hibridizados em Promotores Humanos microarrays (Agilent Promotor Humano ChIP-on-Chip Microarray Set 244K, P /N G4489A) de acordo com a recomendação do fabricante.

Normalização e análise de dados microarray

dados fornecidos por Agilent alta resolução do scanner DNA Microarray foram analisados ​​usando recurso de extração de 10,1 Software (Agilent Technologies). As manchas de fluorescência que não conseguiram passar o controle de qualidade foram excluídos. Sinais de rácios de enriquecimento (Chip /entrada) relacionados com repetições fundidas foram calculados utilizando software cocas [28]. promotores enriquecido-ErbB3 a partir de três experiências independentes foram isolados utilizando o algoritmo de detecção de picos em cocas seguido pelas contagens de enriquecimento calculados por medição da área do pico eficaz.

-PCR em tempo real quantitativa (qPCR) análise

qPCR experimentos foram realizados em ADN imunoprecipitado-ErbB3 ou IgG-controlo, usando o GoTaq master Mix qPCR (Promega) de acordo com as instruções do fabricante num sistema 7500 rápida PCR em tempo real (Applied Biosystems). enriquecimento relativa foi estimada após a quantificação do sinal de PCR, medindo a proporção de IP ErbB3 /IgG. Lista de primers ChIP-qPCR é dada na Tabela 1.

isolamento do RNA e RT-qPCR

células LNCaP e PC3 foram transfectadas com 20pmol de siRNAs controle ou específicos de ErbB3 (Eurogentec ) antes de ARN total foi extraído utilizando RNAble (EUROBIO). ADNc foram sintetizados a partir de ARN total 2-6μg e amplificado por qPCR como descrito acima. GAPDH foi utilizada como controlo interno para normalizar a expressão do gene. Lista de primers cDNA RT-qPCR é dada na Tabela 2.

Resultados

expressão ErbB3 e localização nos tecidos normais e tumorais da próstata

137 HS, 32 CRPC e 50 que aparecem normalmente tecidos tumorais adjacentes foram analisados ​​por imuno-histoquímica (Figura 1). Em todas as amostras, a coloração para ErbB3 N-ter, quando presente, foi localizado principalmente na membrana, e nenhuma coloração nuclear foi observada (Fig 1A). Todas as 169 amostras exibida coloração citoplasmática com ErbB3 C-ter. (Figura 1B). Em contraste, a coloração nuclear foi observada com ErbB3 C-ter em 60 dos 169 (35%) amostras de APC, mas em nenhuma das amostras não-tumorais. ErbB3 expressão nuclear foi observada mais frequentemente em CRPC (17/32, 53%) do que em tumores SH (43/137; 31%) (p = 0,03, teste de Chi 2). Além disso, quando presente, a percentagem de CaP expressam ErbB3 no núcleo foi maior em CRPC (mediana 10%, intervalo de 2-95%) do que nos cancros SH (mediana de 2%, intervalo de 1-20%) (p = 0,007, Mann Whitney). A expressão mediana de CCND1 foi de 15% de células cancerosas da próstata SH (intervalo 0-70%, não mostrado) e 20% de células de cancro em tecidos CRPC (intervalo de 0-80%) (Figura 1D e 1G). A taxa de proliferação média avaliada por coloração de Ki67 foi de 1% das células APC nos tecidos SH (intervalo 0-10%, não mostrado) e 17,5% em amostras CRPC (Fig 1E) e 1H. Em HS, não houve associação significativa entre ErbB3 nuclear, CCND1 (p = 0,09) ea taxa de proliferação (p = 0,1, teste de Spearman). Em CRPC, a expressão nuclear de ErbB3 foi significativamente associada com

CCND1

expressão, com uma correlação positiva (p = 0,01, teste de Spearman) (Fig 1C e 1D vs 1F e 1G). Para retomar, ErbB3 nuclear é altamente e frequentemente expressa em CRPC e correlaciona-se com a expressão CCND1, ao passo que nenhuma correlação significativa foi observada em tumores do SH.

A coloração com anticorpo N-ter ErbB3 em tecidos ACP foi localizado na membrana, sem expressão nuclear (a). Nenhuma coloração nuclear ErbB3 C-ter foi detectada em tecidos da próstata “normal” (b). ErbB3 expressão nuclear foi observada em células APC, e mais frequentemente em tumores mais avançados CRPC quando comparado com cancros clinicamente localizado. Em CRPC, coloração nuclear elevada foi associada a expressão de alta CCND1 e tenderam a ser associada a uma maior proliferação (Ki67) (CRPC 1, CE), ao passo que a maioria dos tumores sem coloração nuclear exibida baixa expressão CCND1 e tendia a mostrar proliferação inferior (CRPC 2, fh).

expressão ErbB3 e localização em linhas de células de próstata

a seguir, avaliou expressão ErbB3 endógena e localização em linhas de células de próstata utilizando anticorpos C-ter ErbB3. Por imunof luorescência indirecta, ErbB3 coloração era principalmente presente na membrana de plasma e no citoplasma das células RWPE ao passo que uma elevada coloração nuclear foi detectada em linhas celulares de tumores (Fig 2A). A análise Western blot de extratos de proteínas totais mostrou que as três linhas celulares expressaram níveis similares do full-length ErbB3

proteína de 185kDa. Uma proteína de 80 kDa adicional foi especificamente detectado nas (PC3) linhas celulares de tumor (LNCaP) e hormona-resistente sensível à hormona (Fig 2B). Em seguida, transferência de Western foi realizada em não nuclear vs fracções de proteínas nucleares. A qualidade dos extractos foi validado pela detecção específica da proteína citosólica PAK1 nos extractos nucleares e não a proteína (nucleolina) C23 nos extractos nucleares. Como mostrado, ErbB3

185kDa foi expresso principalmente nas fracções não-nucleares e estava ausente ou ligeiramente detectável nas fracções nucleares de todos os tipos de células. Em vez disso, a proteína de 80 kDa foi detectada quase exclusivamente nas fracções nucleares de células LNCaP e PC3 (figura 2c). Estes dados sugerem que a proteína nuclear detectado em células CaP poderia corresponder essencialmente à

isoforma de 80 kDa nuclear ErbB3 anteriormente descrito em linhas celulares de cancro do pulmão [17].

(a) os dois RWPE e células PC3 exibir citoplasmática ErbB3 e localização membrana. Além disso, as células PC3 nativas exibem uma localização nuclear forte detectada pelo anticorpo ErbB3 C-ter (sc-285, Santa Cruz Biotechnology-). (B) Em extractos de proteína total, o anticorpo C-ter ErbB3 detecta a proteína de comprimento completo ErbB3

185kDa em todas as linhas de células e a proteína 80 kDa no LNCaP e linhas de células tumorais PC3. (C) O comprimento total ErbB3

proteína de 185kDa quase só é detectada nas fracções não nucleares que incluem membrana do plasma e as proteínas citoplasmáticas Considerando que um sinal forte 80 kDa é observado nas fracções nucleares de as linhas de tumor. (D) um produto de amplificação de 719 pb foi detectado em três das linhagens celulares com os iniciadores desenhados para amplificar tanto o ARNm de comprimento completo (NM_001982.3) e a variante AK300909.1 (PCR1), enquanto que os iniciadores PCR2 e PCR3 específicos para AK124710. 1 e AK1250281 respectivamente, não conseguiu amplificar qualquer sequência. (E) A análise quantitativa com primers específicos para transcrições ErbB3 indicam que NM_001982.3 e AK300909.1 são expressos em níveis comparáveis ​​em LNCaP e linhas celulares PC3 enquanto AK300909.1 é ligeiramente detectável em células RWPE.

Entre as variantes putativas relatadas em bases de dados públicas que poderiam ser transcritas a partir do

ErbB3

gene, apenas três poderiam corresponder à ErbB3 nuclear

proteína de 80 kDa. Falta-lhes a “sequência que codifica os cinco domínios de ligação ao ligando e transmembranares do receptor e possuem sinais de localização nucleares preditos (NLS) [29]. Para discriminar entre estas variantes, foi realizada RT-PCR com iniciadores ao redor do codão de partida ATG dos mRNAs. Nas três linhas celulares, um produto de PCR de 719 pb foi detectado com o par de iniciadores (PCR1), permitindo a amplificação tanto do NM_001982.3 comprimento completo e as transcrições variante AK300909.1 que partilham a mesma sequência nucleotídica. Esta experiência levou-nos a eliminar AK124710.1 e AK1250281 e concentrar-se na transcrição AK300909.1 (Fig 2D). Esta variante está previsto para codificar uma proteína de 699aa, cuja sequência é estritamente idêntica ao domínio intracelular de ErbB3

185kDa. Para discriminar entre NM_001982.3 e expressão AK300909.1 nas linhas celulares, RT-qPCR foi realizado utilizando iniciadores que amplificam os dois transcritos ou iniciadores específicos para a sequência 5 ‘codificante de NM_001982.3 (Figura 2E). Como se mostra, ambos os transcritos foram expressos ao mesmo nível em células LNCaP e PC3, enquanto AK300909.1 era dificilmente detectáveis ​​em células RWPE (Figura 2E).

Assim, as linhas celulares LNCaP e tumor da próstata PC3 codificar dois diferentes isoformas da proteína ErbB3

185kDa e ErbB3

80 kDa, correspondente ao NM_001982.3 e mRNA AK300909.1 transcrições respectivamente.

análise Genome-wide de promotores ErbB3-alvo em células de câncer de próstata

para identificar genes ErbB3-alvo, nós próxima realizados ensaios chIP-on-chip utilizando anticorpos C-ter ErbB3 validado-chip [17] de acordo com o fluxo de trabalho descrito (Fig 3A). regiões genômicas ligadas a ErbB3 foram investigados pela primeira vez usando o software V2.4 cocas independentes [28]. Após a etapa de pré-processamento, o algoritmo de detecção de pico detectados sinais de alta sonda correspondente a mudanças significativas na relação de Cy3 /Cy5 de regiões genômicas enriquecidas. Um total de 68% das sondas ErbB3-alvo estavam localizados nos promotores do núcleo, ao passo que 30% estavam dentro dos genes e 2% a jusante do local de início da transcrição (SAT). Significativamente sondas enriquecidos foram identificados acima de um limite ajustado para 0,998, levando para identificar finalmente 1840 promotores ErbB3-alvo distribuídos da seguinte forma: 317 promotores em RWPE, 606 em LNCaP e 1297 em células PC3, entre os quais 8 foram encontrados nas linhas de células 3 e 361 foram partilhadas pelas linhas celulares LNCaP e PC3 (figura 3B). Os dados foram confirmados com o 7.0 software Agilent Workbench. A distribuição do sinal ao longo dos promotores foi utilizada para conceber iniciadores de ChIP-qPCR nas regiões que exibiram a mais elevada concentração de sondas enriquecidas-ErbB3 com o registo mais elevado ratio (Fig 3C). O número de promotores alvo foi significativamente maior em células PC3 hormona-resistente do que em células de LNCaP sensíveis a hormona, o que sugere o envolvimento de ErbB3

80 kDa em progressão CaP e agressividade, de acordo com os dados obtidos em pacientes (Fig 1). listas de genes derivados de experimentos ChIP-on-chip foram ainda analisados ​​com DAVID (banco de dados para anotação, visualização e descoberta Integrado) [30]. anotação funcional confirmou o envolvimento de ErbB3

alvos 80 kDa em processos celulares altamente desregulados nos mecanismos de tumor (Fig 3D). Um número significativo de ErbB3

alvos 80 kDa em PC3 ou PC3 e linhas de células tumorais LNCaP foram já conhecida por estar associada com o APC, ou outros tumores sólidos, o que sugere que ErbB3

80 kDa poderia regular de uma forma mais geral, os mecanismos de a progressão do tumor (Fig 3D).

(A) Cromatina imunoprecipitação foi realizada em condições endógenas. Os lisados ​​nucleares foram preparados a partir de células nativas cultivadas em meio completo e sem qualquer androgénio. ChIP-ADN e ADN total (entrada) marcado com Cy5 e Cy3 fluoróforos, respectivamente, foram co-hibridada em promotores Agilent cultivando matrizes. (B) A análise dos dados com o software cocas levou para selecionar 1840 promotores ErbB3-alvo nas três linhas celulares. (C) análise Agilent Worbench 7,0 software que ilustra a distribuição de sondas positivos (DNA ligado /-ErbB3 pontos vermelhos) e sondas negativos (entrada /pontos verdes) em toda a sequência de genes (eixo X). A intensidade do sinal é mostrado no eixo dos Y.

CCND1

e

MMP7

correspondem aos controlos positivos e negativos, respectivamente. (D) Análise de Gene ontologia do ErbB3-alvos com DAVID.

validação ChIP-qPCR de promotores alvo ErbB3 nuclear em células de câncer de próstata

Entre os alvos 1840, foram selecionados 26 genes para validação ChIP-qPCR (figura 4). Quatro promotores não-enriquecido (

ErbB3

,

EBP1

,

PSA

e

MMP7

) foram utilizados como controlos negativos e exibido sem amplificação significativa, enquanto

CCND1

promotor exibido de 7 a 12 vezes o enriquecimento em LNCaP e células PC3, respectivamente (Figura 4). Os alvos específicos de LNCaP-3 exibiu dobra enriquecimento significativo em células LNCaP e não em células PC3, ao passo que um enriquecimento forte e específica foi observada para os objectivos específicos 6-PC3 na linha celular PC3 (Fig 4A vs 4B). Enriquecimento vezes observado para os promotores partilhados variada, dependendo do alvo e a linha de células, mas sempre mais elevado em células PC3 hormona-resistente do que em células LNCaP.

ErbB3-alvo

Com base dos dados de bioinformática, 16 seleccionados aleatoriamente promotores de células LNCaP (A) e 19 promotores ErbB3-alvo seleccionados aleatoriamente a partir de células PC3 (B) foram testadas. Todos mostraram um enriquecimento ErbB3 significativa em comparação com o controlo negativo ChIP-IgG (valor normalizado para 1). O

CCND1

promotor foi usado como um controle positivo enquanto promotores não enriquecido

ErbB3

,

EBP1

,

PSA

, e

MMP7

foram usadas como controlos negativos. Os dados são representativos de 3 experiências independentes e são as médias de amostras em triplicado. * P 0,05, ** P . 0,01, ns = não significativo, de Student

t

teste

A regulação transcricional de genes alvo dependente de ErbB3

dada a estrutura da transcrição AK300909.1, não há siRNAs específicos para esta variante pode ser concebida. Assim, abordamos os efeitos de transcrição de ErbB3

80 kDa por análise subtrativo: Foram utilizados dois tipos de siRNAs, visando quer o “sequência de codificação 5 a NM_001982.3

ErbB3

transcrição (siErbB3A) ou 3 “sequência de ambos NM_001982.3 e AK300909.1

ErbB3

transcrições (siErbB3B), conforme indicado na Fig 5A codificação. Os ARNsi foram validados por RT-qPCR (não mostrado) e análise de transferência de Western: ErbB3

expressão 185kDa foi inibida por ambos os siRNAs, enquanto que ErbB3

expressão 80 kDa foi apenas diminuiu siErbB3B em LNCaP e linhas celulares PC3 (Figura 5A ). Sob estas condições, nós próxima analisada a expressão de ErbB3 15

80 kDa genes-alvos (Fig 5B). Como esperado, a expressão de

CCND1

foi significativamente reduzida em células LNCaP e PC3 transfectadas com siErbB3B vs siErbB3A, o último apresentado nenhuma diferença com o ARNsi de controlo. O mesmo se aplica para o

GATA2

,

Runx2

,

MAP3K14

e

ErbB2

nas duas linhas celulares, e por

ARID1A

em células PC3. Por outro lado, siErbB3B induzida expressão mais elevada para

PPIG

e

MXI1

nas duas linhas celulares e para

ID3 Comprar e PC3-únicos alvos em células PC3 (Fig 5B). Para simplificar a análise dos dados, a percentagem de mudança de dobragem expressão que pode ser especificamente atribuído à isoforma nuclear foi calculada com o (expressão relativa de genes após tratamento siErbB3B) fórmula /(expressão do gene em relação mediante tratamento siErbB3A) para cada gene alvo (Figura 5C) . Como mostrado, ErbB3

80 kDa transcricionalmente ativa

CCND1

,

GATA2

,

Runx2

,

MAP3K14 Comprar e inibe

PPIG

,

MXI1

em células tanto LNCaP e PC3, enquanto inibe

TBCC

,

sin3a

,

ACE,

ID3

,

RAD52

,

CXCR3

em apenas células PC3. A análise Western blot realizado em ErbB3

80 kDa-alvos transcricionais confirmaram os efeitos da isoforma ErbB3 nuclear ao nível da proteína (Fig S1).

(A) Dois ARNsi foram utilizados para inibir especificamente a NM_001982.3 transcrição (siErbB3A) ou ambos o NM_001982.3 e AK300909.1 transcritos (siErbB3B) e validada por transferência de western utilizando o anticorpo ErbB3 C-ter. células LNCaP e PC3 (B) foram transientemente transfectadas com siErbB3A ou siErbB3B antes de ARNm transcrito de forma inversa e foram amplificados. RT-qPCR foi realizado sobre uma selecção de genes-alvo ErbB3. mudança Expressão vezes foi normalizada para controlar amostras siRNA transfectadas. As transfecções foram efectuadas em triplicado, e os resultados de RT-qPCR relatados são de pelo menos três experiências independentes. (C) Expressão mudança vezes consecutivas para a inibição do ErbB3

80 kDa isoforma em cada linha de células e para cada gene alvo é calculada pela (a expressão do gene em relação mediante tratamento siErbB3B) /relação de (a expressão do gene em relação mediante tratamento siErbB3A). ErbB3

80 kDa dependente de activação da transcrição da

GATA2

,

Runx2

,

MAP3K14

,

ErbB2

e

CCND1 Comprar e inativação de

PPIG

, MXI1 foram semelhantes em LNCaP e PC3 enquanto

ARID1A

,

TBCC

,

FYN

,

sin3a

,

TOR3A

,

ACE

,

RAD52

,

CXCR3A

parecia ser regulados diferencialmente nas duas linhas celulares. * P 0,05, ** P 0,01, ns = não significativo, de Student

t

teste

Os dados aqui apresentados podem ser integrados para propor um modelo para ErbB3 nuclear.

funções 80 kDa na progressão do câncer de próstata (Fig 6).

bloqueio de sinalização dependentes de RA por terapia retirada de andrógeno (AWT), primeiro inibe o crescimento do tumor, mas as vias de proliferação breve alternativas são reativados induzir a progressão do tumor. O aumento da expressão de ErbB3 e subsequente reactivação da via PI3K em resposta a AWT é um dos principais mecanismos de resistência dos tumores. Alternativamente, relatamos aqui a acumulação nuclear de ErbB3

80 kDa, uma variante sem o domínio de ligação ao ligando e de transmembrana de ErbB3

180kDa, em avançado CaP resistentes à terapia (CRPC). Como co-regulador para a transcrição de genes associados com a proliferação celular, diferenciação, apoptose, oncogénese, ErbB3

80 kDa é susceptível de ser fortemente envolvidos na resistência à terapia e a progressão para CaP fatal.

DHT

:

dihidrotestosterona; AR

:

receptor de andrógeno; Are:.

elementos que respondem a androgénios

Discussão

O objetivo deste estudo foi o de trazer para fora vias moleculares envolvendo ErbB3 na progressão tumoral e metastático propagação , a fim de caracterizar novos alvos terapêuticos potenciais para o cancro da próstata. terapias recentes aprovado para próstata periódico atraso câncer progressão metastática e prolongar a sobrevida global, mas ainda não conseguem inibir a progressão do tumor para CRPC fatal. expressão e /ou activação da família ErbB de receptores tirosina quinase inadequado tem sido relatada em CaP avançado, conduzindo a considerar ErbB1, ErbB2 e ErbB3 como marcadores de diagnóstico e prognóstico potenciais [22,31]. Por conseguinte, o aumento da expressão de ErbB3 foi reportado em CaP dependentes de androgénio tratada por retirada de androgénio e foi associado com prognóstico pobre. Esta sobre-expressão correlaciona-se com a progressão do ciclo celular e a reactivação da actividade transcricional do AR, na ausência de androgénios [26]. Além disso, a compartimentação nuclear de ErbB3 foi sugerido para desempenhar um papel na progressão CaP mas os mecanismos envolvidos ainda permanecem desconhecidos [18,27,32].

O primeiro investigada a expressão de ErbB3 em normal ou tumoral tecidos da próstata. Coloração para ErbB3 N-ter dirigido na membrana, sem expressão nuclear. Usando o anticorpo C-ter ErbB3, a coloração nuclear foi observada foi restrita a células APC e foi aumentada no cancro da próstata resistente à castração avançado quando comparado com tumores localizados. Estes dados reforçam o envolvimento da proteína ErbB3 nuclear na progressão CaP até à fase resistente à castração terminais [18]. Como não conseguimos detectar coloração nuclear no CRPC com anticorpos N-ter anti ErbB3, assumiu-se que a proteína ErbB3 nuclear poderia ser uma variante, no modelo das ErbB3

80 kDa ou ErbB3

isoformas de 50 kDa previamente descritos [16 , 17]. a expressão da proteína ErbB3 avaliada em linhas de células normais e de próstata tumor confirmou a nossa hipótese, com o receptor de comprimento completo ErbB3

185kDa expressa principalmente na fracção de proteína não nuclear de todas as linhas de células e uma ErbB3

80 kDa isoforma detectada principalmente no fracção de proteína nuclear das linhas celulares de tumor. Até à data, apenas a proteína ErbB3

185kDa comprimento completo foi relatado no núcleo de tumores da próstata e linhas celulares [15,19]. Os mecanismos de localização nuclear analisados ​​encaminhamento medida envolver a partir de endossomas e /ou clivagem de membrana a seguir a activação do receptor [5-7, 32-36]. Dado que ErbB3

185kDa é a tirosina quinase deficiente, a sua fosforilação ocorre após a dimerização com outros membros da família ErbB [37].