Abstract

A activação constitutiva da via Wnt leva à formação de adenoma, um passo obrigatório no sentido de câncer intestinal. Tendo em vista o papel estabelecido de Wnt na regulação stemness, buscou o isolamento de células-tronco cancerosas (CSCs) a partir de

Apc viajantes – e

Apc

/

KRAS

-mutant tumores intestinais. Considerando CSCs estão presentes em

Apc

/

KRAS

tumores, eles parecem ser muito raro ( 10

-6) no

Apc

adenomas -mutant . Em contraste, o Lin

-CD24

hiCD29

+ subpopulação de células de adenocarcinoma parecem ser enriquecido em CSCs com o aumento dos níveis de β-catenina activo. Expression profiling análise da subpopulação CSC-enriquecido confirmaram a sua actividade aumentada de Wnt e revelou expressão diferencial adicional de outras vias de sinalização, as proteínas de ligação do factor de crescimento e componentes da matriz extracelular. Como esperado, os genes característicos da linhagem de células Paneth (por exemplo, defensinas) são co-expresso juntamente com genes de células estaminais (por exemplo,

Lgr5

) dentro da subpopulação CSC-enriquecida. Isto é de interesse, uma vez que pode indicar um papel de nicho de células-tronco do câncer de Paneth-like células derivadas de tumores, semelhante ao seu papel no apoio Lgr5

+ células-tronco na cripta intestinal normal. No geral, nossos resultados indicam que oncogênico

KRAS

ativação no

Apc

-driven tumores resulta na expansão do compartimento de CSCs, aumentando a estabilização intracelular ®-catenin

Citation.: Ghazvini H, Sonneveld P, Kremer A, P Franken, Sacchetti A, Atlasi Y, et al. (2013) Cancer stemness em

Apc viajantes – vs.

Apc

/

KRAS

-Driven Intestinal Tumorigênese. PLoS ONE 8 (9): e73872. doi: 10.1371 /journal.pone.0073872

editor: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de março de 2013; Aceito: 24 de julho de 2013; Publicação: 17 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ghazvini et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os financiadores não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Estes estudos foram apoiados por bolsas do Cancer Society Holandês (EMCR 2001-2482), a Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO /Vici 016.036.636), o programa BSIK (Kennisinfrastructuur) do governo holandês de subvenção 03038 (www.stemcells. nl) e do Instituto Holandês para a medicina regenerativa (NIRM; www.nirm.nl) e o 6º PQ UE e FP7 consórcios Cancer Migração de células Estaminais do programa (MCSCs; www.mcscs.eu) e TuMIC (conceito integrado de metástase do tumor (http : //itgmv1.fzk.de/www/tumic/tumic_main.htm)

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do cólon ainda representa um modelo ideal para estudar os mecanismos moleculares e celulares que estão subjacentes início e progressão do tumor no sentido de malignidade [1], o chamado adenoma-carcinoma sequência de [2]. de modo geral, as mutações de perda de função no

APC (polipose adenomatosa coli) gene supressor de tumores oncogénicos ou mutações em β-catenina (

CTNNB1

) conduzem à activação constitutiva de sinalização de Wnt /β-catenina e representa a taxa mais comum limitante (adenoma -forming) eventos entre pacientes com câncer de cólon. crescimento adenoma e progressão é muitas vezes acompanhada por alterações no

KRAS

ou

BRAF

, seguido pela perda do

TP53

e

SMAD4

supressores de tumor pensado para subjacente à transformação maligna em adenocarcinoma invasivo local [1]. No entanto, este modelo de evolução genética bem estabelecida não ter em conta outras características essenciais de cancros do cólon humanos, ou seja, a sua heterogeneidade celular (diferentes linhagens celulares estão frequentemente presentes no interior da massa principal) e o suposto papel desempenhado por uma subpopulação de células tumorais, a células-tronco cancerosas (CSCs), na condução do crescimento do tumor e determinar invasão local para os tecidos circundantes e metástases à distância [3]. Na verdade, embora o modelo genético acima poderia prever que cada célula tumoral dentro de um câncer de cólon supostamente iniciado por um

APC

ou mutação β-catenina invariavelmente devem ser individualizados pelos a marca de activação Wnt constitutiva β-, ou seja, nuclear acumulação catenina, isto só é observado numa minoria das células geralmente situadas na frente invasiva da lesão primária [4], de onde se destacam e invadem o estroma circundante [5], [6]. Este “paradoxo β-catenina” ilustra bem como a heterogeneidade intra-tumor e, possivelmente, stemness tumor acontecer nas fases muito iniciais da sequência adenoma-carcinoma e levar a diferentes níveis de sinalização Wnt entre diferentes células tumorais linhagens que compartilham o mesmo (

APC

) mutações [7]. Ele também indica que a perda de

APC

função (ou a activação oncogénica β-catenina) é presumivelmente necessário para o aparecimento da lesão inicial displásico, mas insuficiente para activar completamente a transdução de sinal de Wnt e promover a transformação maligna na ausência de adicional ambiental e (epi) fatores genéticos.

Anteriormente, empregando

in vivo

mutagênese [8], [9] e direccionamento de genes em ratos [10], [11], foi mostraram que a perda de

Apc

função resulta na formação de adenoma no tracto GI superior. No entanto, estes adenomas rato não conseguem progredir para malignidade e não se acumulam de forma espontânea sucessos genéticos adicionais no endógena

Kras Comprar e

TP53

genes [12]. Notavelmente, enquanto oncogênico

KRAS

ativação por si só é incapaz de iniciar tumorigênese intestinal se não com muito tardia e apenas mediante visitas somáticas no

Tp53

gene [13], composto

Apc

1638N /+ /

KRAS

camundongos V12G são caracterizados por um aumento de 10 vezes na multiplicidade tumoral e pela progressão do tumor acelerada quando comparada com

Apc

1638N /+ da mesma ninhada, com a grande maioria da lesão tumor a ser representado por adenocarcinomas [14]. Outras análises revelaram que

Apc

e

KRAS

mutações são sinérgicos na promoção da translocação nuclear β-catenina, aumentando assim a transdução de sinal de Wnt canónica [14]. Esta última é susceptível de resultar da capacidade de KRAS activado, através de cinases a jusante e ainda desconhecidos, para induzir a fosforilação da tirosina β-catenina conduzindo assim a um aumento substancial da sua associação citoplasmática e da sua subsequente translocação para o núcleo, onde actua como um transcricional activador de vários genes alvo a jusante de Wnt. Assim, tumores intestinais de

Apc

1638N /+ /

KRAS

camundongos V12G mostram um aumento significativo em células com acumulação nuclear de β-catenina, quando comparado com

Apc

1638N /+ animais [14].

Nos últimos anos, CSCs foram purificados com sucesso de cancros do cólon humano, empregando diferentes marcadores de superfície celular como CD133 [15], [16] , EpCAM, CD44 e CD166 [17], e EphB2 [18]. No entanto, apesar de os antigénios da superfície celular acima têm sido fundamentais para a identificação de subpopulações das células do tumor com propriedades de iniciação do tumor enriquecida quando transplantadas em ratinhos receptores imuno-incompetentes, a nossa compreensão dos mecanismos subjacentes stemness intestinal do cancro e para o papel desempenhado pelo CSCs em progressão para malignidade continua ainda muito incompleta. Anteriormente, Vermeulen et ai. mostrou que a alta atividade de Wnt destina CSCs dentro de esferas de suspensão derivadas de tumores de cólon [19]. A partir desta perspectiva, uma série de questões adicionais precisam ser abordadas: é a acumulação nuclear β-catenina um marcador funcional para CSCs intestinais

in vivo

? células tumorais com propriedades estaminais-como já estão presentes em lesões precoces, benignas, tais como adenomas? Aqui, nós aproveitou a

Apc

1638N /+ e

Apc

1638N /+ /

KRAS

modelos de rato V12G para intestinal tumorigênese para identificar prospectivamente subpopulações de células-tronco tumorais-like e caracterizá-los quanto à sua multipotency, auto-renovação, perfil de expressão de todo o genoma, e a atividade de sinalização /β-catenina Wnt.

resultados

células de iniciação tumorais estão presentes em

Apc

1638N /+ /KRAS

V12G

mas são muito raros em

Apc

1638N /+

intestinal Tumores

o

Apc

modelo 1638N /+ rato desenvolve uma média de 4-5 tumores benignos superiores GI (adenomas) no 6J C57BL /genética [10], [11]. Estas lesões raramente (e de início tardio) desenvolvem em adenocarcinomas como também mostrados pela falta de mutações somáticas espontâneas que ocorrem no

Kras

e

TP53

genes [12]. Para avaliar a presença de células iniciadoras de tumores no

Apc

1638N adenomas /+, ou seja, células capazes de recapitular a lesão primária, quando transplantadas para um animal receptor, tumores intestinais foram coletadas de

Apc

1638N /+ animais e dissociados enzimaticamente tanto mecanicamente como em suspensões de células individuais e esgotado a partir do endotélio e células hematopoiéticas (Lin

+) por células activadas por fluorescência (FACS). Em seguida, diferentes multiplicidades do Lin resultante

– população de células tumorais em massa foram transplantadas subcutaneamente em animais NOD-SCID. Como mostrado na Tabela 1, não se observou qualquer crescimento do tumor, mesmo após a injecção de tantos quanto 0,5-1,0 * 10

6 Lin

-. Células e 6 meses após o transplante

Em seguida, repetiu-se o ensaio de transplante com maior Lin

– células tumorais de

Apc

1638N +

KRAS

V12G tumores //intestinais. Como relatado anteriormente, a maioria dos tumores intestinais encontradas nestes animais compostos na mesma C57B6 consanguínea /fundo genético J são adenocarcinomas localmente invasivos [14]. Em nítido contraste com o Lin

– células de

Apc

1638N /+ adenomas, o crescimento do tumor foi observada em 23 das 33 injeções com 10

5

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G Lin

– células e, embora em menor incidência (3 de 48 transplantes), mesmo com um preço tão baixo como 1.500 células (Tabela 1). Ao limitar a análise de diluição (L-Calc ™) a frequência de células iniciadoras de tumores na Lin

– população de

Apc

1638N /+ /

KRAS

tumores intestinais V12G foi estimada como sendo 1 em 72838 (IC de 95% de 109467-48465). Quanto ao

Apc

1638N /+ adenomas, células iniciadoras de tumores são susceptíveis de estar presentes, em sua totalidade, pelo consideravelmente frequências mais baixas ( 10

-6). Assim, a presença de células de iniciação do tumor, conforme definido por meio de ensaios de transplante, parece estar limitado aos tumores de

Apc

1638N /+

KRAS

V12G ratinhos /quando comparados com os do

Apc

modelo 1638N /+ mouse.

o Lin-CD24

hiCD29

+ subpopulação de

Apc

1638N /+ /KRAS

V12G

intestinal tumores Encompass tumor de iniciação e auto-renovação CSCs

a fim de enriquecer de forma prospectiva e isolar células iniciadoras de tumores da massa, eventualmente, Lin

– população de

Apc

1638N /+ /

KRAS

tumores V12G, primeiro testado um painel de previamente estabelecido (câncer) estaminais marcadores celulares, incluindo CD24, CD29 (integrina β1), CD44, CD97, e L1CAM por FACSorting e subsequente transplante em murganhos NOD-SCID. Em contraste com CD44, L1CAM e CD97 (Tabela S1), o transplante de Lin

-CD24

+ CD29

+ células revelaram um ligeiro enriquecimento, mas significativa em células iniciadoras de tumores (frequência estimada de 1 em 56463 , com IC de 399211-7986) (Tabela 2). Dado que o Lin

-CD24

+ CD29

+ população representa uma proporção relativamente grande das células granel (~ 80%; dados não mostrados), que, em seguida, também definidas três portas FACS adicionais com base na relação expressão do antigénio da superfície celular CD24 (CD24

oi, CD24

med, e CD24

baixo) (Figura 1a). Fora de 30 primário

Apc

1638N /+ /

KRAS

tumores V12G analisadas por FACS, o tamanho médio (expresso em percentagem do volume Lin

– Fração ) de cada CD24 /CD29 subpopulação classificadas foi determinada: CD24

-CD29

-, 3,4% (SD 2.6); CD24

-CD29

+, 7,8% (SD 4.7); CD24

+ CD29

-, 4,4% (SD 3.4); CD24

loCD29

+ (P1), 7,9% (SD 2.5); CD24

medCD29

+ (P2), 52,9% (DP 7,4); CD24

hiCD29

+ (P3), 10,0% (SD 4.7). Por favor note que estas percentagens não somam 100% simplesmente por causa da exclusão deliberada de células localizadas nas separações entre portões de classificação (ver Figura 1a).

a. Grande painel: representante gráfico de pontos do padrão de marcação obtido através de coloração com anticorpos anti-CD24 da APC-conjugadas e anti-CD29 conjugado com PE. células positivas de linhagem (Lin

+) foram excluídos (fechado out) por coloração com anticorpos biotinilados contra marcadores de linhagem e Estreptavidina-PerCPCy5.5. P1 (Lin

-CD24

lowCD29

+), P2 (Lin

-CD24

medCD29

+) e P3 (Lin

-CD24

hiCD29

+) populações sup são indicados na trama. Pequenos painéis: gráficos de pontos representativos de células marcadas com anticorpos controlo isotípico (à esquerda), controlo de compensação coradas apenas com anticorpos anti-CD24-APC (centro), controlo de compensação coradas apenas com anticorpos anti-CD29-PE (à direita). b. A análise FACS do padrão de CD24 /CD29 de tumores obtidos por transplante de série do P3 células suspensões de

Apc

1638N +

KRAS

V12G tumores //intestinais. Esquerda: O transplante primário. Direita: transplante secundário. c. A análise imuno-histoquímica de tumores obtidos por 3 rounds de transplante de série do P3 células suspensões de

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumores intestinais.

a frequência de células tumorais de iniciação dentro do P1, P2 e P3 subpopulações foi determinada através do transplante de 1500 células de cada em ratinhos NOD-SCID. Notavelmente, enquanto que neste multiplicidade CD24

medCD29

+ e CD24

loCD29

+ células consistentemente falhou em formar tumores (apenas 1 de crescimento de 56 transplantes), o Lin

-CD24

hiCD29

+ subpopulação foi encontrado para abranger um enriquecimento substancial em células tumorigénicas (13/28; Tabela 2). Assim, embora neste caso não foi possível realizar a análise de diluição limitante pela L-Calc ™ (desde uma multiplicidade fixo de células foi empregado) a Lin

-CD24

hiCD29

+ subpopulação tumor parece ser caracterizada por um relativo enriquecimento significativo de aprox. 20-25 vezes quando comparado com o total de Lin

– células granel (1 CSC fora do ~3000 células tumorais versus 1 em 72838)

A definição de células-tronco cancerosas não podem ser baseadas em sua capacidade exclusivamente. para formar tumores quando transplantadas em baixa multiplicidade em camundongos imuno-incompetentes. características igualmente importantes de CSCs são a sua capacidade única de se auto-renovar e diferenciar a combustível e recapitular a composição heterogênea do tumor primário que são derivados de. A fim de determinar se as células de tumor de iniciação englobados pela Lin

-CD24

hiCD29

+ população também são capazes de auto-renovação e diferenciação, que realizaram transplantes experiências de série. Em primeiro lugar, 1500 Lin

-CD24

hiCD29

+ células foram isoladas de

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumores intestinais primárias e transplantadas em ratinhos receptores NOD-SCID. Conforme antecipado dos nossos resultados anteriores, este ensaio inicial deu origem a tumores subcutâneos dentro de 8 a 10 semanas. Os tumores resultantes foram então excisados ​​dos animais NOD-SCID receptores e empregue para ambos FACS e por análise histológica. Como para FACS, os tumores foram dissociados em suspensões de células isoladas e analisadas, classificados e transplantadas de acordo com os seus níveis de expressão de CD24 e CD29. Os tumores secundários provenientes de Lin

-CD24

hiCD29

+ células recapitulou totalmente o perfil de expressão de CD24 /CD29 FACS das lesões primárias (Figura 1B e Figura S2). Da mesma forma, após o transplante de 1500 células de cada uma das Lin

-CD24CD29 populações obtidos a partir dos tumores secundários, apenas o Lin

-CD24

hiCD29

+ células eram capazes de formar tumores terciárias. Por conseguinte, o perfil de FACS dos tumores terciárias que recapitula das lesões primárias (Figura 1b). Notavelmente, imuno-histoquímica (IHQ) e coloração enzimática revelou um aumento progressivo na presença relativa de linhagens de diferenciação intestinal, nomeadamente (ácido periódico de Schiff; PAS) células caliciformes, Paneth (lisozima), e entero-endócrino (sinaptofisina) nos tumores intestinais transplantados quando comparado com o primário

Apc

1638N /+ /

lesões KRAS

V12G (Figura 1c). No entanto, a análise de FACS de tumores transplantados em série mostrou que o tamanho relativo das subpopulações individuais CD24 /CD29 não mudou significativamente (Figura S3).

Assim, o Lin

-CD24

hiCD29

+ subpopulação de células tumorais de

Apc

1638N /+ /

KRAS

adenocarcinomas V12G abranger

bona fide

CSCs com de iniciação do tumor, auto -renewing e capacidades de diferenciação.

Lin-CD24

hiCD29

+ células de

Apc

1638N + /KRAS

V12G

β intracelulares /intestinal tumores mostram aumento -catenina acumulação

Nós já propôs que a minoria de células cancerígenas do cólon que caracterizam nuclear acúmulo de β-catenina e não aleatoriamente distribuídos ao longo da frente invasiva, representam CSCs [7]. Notavelmente, ambos

Apc

1638N /+ adenomas e

Apc

1638N /+ /

KRAS

carcinomas V12G compartilham o mesmo “β- catenin paradoxo “observada em cancros do cólon humanos em que, após a análise IHC, apenas uma minoria de células tumorais mostram um acúmulo β-catenina nuclear não obstante a maioria, se não todos, compartilhar os dois sucessos no

Apc

locus de [12], [14] (Figura 2a). Para avaliar se os CSCs enriquecidas no Lin

-CD24

hiCD29

+ subpopulação de tumores caracterizam-se por um aumento do nível intracelular de β-catenina, analisou-se a expressão da proteína nas diferentes subpopulações de células de tumor independente FACSorted por dois Os ensaios, a saber, imuno-coloração e análise de western blot. Imuno-coloração revelou que a maioria das Lin

-CD24

hiCD29

+ células tumorais intestinais são caracterizadas pela acumulação intracelular de β-catenina, quando comparado com outras populações separadas e a maior parte (Lin

-) células de tumor (Figura 2b). Este resultado foi também confirmado em uma forma mais quantitativa, por análise de Western realizadas com anticorpos específicos para a fracção de sinalização-competente (isto é desfosforilado em resíduos Ser37 e Thr41) da proteína β-catenina (Figura 2c e na Figura S4).

Imuno-histoquímica (a., b.) e western blot (c.) análise de β-catenina em em> Apc

/+ adenomas intestinais (a.) e em populações com tumores primários

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumores intestinais (b. e c.). As barras em c. representa a quantificação das bandas obtidos com um β-catenina activa anti-Ab (anti-ABC; clone 8E7, # 05-665, Millipore) por digitalização e análise de transferência de Western com o scanner e Odyssey após normalização com β-actina.

em geral, estes dados confirmam que o Lin

-CD24

hiCD29

+ subpopulação de

Apc

1638N /+ /

KRAS

tumores V12G, aqui mostrados para ser enriquecido em CSCs, engloba um nível significativamente mais elevado de intracelular e β-catenina sinalização competente quando comparado a granel Lin

– e outras subpopulações de células tumorais. O aumento da atividade de sinalização Wnt em CSCs foi posteriormente confirmada por perfil de expressão e análise Taqman qPCR de genes alvo a jusante Wnt (por exemplo,

Lgr5

,

Axin2

,

T

, e

LEF1

;. ver aqui abaixo)

A assinatura de expressão de CSCs de

Apc

1638N /+ /KRA

SV12G

intestinal Tumores é distinta da de As células tumorais diferenciadas e granel e engloba tanto stem e Paneth marcadores de células

Para identificar diferenças moleculares entre as células tumorais estaminais semelhantes e mais diferenciadas (a granel) de

Apc

1638N /+ e

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumores intestinais, nós isolado RNA total de 10

4 Lin

-CD24

hiCD29

+ (P3), Lin

-CD24

medCD29

+ /Lin

-CD24

loCD29

+ (P1 + P2, porta mesclado) e Lin

– ( células a granel) de tumores de 5 ratos individual de cada genótipo (

Apc

1638N /+ e

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G). Total de amostras de RNA foram então utilizado para hibridizar microarrays de oligonucleotídeos (Affymetrix mouse Genoma 430A 2.0 Array) de acordo com protocolos convencionais.

Em primeiro lugar, as diferentes populações de células tumorais isoladas de ratos com diferentes genótipos (

Apc

1638N /+ e

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G) foram comparados por ANOVA (3 maneiras) com um FDR (taxa de detecção falsa) conjunto a 0,05 para seleccionar para genes com expressão diferencial ≥2 vezes. Notavelmente, o P3 (CSCs de ambos os genótipos) vs. Lin

– (a granel; ambos os genótipos) e P3 vs. comparações P1 + P2 resultou em diferenças significativas e na definição de duas listas de conjuntos de sondas diferencialmente expressos (n = 1062 [851 não redundantes, genes anotados] e 746 [602 não redundantes, genes anotados], respectivamente; Tabelas S3 e S4). Desta forma, identificamos uma lista de 587 conjuntos de sondas diferencialmente expressos a partir da interseção da Lin- vs. P3 e P1 + P2 vs. P3. Os conjuntos de sondas identificados correspondem a 482 genes (não redundante) (Tabela S5).

Os perfis de expressão obtidos a partir das subpopulações CSC-enriquecido (Lin

-CD24

hiCD29

+) de ambos os genótipos (

Apc

1638N /+ e

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G) diferem dos de mais diferenciada (Lin

-CD24

medCD29 + /CD24

loCD29

+

) e do Lin

– subpopulações granel, claramente visível no agrupamento hierárquico (HCA) e de componentes principais ( PCA) análise (Figura 3).

(a.) de agrupamento hierárquico e (b.) análise de Componentes Principais (PCA) (ambos implementados em Partek) de Lin

-CD24

hiCD29

+ (P3), Lin

-CD24

medCD29

+ /Lin

-CD24

loCD29

+ (P1 + P2, porta mesclado) e Lin

– ( células a granel) de tumores de 5 ratos individual de cada genótipo (

Apc

1638N /+ e

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G). Para melhor visualização cores individuais foram utilizados para cada grupo e em b. elipsóides foram desenhados em torno das três populações tumorais

Notavelmente, a

Apc.

– e

Apc

/

KRAS

genótipos -mutant não são resolvidas por HCA e PCA, possivelmente devido ao número relativamente limitado de

Apc

1638N /+ e

Apc

1638N /+ /

KRAS

amostras de tumores V12G (n = 5 para cada grupo) utilizados para a expressão comparativa profiling análise, insuficiente para destacar as diferenças alegadamente mais sutis entre CSCs benignos e malignos.

em seguida, a partir das listas acima de diferencialmente expressos sondas entre P3 e outras populações de células de tumor que validou a expressão de um total de 35 genes por quantitativa PCR em tempo real (Tabela S2). A selecção de genes validados inclui, para além da parte superior para cima e para baixo, os genes regulados também membros adicionais da via de transdução de sinal de Wnt canónica, e genes conhecidos por desempenhar papéis importantes no cancro. Em geral, a grande maioria dos genes seleccionados (33/35) foram validados para a sua expressão diferencial por qPCR (figura S1).

análise do gene ontologia [20] da assinatura intersecção revelou um bastante amplo espectro de celular funções, as estruturas e processos entre os genes sobre-regulada, incluindo matriz extracelular, adesão celular, o desenvolvimento de órgãos e morfogénese (Tabela S6). Em particular, a análise dos genes diferencialmente expressos na CD24

hiCD29

+ células de

Apc

1638N /+ e

Apc

1638N /+ /

KRAS

tumores V12G em comparação com o volume e as células tumorais mais diferenciados, revelou vários processos biológicos que possam desempenhar papéis funcionais no stemness câncer. Primeiro, como também mostrado pela acumulação intracelular de β-catenina ativo, vários alvos e os membros do Wnt cascata de sinalização são diferencialmente expressos na assinatura P3 incluindo

Lgr5

,

MMP2 Comprar e

MMP7

,

Dkk2

,

Pla2g2a

,

Prox1

,

Sox17

,

T

(brachyury),

Wif1

, e

Fzd5

. A presença de

Lgr5

entre os genes regulados positivamente é de interesse uma vez que indica que este marcador bem conhecido de células estaminais normais de ciclismo no intestino do rato [21] também pode representar um marcador útil no CSC tumores intestinais de ratinho, recentemente demonstrado pela linhagem traçado [22]. Além disso, o factor de transcrição

Prox1

, um alvo directo e dependente da dose, da via de sinalização Wnt /β-catenina, foi regulado positivamente na população P3.

Prox1

foi mostrado previamente para promover a displasia em adenomas do cólon e progressão do cancro colorectal [23]. No entanto, nós não conseguimos encontrar diferenças significativas entre

Prox1

níveis de expressão entre

Apc

1638N /+ e

Apc

1638N /+ /

células KRAS

tumorais V12G tanto nos dados de microarranjos originais e sobre a validação qPCR (figura S1). Esta observação reflecte uma falta mais geral de diferenças significativas entre as populações P3 de

Apc

1638N /+ e

Apc

1638N /+ /

KRAS

tumores V12G, como ficou também demonstrado por agrupamento hierárquico e análise PCA (Figura 3a e b, respectivamente). Em nosso estudo anterior [14], perfis de tumores em massa de

Apc

1638N /+ e

Apc

1638N /+ /

KRAS

camundongos V12G também não resolveu os dois genótipos. Na verdade, apenas o número relativo de células tumorais com β-catenina nuclear podia distinguir significativamente entre

Apc

1638N /+ de

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumores intestinais [14].

Além de Wnt, vias de sinalização adicionais são representados pelos genes diferencialmente regulados como mostrado pela expressão diferencial de

BMP7

e

Bmper

(BMP sinalização),

Fgfbp1

,

Fgfrl1

, e

ETV5

(receptores do fator de crescimento de fibroblastos, proteínas e factores de transcrição de ligação), e

IGF1

,

IGFBP1

,

Igfbp5

, e

IGFBP7

(fatores de crescimento semelhantes à insulina e proteínas de ligação).

No geral, estes resultados mostram que CSCs de

Apc viajantes – e

Apc

/

KRAS

tumores -mutant têm perfis de expressão distinta de outras populações de células tumorais e são caracterizados por aumento da atividade de sinalização Wnt , de acordo com seus níveis melhorados de intracelular β-catenina, juntamente com outros pathays sinalização (BMP, IGF), e por a expressão de genes específicos de células de Paneth.

Discussão

as mutações no

APC

gene supressor de tumor representa o iniciador principal e evento limitante da velocidade na sequência adenoma-carcinoma levando ao câncer de cólon no homem [1]. Perda de

APC

função leva à ativação constitutiva da via de sinalização Wnt /β-catenina canónica conhecida por desempenhar um papel crucial na regulação da auto-renovação e diferenciação em um amplo espectro de nichos de células-tronco de tecidos específicos incluindo a cripta intestinal e, consequentemente, no aparecimento de muitos tipos de cancro [24]. A activação constitutiva de sinalização Wnt no epitélio intestinal provoca a formação de adenoma e representa um passo necessário, embora não suficiente, para a transformação maligna. mutações somáticas no

KRAS

,

BRAF

,

TP53

, e

SMAD4

geralmente estão na base da progressão do tumor benigno para adenocarcinoma localmente invasivo e metástases em locais distantes de órgãos [1]. Mutações no rato endógena

Apc

gene também levar à formação de pólipo intestinal, embora localizados principalmente no trato gastrointestinal superior. Notavelmente, rato

Apc

-driven adenomas intestinais não se acumulam de forma espontânea

Kras

ou

TP53

mutações somáticas e, consequentemente, muito raramente evoluem para adenocarcinomas [12].

em nosso laboratório, nós ter gerado o

Apc

1638N /+ rato modelo de codificação para um hipomórfico

Apc

mutação resultando em alguns (5-6) adenomas GI superiores , maior sobrevida e um aumento da possibilidade de transformação maligna espontânea embora apenas em animais com idade superior a um ano [10], [11], [12]. Em contraste, composto heterozigotos

Apc

1638N /+ /

KRAS

camundongos V12G são caracterizadas pelo aumento da multiplicidade tumoral (~ 10 vezes) e acelerada progressão maligna com a maioria dos lesões sendo localmente adenocarcinomas invasivos [14]. Notavelmente, a activação oncogénica de

KRAS

/

Kras

por si só é insuficiente para iniciar tumorigênese intestinal [25], se não de início tardio e sobre inativação somática do

Tp53

gene [13]. Assim, as diferenças fenotípicas dramáticas provocada pela activação oncogénica dos

gene KRAS

no composto

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G resultados ratos a partir da sua acção sinérgica na promoção da sinalização de Wnt canónica, tal como mostrado pelo aumento na actividade repórter TOP-flash e no número de células tumorais afectadas pela acumulação β-catenina nuclear [14].

o aumento observado em relação o número de

Apc

1638N /+ /

KRAS

células tumorais V12G destinados pela β-catenina nuclear é de importância, tendo em conta o chamado “β-catenina paradoxo “[7]: não obstante o facto de que a perda de

APC

função é comum a todas as células de tumor e está previsto para resultar no intracelular e acumulação nuclear de β-catenina, isto apenas é observado numa minoria de células de cancro submetidos a uma transição epitelial-a-mesenquimal (EMT) e não-distribuídos aleatoriamente na frente invasiva da massa tumoral [4], [5] (ver também a Fig. 2a). Esta observação levou à hipótese segundo a qual as células nucleares earmarks β-catenina-tronco como intestinais tumorais com maior atividade de sinalização Wnt capazes de separar a partir da massa primária e eficiente divulgação e casas em distal, órgãos vitais [6], [19], [26].

Aqui, nós tentou a purificação potencial das células-tronco cancerosas (CSCs) a partir de

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumores intestinais. Notavelmente, a presença de células de iniciação do tumor, não pôde ser demonstrada em tumores in

Apc

1638N /+. De acordo com a definição CSC operacional, ou seja, a sua capacidade de formar tumores em cima limitando transplante de diluição em ratinhos receptores,

bona

CSCs são ausentes ou extremamente raros fide ( 10

-6) nas lesões intestinais b.