Abstract

A desregulação da expressão de miRNA pode contribuir para tumorigênese e outros fisiopatologia associada a Câncer. Usando TLDA, expressão de 762 miRNAs foi verificada em 18 pares de tecidos de controle de câncer adjacente bucais gengivo. Expressão de miARNs significativamente desregulados foi ainda validado no cancro e analisada em dois tipos de tecidos pr�cancro (leucoplasia e líquen plano) por ensaios TaqMan específicos de primers. implicações biológicas destes miRNAs foram avaliados bioinformatically. Expressão de

hsa-miR-1293, hsa-miR-31, hsa-miR-31 * Comprar e

hsa-miR-7

foram significativamente regulada para cima e os de

HSA -miR-206, hsa-miR-204 Comprar e

hsa-miR-133a

foram significativamente regulada para baixo em todas as amostras cancerosas. Expressão de apenas

hsa-miR

-31 foi significativamente sobre-regulada em leucoplasias mas nenhum em amostras de líquen plano. Análise de heterogeneidade de expressão dividido 18 amostras de cancro em grupos de 13 e 5 e amostras revelou que a expressão de 30 miARNs (incluindo os acima mencionados 7 miARNs), foi significativamente desregulado no conjunto de 13 amostras. A partir de mineração de dados e análise de caminho foi observado que estes miRNAs pode direcionar significativamente muitos dos genes presentes em diferentes vias relacionadas ao câncer, como “proteoglicanos no câncer”,

PI3K-AKT

etc, que desempenham um papel importante na expressão de diferentes características moleculares do câncer. Expressão de

hsa-miR-31

foi significativamente regulada para cima em ambos os tecidos cancerosos e leucoplasia e, por isso, pode ser um dos marcadores moleculares da leucoplasia que pode progredir para gengivo-vestibular câncer.

Citação: De Sarkar N, Roy R, Mitra JK, Ghose S, Chakraborty A, Paul RR, et al. (2014) A Quest for miRNA Bio-Marcador: Uma Abordagem Back Track partir gengivo Câncer Bucal para dois tipos diferentes de pré-cânceres. PLoS ONE 9 (8): e104839. doi: 10.1371 /journal.pone.0104839

editor: Ratna B. Ray, Saint Louis University, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de abril de 2014; Aceito: 15 de julho de 2014; Publicação: 15 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 De Sarkar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Todo o financiamento veio do Departamento de Biotechnolgy, Governo da Índia, e de Indian Statistical Institute ao Prof. Bidyut Roy. O financiador não tem nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados, análise, decisão de publicar e preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma gengivo bucal de células escamosas (GBSCC) é um dos (-60%) cânceres mais prevalentes na cavidade oral, especialmente entre os usuários de tabaco na Índia. conjunto inteiro de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas se destaca como o quinto tumor maligno mais comum em todo o mundo [1]. Mas câncer de cabeça e pescoço compreende ~24% do total de cânceres na Índia como registrado em um hospital terciário, Tata Memorial Centre, Mumbai e cerca de ~13.5% deles são da cavidade oral [2]. Cinco anos taxa de sobrevivência (~ 50%) dos pacientes que sofrem de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas não melhorou muito, mesmo após intensa investigação nos últimos 15 anos, por isso, a detecção precoce ainda é uma questão-chave para uma melhor sobrevivência [3].

Desde 1993, miARN surgiu para ser um dos reguladores biológicas mais importantes, os quais desempenham um papel importante no controlo e ajuste fino expressão do seu alvo (ARNm) [4] – [9]. Nos últimos anos, tem sido demonstrado que microARNs (miARNs) também estão envolvidos na tumorigénese humana e pode actuar tanto como moléculas tumorigénicas /oncogénicos ou anti-tumorigénica. Assim, é tomada uma nova camada nos eventos moleculares em cancro humano. estudos de expressão gênica revelou que muitos miRNAs estão desregulados em diferentes tipos de câncer e estudos funcionais esclareceu que miRNAs estão envolvidos em vários processos moleculares e biológicos que impulsionam tumorigênese [10] – [12]. Assim, em adição a diferentes escalas de variabilidade em termos de novas mutações no genoma ou fundo genético dos pacientes (isto é, linha de germe de mutação), a variabilidade na expressão de diferentes miARNs é também um aspecto importante para a investigação. Com esta crença, estudamos a desregulamentação de 762 miRNAs em GBSCC expressão e também verificado se mesmo tipo de desregulamentação expressão pode ser observado na leucoplasia e líquen plano tecidos pré-cancerosos de cavidade oral. Esforços têm sido feitos para entender como esses miRNAs podem estar envolvidos no câncer usando análise de caminho e informações do lit

E

Ratures e bancos de dados.

Materiais e Métodos

Amostras

Este estudo foi aprovado pelo “comitê de revisão para proteção do risco de pesquisa para os seres humanos, Instituto de estatística indiano”. Todos os indivíduos deste estudo forneceram escrita consentimentos informados para publicar detalhes do caso. Todos os participantes assinaram um questionário contendo demografia, hábito do tabaco e uma declaração descrevendo que ele /ela não tem qualquer objecção a utilização de amostras de sangue e tecidos neste estudo e está a participar neste estudo de forma voluntária. pacientes não relacionados que sofrem de cancro (n = 18), líquen plano (n = 12) e leucoplasia (n = 18) foram consideradas para este estudo de Guru Nanak Instituto de Ciência Dental e Pesquisa, Panihati, Kolkata, (Tabela 1, Tabela 2 , Tabela 3). Um soco de tecido do local do cancro /pré-câncer e outro soco de lado “clinicamente” local normal (pelo menos 1,5 polegada de distância da borda da lesão) foram biopsiados pelo patologista oral. Uma porção de tecidos de biópsia foi utilizada para confirmação histopatológica e permanecendo parte de tecidos foram mantidos separadamente, “RNA mais tarde” a -80 ° C e usadas dentro de 2 meses.

RNA isolamento e TLDA ensaio

isolamento do RNA foi realizada utilizando o kit de Mirvana (Life Technologies, EUA). rendimento de RNA quantificação foi feita por Nano Gota e integridade foi verificado com Bioanalyzer (Agilent RNA6000 Kit Nano) do Agilient, respectivamente. número RIN de corte foi escolhido como ≥6.9. ensaio de expressão paralela de 762 miRNAs foi realizada utilizando TLDA-A (V2) e TLDA-B card (V3) no sistema de PCR em Tempo Real RÁPIDO 7900HT (Applied Biosystems, EUA), utilizando bloco plano TLDA [13]. análise primária foi realizada utilizando SDS e dados Assist (Life Technologies, EUA) pacotes de software para obter expressão em termos de valores Ct, ΔCt e ΔΔCt onde Ct = Ciclos em que a quantidade de produto PCR atinge um limite definido, ΔCt = Ct

de um miRNA no tecido canceroso – Ct

da média geométrica de expressão de 3 miRNAs controle endógenos mais estáveis ​​que o tecido e ΔΔCt = ΔCt

de um miRNA no tecido canceroso – ΔCt

desse miRNA em tecidos de controle . Fora das ensaiadas 762 miRNAs, cinco eram candidatos para controles endógenos. No entanto, com base em sua estabilidade expressão em todas as amostras, RNU-48, RNU-44 e foram seleccionados U6 /MMU-6 como controles endógenos. Para obter ΔCt como a medida normalizada de expressão de um miARN em ambos os tecidos de cancro /pré-cancerosas e de controlo, a expressão de todos os miARNs em tecidos foi normalizada utilizando independentemente média geométrica de expressão de controlo 3 miARNs endógenos seleccionados no mesmo tecido. valor Ct menos de 40 só foram consideradas para análise posterior.

Análise

Data de poda.

Se a expressão de qualquer miRNA particular foi observado para estar presente em pelo menos-9 de 18 tecidos emparelhados cancerosas do normal, então, apenas, que tem sido considerado para análise posterior a jusante. Anotação de TLDA V2 ensaio (A-card) e V3 (B-card) segue-libertação 14 miRBase [13] – [14]. Agora, os dados desses miRNAs expressão foram consideradas para análise posterior cuja anotação ainda é válido em miRBase libertar-19 [15] – [16]. Desta forma, a expressão de 531 miRNAs foi considerado para análise a jusante subsequente.

Análise Estatística.

Inicialmente, uma amostra de Kolmogorov-Smirnov (KS) de teste para os dados de todos os 531 genes de expressão foi realizada de forma independente, de modo a verificar a normalidade dos valores de expressão diferenciais em todas as amostras de [(Zi = {(Ci-Ni) – (média média C- N)}, portanto, Zp = ΣZi /SD Z, KS teste foi feito em Zp; Ci: i

th valor ΔCt da amostra Câncer, Ni: i

th valor ΔCt da amostra normal] e, eventualmente, a expressão foi encontrado para ser distribuído normalmente é de notar que os valores ΔCt já estão log transformado, então. ., não mais log transformação foi feito com este conjunto de dados de expressão Seguido pelo teste de normalidade, um teste t pareado cauda foi realizada [(Ci-Ni) 1 / 1]. hipótese nula de uma atado t pareado -test era “a expressão de um determinado miRNA não é maior do que 2 vezes para cima /baixo regulada” Então, naturalmente, hipótese alternativa era “a expressão de um determinado miRNA é . 2 vezes para cima /baixo regulado. Teste para a sobre-regulação (inferior de ensaio da cauda) foi realizado quando a mediana de ΔΔCt de um determinado miARN é menor que zero. Da mesma forma, o teste para a regulação negativa foi realizada quando a mediana de ΔΔCt de um determinado miARN é mais do que zero. Várias correções de teste utilizando o método Benjamini-Hochberg foi realizada ao nível de 5% de significância [17] e corrigidos cortada p-valor foi de 0,00065.

Análise de Agrupamento dos miRNAs expressos em tecidos de câncer.

método de agrupamento K-médio foi utilizado para toda a dados podadas definidos para ver se as variações de expressão do genoma ampla miRNA entre os indivíduos eram grandes o suficiente para dividir de forma confiável as amostras em um número de agrupamentos sub. Para este agrupamento, escolhido métrica de distância foi euclidiana. Desde então, a expressão de muitos miRNAs estava ausente em nosso conjunto de dados, foi a criação de situação “de dados ausente”. Esta situação é conhecida por influenciar o agrupamento se o agrupamento dologia K-means mais populares foi adotada. Assim, a escolha do agrupamento foi K-mediana. O número de clusters confiáveis, os dados possam constituir, foi determinada utilizando o método de “cotovelo”.

TaqMan de Ensaio.

A expressão de miRNAs significativamente desregulados, detectados em tecidos de câncer pelo método TLDA , também foram validados em tecidos mesmo câncer e examinadas em leucoplasia e líquen plano tecidos por ensaio TaqMan (sistema 7900HT rápido PCR em tempo real, a Applied Biosystems, EUA). Sondas e iniciadores foram fornecidos pela Invitrogen India Ltd e os dados foram recuperados como “mudança de dobra” em relação aos controles adjacentes. A normalização da expressão de cada gene em cada amostra foi feito usando média geométrica dos mesmos 3 controles endógenos, viz.

RNU-44, RNU-48 Comprar e

mmu-6

, para obter o valor ΔΔCt desse miRNA.

Resultados

perfil de expressão em tecidos de câncer por TLDA

Os dados de expressão de 762 miRNAs foram testados por este método, mas após a poda de dados, dados de 531 miRNAs (incluindo 5 controles endógenos) expressão foi utilizada para outras análises a jusante (S1 Arquivo). Durante o teste estatístico, as alterações de expressão de pelo menos duas vezes no tecido de cancro em comparação com o tecido de controlo emparelhado foi considerada a marca de banco de desregulação expressão. Assim, a expressão de 7 miRNAs foi encontrado para ser significativamente desregulamentado após a correcção de testes múltiplos e todos estes sete miRNAs tinha 4 vezes desregulamentação média de expressão (ou seja, quer para cima ou para baixo-regulação). Validação de expressão por ensaio TaqMan específicas miRNA também reconfirmou desregulamentação expressão em tecidos de câncer, embora dobrável mudanças foram diminuídos em comparação com TLDA desfecho (Tabela 4). A diferença de sensibilidade destes (TLDA e específicos de miR TaqMan ensaio) métodos experimentais baseados dois RT-PCR, juntamente com o fato de que esses dois conjuntos de experimentos foram realizados em dois momentos diferentes, podem ser os fatores que influenciam para diferença em graus da desregulamentação dos miRNAs expressão. localizações relativas destas 7 miRNAs, juntamente com outros genes de miRNA em diferentes cromossomos revelou que

hsa-miR-133a

e

HSA Restaurant –

mir-7

estão localizados em dois ( Chr 18 e 20 Chr) e três cromossomas (CHR 9, 15 e CHR CHR 19), respectivamente (Figura 1a). Aqui, os ensaios foram realizados por apenas miRNAs maduros, assim, a expressão de

hsa-miR-133a

e

HSA Restaurant –

mir-7

pode ser soma cumulativa de todos madura respectivas formas de miARN. Entre estes miARNs 7, a expressão de 4 miARNs viz.

hsa-miR-1293, hsa-miR-31, hsa-miR-31 * Comprar e

hsa-miR-7

foram significativamente regulada para cima e os de 3 miRNAs viz.

hsa-miR-206, hsa-miR-204 Comprar e

hsa-miR-133a

foram significativamente para baixo regulamentada em amostras de câncer (Tabela 4). mapa de calor foi construído de acordo com dois modos sem supervisão de agrupamento hierárquico. Assim, todos os miRNAs regulados negativamente agrupados na parte superior da trama Considerando que todos os up-regulada miRNAs agrupados na parte inferior (Figura 1b). Ele mostrou valores de expressão (i.e. ΔΔCt) comparado com o controlo adjacentes, bem como o número de amostras que fornecem dados de expressão. Expressão de

HSA-mir-1293

foi obtido a partir de 9 de câncer de controle de amostras pareadas, mas 6 deles tinham valores ΔΔCt ≤-2 e restantes 3 amostras apresentaram valores ΔΔCt entre 0 e -2. Assim, para

HSA-mir-1293

, todos estes 9 amostras tinham valores ΔΔCt com sinal -vos, ou seja; sempre que a expressão foi obtido, é sempre up-regulada, mas seis deles apresentaram alteração expressão mais de 4 vezes. Da mesma forma, os dados de expressão para

HSA-mir-31 *

foram obtidos a partir de controle de câncer de 16 amostras pareadas. Fora destas 16 amostras, uma amostra teve ΔΔCt entre 0 +2, Duas amostras apresentaram valores ΔΔCt entre 0 -2 E restantes 13 amostras apresentaram valores ΔΔCt ≤-2

A:. Manhattan lote de p-valores para todos os 528 miRNAs 18 amostras. A linha AB (linha horizontal isto é, no meio da Figura) representa P-valor de corte, p = 0,00065. localização relativa de 528 miARNs (ao longo do eixo horizontal) em todo o genoma humano e os seus correspondentes -log

10 p-valor transformadas (ao longo do eixo vertical) foi representada graficamente. B: Calor mapa diagrama de valores ΔΔCt. Duas vias de agrupamento hierárquico não supervisionado de 7 miRNAs cuja expressão era amostras significativamente desregulados. Cada linha representa a expressão de um miARN e cada coluna representa uma amostra. As células coloridas azul-céu ficar para o ensaio falhou ou seja, não existem dados nessas células. cores vermelhas e verdes significam para cima e para baixo-regulação, respectivamente. Dendograma ao longo do eixo vertical representa a classificação hierárquica de miARNs com base na similaridade expressões. métricas de distância de agrupamento hierárquico foi distância euclidiana. mapa de calor foi construído usando Heatmap 2 do pacote “gplot” de R. C:. Expressão altamente correlacionada de

miR-206 Comprar e

miR-1

expressão Normalizada (ΔCt) desses 7 miRNAs em câncer e os tecidos de controlo foram principalmente não sobreposta e valores ΔCt de diferentes miARNs através dos tecidos de controlo também mostrou uma gama bastante ampla de variação (Figura 2). Assim, para obter expressão relativa correcta, é importante para comparar a expressão de miARN no tecido de cancro com as de tecido de controlo a partir do mesmo indivíduo. Nesta figura, miARNs foram colocados de acordo com a aumentar os valores de p (de cima para baixo) verticalmente. Os valores ΔCt de 8 miARNs em diferentes amostras de tumores e controlo foram representados graficamente no eixo horizontal para mostrar a distribuição de valores ΔCt em todas as amostras. É evidente que mais a sobreposição entre os intervalos de expressão de miARN em tecidos de cancro e de controlo, menos é o nível de significância. Aqui,

HSA-mir1293

com menor valor de p 0,000028 tinha sido posicionada na parte superior e

HSA-mir-1

com valor de p 0,00094 (logo abaixo do nível corrigido de significância) foi colocado na parte inferior do eixo vertical (Figura 2).

trama caixa horizontal é mostrada a distribuição da expressão (ΔCt) de miARNs ao longo do eixo horizontal. Os valores de p de miARNs são traçados em ordem ascendente (de cima para baixo). Expressão de

tem-miR-1 | não é significativamente desregulamentado e mostrado para comparar com os de outros 7 miRNAs. Cada caixa e um par suiça (Gray para o cancro e branco para Normal) representa gama de variabilidade dos valores ΔCt para um miRNA a partir de dados TLDA. Esta gama representa a expressão de todos os dados amostras testadas com sucesso para esse miRNA.

A expressão de miRNAs em amostras de leucoplasia e líquen plano pré-cancerosas

Entre 7 miRNAs que foi observada a ser significativamente desregulamentado em amostras de câncer (Tabela 4), expressão de apenas

miR-31

foi significativamente sobre-regulada em tecidos leucoplasia onde, como expressão de nenhum desses 7 miRNAs foi desregulamentado significativamente em tecidos de líquen plano. Expressão de

miR-31 * Comprar e

miR-204

também foi para cima (4,75 dobras) e sub-regulada (1,99 dobras), respectivamente, em tecidos leucoplasia mas não significativamente diferente.

mineração de banco de dados e bioinformática analisa

Os relatórios publicados sobre estes 7 miRNAs também havia mostrado direção semelhante de desregulamentação expressão em alguns tipos de câncer, incluindo cabeça e pescoço [10], [18] – [20]. Um total de 561 alvos originais foram identificados quando estes 7 miARNs foram utilizadas para pesquisar alvos usando miRWalk [21] e ainda mais validadas de PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed). O

hsa-miR-31 *

validou alvo,

RhoA

, que é declaradamente implicados na neoplasia boca [18]. O

hsa-miR-1293 até agora é conhecido para direcionar

GCN1L1

(Tabela 5) e

hsa-miR-1293

mediada baixo regulação desse gene antigénio tumoral ( ou seja,

GCN1L1

) poderia contribuir para mau prognóstico do tumor [22]. ferramenta IPA foi utilizado para “termo de pesquisa da doença” (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) e mais significativo “termo doença” na categoria câncer do IPA foi “cabeça e pescoço” câncer. IPA não poderia fornecer qualquer atingido por

hsa-miR-1293

e considerou

hsa-miR-31

e

hsa-miR-31 *

como sinônimo para que a saída era a partir de 5 miARNs. Observou-se também que o IPA considerada

hsa-miR-206

sinónimo de

hsa-miR-1 | uma vez que têm sequência de sementes idênticas [23]. Observou-se também que o estado de expressão desregulação

HSA-miR-1 | e

HSA-miR-206

através das amostras eram muito semelhantes um ao outro (r = 0,94) (Figura 1C) . Inclusão de

hsa-miR-1 | na lista de pesquisa de destino aumentou o número de alvos para 702. Em KEGG portal mapeamento via [24] – têm sido utilizados [25] alvos validados destes 8 miRNAs. Top maioria dos percursos na lista mapeados eram “microRNAs em câncer” seguido de “proteoglicanos no câncer” e “via de câncer global” (Tabela S1 no arquivo S2). Outro top via relevante foi

PI3K-AKT

que é um dos caminhos mais comuns envolvidos no câncer. Outras mudanças mais significativas que poderiam ter acontecido devido a estes miRNAs são rompimento de manutenção citoesqueleto de actina e adesão focal. Outros prováveis ​​caminhos implicados sinalização foram

RAS

,

RAP1, MAPK, HIF-1 |,

FOXO, TNF, erbB

, apoptose etc (Tabela S1 em S2 Arquivo). “IR” busca enriquecimento prazo foi realizada por meio de entrada de 702 alvos validados destes oito miARNs (dados não mostrados) e observou-se que os processos biológicos perturbados mais proeminentes são principalmente relacionadas com a migração celular, a perda de apoptose, proliferação celular, etc. Mas DAVID base “GO” enriquecimento prazo para processo biológico mostrou processo biológico mais proeminente é “apoptose” (Tabela S2 S2 no Arquivo) [26] – [28]. Todas estas observações suportam que esses 8 miRNAs podem desempenhar papéis funcionais importantes no câncer bucal gengivo. Nossos dados RNA-Seq mostra que a expressão de

FN1, MSN

e

MMP9

, que pertence ao “proteoglicanos em câncer” lista gene e são alvos de miRNAs regulados para baixo, foi regulado para cima em 10 de 13 amostras de tecido (em média, 6,83, 2,43 e 21,89 dobras, respectivamente, em comparação com adjacente normal). Do mesmo modo previsto aumento da regulação do

LAMC Comprar e regulação para baixo dos

PAI

, que pertencem ao

PI3K-AKT

caminho, também foi validado em dados de RNA-Seq em uma sub definir uma destas amostras de tecidos (dados não publicados). Estas observações também apoiar a nossa análise de caminho preditivo em relação envolvidos biológicos processos /caminhos que podem ser abrangidas por este conjunto de 8 miRNAs.

Amostras selecionadas teve pouca variação em termos do seu estado de diferenciação ou estadiamento clínico. A análise de agrupamento foi realizada para verificar se genoma perfil miRNA ampla poderia explicar essa variação característica. Ele foi realizada utilizando os dados de expressão desregulamentação (ΔΔCt) de 531 miRNAs de 18 amostras de câncer utilizando o método K-médio. Idealmente, apenas dois grupos distintos foram obtidos; um consistiu em 13 amostras de tumores do normal emparelhado e outra consistia em 5 amostras de tumores do normal emparelhado. Era evidente que estes dois conjuntos de amostras não foram formadas na base do seu estado de diferenciação ou estágios clínicos. Expressão de 30 miARNs foi significativamente desregulado no conjunto de 13 amostras (p-valor de corte 0,00298 após Benjamini-Hochberg Correcção, Figura 3a, Figura 3b), mas nenhum dos miARNs foram significativamente desregulado no cluster de 5 amostras (dados não mostrados ). Fold expressão (para cima ou para baixo-regulado) de um miARN num tecido do tumor comparada com o seu controlo adjacentes e o número de amostras que fornecem os dados de um miARN expressão poderiam ser observados em mapa de calor diagramas de aglomerado de 13 amostras (Figura 3b). Ele mostrou que a expressão de todos os miRNAs não estava disponível de todas as amostras. A expressão de alguns miARNs foi regulada na maioria das amostras (por exemplo, expressão de

miR-31 *, miR-7, miR-21

mostrado na parte inferior da figura) e da expressão de algumas miARNs foi baixo -regulated na maioria das amostras (por exemplo,

miR-206, miR-1, miR-133a

mostrado no meio da figura) (Figura 3b)

a:. Manhattan lote de p-valores para 520 miRNAs a partir do conjunto de 13 amostras. A trama de localização relativa de 520 miRNAs (ao longo do eixo horizontal) em todo o cromossomo humano e seus correspondentes -log

10 p-valor transformada (ao longo do eixo vertical). Benjamini-Hochberg corrigida P-valor de corte foi de 0,00298 (linha horizontal no meio da figura). B: Calor mapa diagrama de valores ΔΔCt de 30 miRNAs. A expressão destes miARNs foi significativamente desregulado no conjunto de 13 amostras. Cada linha representa um miARN e cada coluna representa uma amostra. As células coloridas azul-céu ficar para o ensaio falhou (i.e.no dados nessas células). cores vermelhas e verdes significam para cima e para baixo-regulação da expressão, respectivamente. mapa de calor foi construído usando Heatmap 2 do pacote “gplot” de R. C:. Expressão altamente correlacionada de miR-411 * e miR-411

Destas 30 miRNAs (Tabela 6), expressão de 28 miRNAs mostraram padrão de expressão desregulamentação semelhante ao que já foi relatado em mais cedo estudos sobre o cancro [10], [29] – [30]. Dos restantes dois miRNAs, um miRNA

(HSA-miR-770-5p

) ainda não foi associado com qualquer tipo de câncer. Expressão de um miARN remanescente (

HSA-miR-211

) foi desregulada na direcção oposta neste estudo, em comparação com os relatórios anteriores sobre o cancro colorrectal [29] – [30]. Na verdade, 7 miARNs, cuja expressão foi significativamente desreguladas na análise de 18 amostras, são um subconjunto destes 30 miARNs. No entanto, foi observada expressão de

hsa-miR-411 *

a ser significativamente desregulamentado neste estudo, mas nenhum relatório anterior havia demonstrado seu envolvimento com câncer. Mais uma vez, sabe-se que

hsa-miR-411 Comprar e

miR-411 *

são originados do mesmo precursor miRNA e

hsa-miR-411

tem uma forte associação com o câncer [31]. Quando fez check-expressão de maturidade

hsa-miR-411 Comprar e

hsa-miR-411 *

, foi observada uma forte correlação positiva (r = 0,95) (Figura 3c), embora a expressão de

hsa-miR-411

não foi encontrado para ser estatisticamente significativa. Da mesma forma, temos observado a desregulação da expressão significativa

hsa-miR-135b * Comprar e

HSA

-miR-99a * e os relatos de associação de câncer com

hsa-miR-135b

e

HSA Restaurant –

miR-99a

[32]. Pesquisando em forma similar, 1207 genes alvo exclusivos foram obtidos para estes 30 miRNAs. IPA e mapeamento KEGG foram realizadas utilizando estes 30 miARNs e seus conhecidos de 1207 genes alvo. Na análise IPA, três tipos de câncer, que foram encontrados para ser associado com a desregulamentação de um grande subconjunto destes miRNAs expressão, foram hipo faringe, esôfago e câncer de cabeça e pescoço (valores de p 1,71 × 10

-07, 2,20 × 10

-07 e 1,02 × 10

-07, respectivamente). Curiosamente, foram relatados mesmas vias de sinalização biológicos (relevantes para o cancro) de estar envolvido com este conjunto de 30 miRNAs como foi observado com 8 miRNAs mais cedo. Mas a diferença reside no repertório e número de nós alvo de todas essas vias (Tabela S1 em Arquivo S2, Tabela S2 no arquivo S2, S3 Tabela em Arquivo S2 e S4 Tabela em S2 arquivo).

Discussão e Conclusões

expressões de 7 miRNAs foram significativamente desregulamentado em 18 amostras de câncer e significativo aumento da regulação do

hsa-miR-1293

está sendo relatado pela primeira vez em câncer bucal gengivo ( tabela 4). A partir de agora, o papel funcional do

hsa-miR-1293

no câncer é muito limitado. De acordo com miRWalk [21] e a base estelar [33], um dos objectivos previstos de

HSA-miR-1293

MAPK14

(p38), que foi mostrado estar associado com a sensibilidade do tumor

cis

tratamento -platina [34]. Se esta relação pode ser previsto validada, em seguida, a expressão deste miARN pode ser útil na previsão da sensibilidade do paciente para

cis -platina

tratamento. Dois miRNAs,

hsa-miR-206 Comprar e

hsa-miR-1

, são conhecidos por desempenhar um papel anti-tumorigénica [35] – [37] e

hsa-miR-

206 pode indiretamente ativar a apoptose, a inibição da migração celular e concentrar formação [38]. Abaixo regulação da expressão de

hsa-miR-1 | e

hsa-miR-133a

, que tem sido observada neste estudo (Tabela 5), ​​já foi relatado em um estudo anterior com carcinoma oral de células escamosas [39]. Na verdade,

hsa-miR-133a

alvos vários oncogenes e é relatado para ser comumente baixo regulamentada em uma série de outros estudos de cancro oral [35] – [40]. A expressão de ambos

hsa-miR-31

e

hsa-miR-31 *

foi relatado em alguns estudos anteriores sobre o câncer [41] – [42]. Estudo sobre linha de células de CCEO mostrou que a entrega exógena de

pré-mir-31

, o que aumenta-se a quantidade de madura

hsa-miR-31

e

hsa-miR-31 *

, reforçada CCEO oncogenicity [41] – [42]. Por isso, a nossa observação do aumento da regulação do

hsa-miR-31

e

hsa-miR-31 *

, corrobora com os relatórios existentes sobre cancros orais e outros. Semelhante a um relatório anterior sobre câncer de cabeça e pescoço, também aqui, a expressão de

hsa-miR-204

também foi encontrado para ser significativamente baixo regulados [43]. Expressão de

hsa-miR-7

, um conhecido OncomiR, é declaradamente regulado para cima em CCEO [44]. Destina-se principalmente de tumores transcrições supressores de

RECK

[16]. Neste estudo, a expressão de

hsa-miR-7

também foi significativamente up-regulamentada e, portanto, corrobora com os achados anteriores relacionados ao câncer oral. Esforços têm sido feitos para entender possível implicação biológica minando as bases de dados diferentes. A análise revelou que via processos biológicos perturbados seria mais a migração celular, a apoptose e a proliferação (Tabela S2 S2 no ficheiro). caminhos mais perturbado foram previstos para ser “proteoglicanos em câncer” e

PI3K-AKT

(Tabela S1 em S2 Arquivo), que também são suportados por nossos dados de RNA-Seq sobre a desregulamentação de alguns genes de proteoglicanos expressão e

LAMC

e

PAI

que pertencem ao

PI3K-AKT

via (dados não publicados). Estas observações também apoiar a nossa análise de caminho preditivo em relação envolvidos biológicos processos /caminhos que podem ser abrangidas por este conjunto de 8 miRNAs.

A análise de agrupamento de 18 amostras tinham mostrado que a expressão de 30 miRNAs foi encontrado para ser significativamente desregulamentado em o conjunto de 13 amostras (Figura 3b). pesquisa de literatura e mineração banco de dados com esses 30 miRNAs mostrou relevância destes genes com cancros orais e outros (Tabela 6). Embora, análise de caminho usando 8 miRNAs (identificada a partir de dados de 18 amostras de expressão) e 30 miRNAs (identificados a partir de dados de expressão de conjunto de 13 amostras) reduzida a vias de sinalização semelhantes, mas o número eo repertório de nós alvo de este conjunto de miRNAs são muito diferentes (dados não mostrados). Esta análise de cluster é, na verdade, revelando a existência de heterogeneidade molecular que pode mastigar resolução de encontrar marcador mais fina molecular. Curiosamente, observou padrão de heterogeneidade molecular de forma alguma relacionado com o subtipo diferenciação que existe dentro dos tecidos ou estágios clínicos de amostras.

Entre dois pré-cânceres, leucoplasia é conhecido por estar associado com o hábito do tabaco, ao passo que o líquen plano é uma doença auto imune. Relata-se que todos os cancros orais são precedidos por lesões pré-cancerosas. Então, fizemos o check-se, semelhante a amostras de câncer, expressão desregulamentação dos miRNAs pode ser observada nestas duas lesões pré-cancerosas. Aqui, os dados TaqMan mostraram que a expressão de apenas

HSA-mir-31

foi significativamente regulada para cima (4,55 vezes mais do que o tecido adjacente de controlo) em amostras leucoplasia (Tabela 4), mas não em tecido de líquen plano. No entanto, a expressão de outro miRNA,

HSA-mir-31 *

, também foi regulada por 4,75 dobras, mas significativamente não é diferente devido ao maior desvio padrão entre as amostras. Assim, a expressão destes dois miRNAs precisa ser verificado em mais amostras leucoplasia. Isso mais uma vez reitera sobre a proximidade molecular de leucoplasia com GBSCC do que o outro pré-câncer e líquen plano. Assim, a expressão de

HSA-mir-31 e HSA-mir-31 *

em leucoplasias tecidos poderiam ser potenciais de risco de marcadores para a progressão de pré-câncer para GBSCC.

Número de pequeno e estágio misto de amostras tumorais e ensaio de expressão de apenas 762 miRNAs por TLDA (disponível no momento da nossa experiência) Limited este estudo para inferir que a expressão de apenas 7 miRNAs foram significativamente desregulados em tecidos GBSCC em comparação com tecidos de controle adjacentes. Não há possibilidade elevada que o número de miARNs desregulados irá aumentar se poderíamos ensaiar a expressão de ~2578 miARNs presentemente conhecidos no tecido humano tal como mencionado no miRBase-20 [45]. Como resultado, a expressão de mais miRNAs poderia ter sido verificada em tecidos de câncer e leucoplasia inferir mais sobre marcadores moleculares. Mais importante ainda, o papel destes miRNAs na carcinogênese é para ser validado pelo estudo funcional.

Informações de Suporte

arquivo S1.

Genome perfil largamente a expressão miRNA para 528 miRNAs (excluindo 3 controles endógenos) em GBSCC. Cada coluna de S1 a S24 representa os dados das 18 amostras, cada linha representa os dados para ΔΔCt de um miARN específico. N /A representa há dados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0104839.s001

(XLSX)

arquivo S2.

Contém quadros suplementares

doi:. 10.1371 /journal.pone.0104839.s002

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Reconhecimentos

Nós comem com prazer agradecer ao Dr. Analabha Basu e Dr.