Abstract

activação aberrante e estado de mutação de proteínas no fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) /Akt /target mamíferos de rapamicina (mTOR) e a proteína quinase activada mitogénio (MAPK) vias de sinalização têm sido associados a tumorigénese em vários tumores, incluindo carcinoma urotelial (UC). No entanto, a terapia anti-tumor com pequenas moléculas inibidoras contra mTOR acabou por ser menos êxito do que o esperado. Foram caracterizados o mecanismo molecular desta via em carcinoma urotelial, interferindo com os componentes moleculares diferentes, utilizando inibidores químicos pequenos e tecnologia de siRNA e analisados ​​efeitos sobre o estado de activação molecular, crescimento celular, proliferação e apoptose. Na maioria das linhas de células testadas foi observada activação constitutiva da via PI3K. Manipulação de mTOR ou expressão ou atividade Akt regulava apenas fosforilação de S6K1 mas não 4E-BP1. Em vez disso, nós fornecemos evidências de uma alternativa mTOR regulação dependente independente, mas PI3K de 4E-BP1. Apenas a inibição simultânea de ambas S6K1 e 4E-BP1 suprimiu o crescimento celular de forma eficiente. Crosstalk entre PI3K e da via de sinalização MAPK é mediada via PI3K e indireta pela atividade S6K1. Inibição de MEK1 /2 resulta na activação de Akt, mas não mTOR /S6K1 ou 4E-BP1. Nossos dados sugerem que 4E-BP1 é uma potencial nova molécula alvo e estratificação marcador para a terapia anti câncer em UC e apoiar a consideração de uma abordagem multi-alvo contra PI3K, mTORC1 /2 e MAPK

Citation:. Nawroth R, F Stellwagen, Schulz WA, Stoehr R, Hartmann A, Krause BJ, et al. (2011) S6K1 e 4E-BP1 são regulados Independente e Controle crescimento do celular no cancro de bexiga. PLoS ONE 6 (11): e27509. doi: 10.1371 /journal.pone.0027509

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de agosto de 2011; Aceito: 18 de outubro de 2011; Publicado: November 15, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Nawroth et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado pela Fundação Gruber Siegfried. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga é em todo o mundo o quinto câncer mais comum com uma estimativa de 357.000 novos casos e 145.000 mortes em 2010 [1]. Carcinoma urotelial (UC), que representa 90% de todos os tumores da bexiga são uma entidade heterogénea constituída por tumores papilares e carcinomas invasivos sólidos que requerem tratamento radical uma vez que tenham progredido para a camada muscular da bexiga. Se não for tratada, cerca de 85% dos pacientes com tumor de bexiga invasivo morrerão de progressão da doença dentro de dois anos a partir do diagnóstico [2]. cistectomia radical com dissecção de linfonodos pélvicos é o padrão de tratamento para câncer de bexiga músculo-invasivo. Com esta abordagem em 5 anos probabilidades de sobrevivência livre de progressão de 65-68% pode ser alcançado em todos os estágios do tumor [3], [4]. Apesar dos avanços na quimioterapia à base de cisplatina em pacientes com doença metastática, o tempo total médio de sobrevida de 5 anos é limitada a 14-15 meses [5]. Assim, novas abordagens terapêuticas são altamente desejáveis. Um melhor conhecimento sobre a activação aberrante de vias de sinalização celular que estão envolvidos na tumorigênese da bexiga podem fornecer alvos moleculares adequados para novas terapias [6], [7], [8]. Uma tal via é a via de sinalização da via PI3K /Akt /mTOR que tem sido associada a tumorigénese em muitos tecidos [9], [10].

Normalmente, após activação por tirosina quinases receptoras ou proteínas Ras PI3K converte phosphatidylinositol- 4,5-bifosfato (PIP

2) em phosphatidylinsositol-3,4,5-trifosfato (PIP

3). Esta reacção pode ser invertida pelo PI3K antagonista de PTEN (fosfatase e homólogo tensina suprimida no cromossoma 10). PIP

3 PDK1 recrutas (proteína-quinase dependente 1) para a membrana celular onde se liga e fosforila Akt no aminoácido resíduo T308. Akt é considerado como o nó de sinalização mais crítico na regulação desta via de vários substratos que afectam os processos celulares envolvidos no controlo do crescimento e sobrevivência celular [11]. sinalização de Akt converge através das proteínas esclerose tuberosa 1/2 (TSC1 /2) e a pequena GTPase Rheb em mTOR, uma cinase de serina /treonina que forma dois complexos de proteína, quer com distintas rapina (proteína reguladora associada de mTOR) rendendo mTORC1 ou rictor (companheiro insensível rapamicina de mTOR) produzindo mTORC2 [10]. mTORC2 pode ser activado por PI3K fosforila directamente e Akt em S473, que em conjunto com a fosforilação no T308 resulta na activação de Akt total [12], [13]. Akt fosforilada no S473 tem sido associado com prognóstico pobre em muitos cancros incluindo os do pâncreas, do fígado, da próstata e da mama [13]. Os substratos mais bem definidas de mTORC1 são as quinases p70S6K1 (S6K1) e proteína de ligação a eIF4E 1 (4E-BP1), ambas as quais são importantes no controlo da iniciação da tradução da proteína [14], [15], [16]. 4E-BP1 desfosforilado pode ligar-se ao complexo de proteína elF4E para evitar a tradução dependente de tampão e desempenha um papel importante na mediação de eventos de sinalização da via PI3K e MAPK em tumores [15]. Fosforilada S6K1 é necessário para tradução de 5 ‘oligopirimidina de terminal (parte superior) mRNAs. A desfosforilação de S6K1 resulta num loop de feedback que resulta em sobre-regulação de receptores de tirosina quinases ou proteínas do substrato receptor da insulina (IRS), que, em seguida, activam o PI3K e também da via de MAPK sinalização [17], [18]. Crosstalk entre a rede de sinalização MAPK PI3K e ocorre também por meio de RAS e ERK1 /2, ativando PI3K e, adicionalmente, mTORC1 através TSC1 /2 [19], [20], [21], [22].

mTORC1 pode ser inibida selectivamente por rapamicina, um antibiótico macrólido, em que um complexo com a proteína citosólica FKBP12 inibe mTORC1 e em concentrações mais elevadas também mTORC2 [23], [24]. inibidores de mTOR novos em uso clínico, tais como everolimus (RAD001) ou temsirolimus (CCI-779) são derivados da rapamicina. Administrado como fármacos anti-tumorais, as taxas de resposta em doentes diferem 0-30% dependente do tumor [25]. Suspeita-se que a principal limitação na aplicação clínica da mTOR inibidores resultados do ciclo de feedback-mTORC1-S6K1 PI3K. Isto resultou no desenvolvimento de inibidores que têm como alvo tanto, PI3K e mTOR, tais como NVP-BEZ235 uma imidazo [4,5-c] quinolina derivado [24].

Em UC, alterações genéticas na via PI3K são comuns e ocorrem principalmente em PIK3CA, PTEN, Akt ou TSC1 /2 [26]. deleções e mutações PTEN, bem como a expressão da proteína diminui são encontrados principalmente em estágios mais elevados de tumores e tipos. Fosforilada S6K1 é um preditor independente de sobrevida específica da doença [27], [28]. Em estudos pré-clínicos com linhas celulares de UC, a inibição de PI3K LY294002 exibiu por dependente da linha celular utilizada mínimo 40% de redução em efeitos proliferativos e bloqueou a invasão de células [29], [30], [31]. Reconstituição de PTEN suprimiu o crescimento tumoral e silenciamento genético de Akt resultou no aumento da radiossensibilidade das células tumorais [27], [32]. A aplicação potencial de derivados de rapamicina em terapia UC foi apoiada pela sua capacidade para reduzir a viabilidade celular em várias linhas celulares derivadas do cancro de bexiga e num modelo de ratinho de cancro da bexiga progressiva na qual a p53 e PTEN são eliminados no urotélio da bexiga [9], [33], [34], [35], [36]. Apesar de tais observações pré-clínicos promissores, os resultados preliminares de um único braço, fase II julgamento com everolimus como monoterapia mostrou única atividade antitumoral modesto em pacientes com UC metastático [37]. Os dados sobre o papel funcional e mecanismo molecular da PI3K /Akt /mTOR e MAPK vias de sinalização em UC são muito limitados até à data e não pode explicar os resultados clínicos. Assim, caracteriza-se o mecanismo molecular da via de sinalização de PI3K /AKT /mTOR e sua regulação cruzada com a via da MAPK in vitro em linhas de células com mutações típicos para a UC. consequências funcionais na sinalização crescimento eventos e célula a célula foram estudados após a interferência farmacológica ou genética com diferentes componentes moleculares desta via através de inibidores de moléculas pequenas ou oligonucleótidos siRNA /shRNA. Nossos resultados fornecem novas informações sobre a rede molecular das vias de sinalização examinadas que resultam em uma base racional para novas estratégias de tratamento e sugere proteínas candidatas para a estratificação molecular para pacientes que sofrem de UC metastático.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e reagentes

As linhas de células RT4, HT1376, 647V, 486p, J82, 253J, EJ28, T24 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA) e RT112 (Colecção alemã de Microrganismos e culturas de Células) foram mantidas a 37 ° C em meio RPMI 1640 ou DMEM suplementado com FCS a 10%, numa atmosfera humidificada contendo 5% ou 7,5% de CO

2. NVP-BEZ235 e RAD001 foram gentilmente cedidas pela Novartis Pharma. U0126 foi adquirido a Cell Signaling Technology e LY294002 da Promega. As soluções stock foram preparadas em DMSO. As soluções de trabalho foram preparados na hora em meio de cultura de células em concentrações descritas.

Construções, transfecção e infecção

oligonucleotídeos siRNA contra 4E-BP1, S6K1 e controle foram desenhados por e comprado de Qiagen GmbH e Akt 1, -2, -3 oligonucleótidos siRNA furtivas de Invitrogen. As transfecções transientes foram realizadas utilizando X-treme transfecção do gene ou um reagente de Lipofectamin (Roche Diagnostics, Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante, utilizando 2 ug /siRNA /6 poços. Para triple adenovírus transfecção mTOR shRNA e controle shRNA foi comprado de SIRION Biotech. 1,5 × 10

5 as células foram semeadas em placas de 6 poços um dia antes da infecção, e as partículas de adenovírus foram adicionados a uma multiplicidade de infecção de 30. A supressão da expressão de proteínas foi analisada por imunoblots 2-6 dias após a transfecção ou infecção.

imunotransferência, e anticorpos

As células foram lisadas em tampão RIPA (NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,2, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS, cocktail inibidor de protease (Roche Diagnostics ), inibidor de fosfatase mistura (serva) durante 20 min em gelo. o material insolúvel foi sedimentado por centrifugação durante 30 min a 4 ° C, 30000 g. a concentração de proteína foi quantificada com a proteína BCA ™ Assay (Pierce). quantidades iguais de proteína foram . submetidas a SDS-PAGE em géis de poliacrilamida a 7,5-12% e transferida para PVDF membrana (Zefa) para imunotransferência, os anticorpos utilizados foram: Akt (C67E7), Akt1, Akt2, Akt3, fosfo-Akt (Ser473), fosfo-Akt (Thr308), GSK3β, fosfo-GSK3β (Ser9), mTOR, fosfo-mTOR (Ser2448), 4E-BP1, fosfo-4E-BP1 (Thr37 /46), S6K1, fosfo-S6K1 (Thr389), S6RP, fosfo- S6RP, p44 /42 MAPK, fosfo-p44 /42 MAPK, c-Raf, fosfo-c-Raf (Ser338) (Cell Signaling Technologies). Os anticorpos secundário conjugado com HRPO foram adquiridos a partir de Dianova. A imunotransferência foi realizada como descrito anteriormente ou modificado de acordo com a recomendação do fabricante [38]. ECL-reacção foi visualizada usando filmes autoradiografia Hyperfilm ECL (GE Healthcare). Para a quantificação, o sinal de quimiluminescência foi analisada através dos XRS ChemiDoc ™ e Quantidade ONE® Software da Bio-Rad Laboratories, Inc.

crescimento celular

Para avaliar o crescimento celular, as células foram semeadas em 1000 células /96 poços e tratadas como descrito. Após a colheita, as células foram coradas com azul e as células vivas foram contadas trypane numa câmara de Neubauer.

proliferação celular

A proliferação celular foi medida 24 h após o tratamento de células com RAD001, NVP-BEZ235 e U0126 ou 48-72 h após a transfecção /infecção com siRNAs /shRNAs. Bromodesoxiuridina (BrdU) a incorporação para a detecção de ADN sintetizada de novo e a 7-amino-actinomicina D (7-AAD) coloração para detecção de ADN de cadeia dupla foi realizada utilizando uma APC BrdU Fluxo Kit (BD Biosciences) por células pulsantes durante duas horas de acordo com a o protocolo do fabricante, seguido por análise de citometria de fluxo.

ensaio de apoptose

a apoptose foi detectada medindo a actividade de caspase 3/7 usando a caspase-Glo 3/7 ensaio de Promega GmbH, de acordo com o o protocolo do fabricante.

a viabilidade celular

As células foram tratadas com RAD001, NVP-BEZ235 e U0126 em placas de 96 poços. Às 36 h, as células foram incubadas durante 3 h com XTT. A reacção enzimática foi analisada em 450 e 650 nm num leitor ELISA.

A análise estatística

T-Student foi utilizado para comparar as médias em diferentes grupos. Os cálculos estatísticos foram realizados usando o Microsoft Office Excel.

Resultados

Expressão e estado de activação da via PI3K /Akt /mTOR em linhas de células de carcinoma urotelial

Foram analisados ​​expressão e ativação status dos componentes chave moleculares na via PI3K em um painel de 9 linhas de células derivadas da UC. As células foram colhidas e lisadas para análise de proteínas em fase de subconfluência. Expressão de Akt, mTOR, S6K1, S6RP, 4E-BP1 e PTEN foi detectado em todas as linhas celulares (Figura 1A). A fosforilação de Akt no T308 e S473 e mTOR, 4E-BP1, S6K1 e S6RP foi observada em 7 de 9 linhas de células. Nenhuma activação de Akt poderia ser detectado em células RT4 e 647V. Nessas duas linhas celulares de mTOR, S6K1 e fosforilação S6RP foi significativamente reduzida, enquanto que 4E-BP1 fosforilado era ainda em células RT4. Assim, a maioria das linhas celulares examinadas apresentaram uma via de sinalização de PI3K /Akt /mTOR constitutivamente activada. Expressão de PTEN não impede que esta activação sob as condições de crescimento examinados. Para novas experiências, decidimos trabalhar com as duas linhas de células UC RT112 (superexpressão de FGFR3) e T24 (oncogênico H-Ras, mutação PTEN homozigoto), ambos exibindo frequentemente encontradas alterações genômicas no cancro da bexiga [39], [40], [41 ]

a:. para a análise de proteínas, as células foram lisadas em tampão RIPA aplicada a SDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF. A fosforilação e a expressão de proteínas de estado foram analisados ​​em imunomarcações. B, C: As linhas de células foram tratadas durante 1 h com as concentrações indicadas de RAD001 e NVP-BEZ235. O controlo (0) contidos mesmas concentrações de DMSO, nas amostras com compostos químicos. Um resultado representativo de 3 experimentos independentes é mostrado. D: A concentração inibitória de 50% (IC50) foi determinada para proteínas alvo de PI3K e mTORC1. sinais de quimiluminescência foram quantificados usando o sistema de imagem ChemiDoc (BioRad Laboratories) e normalizados para o nível de expressão da proteína. Os valores médios de três ou mais experiências independentes são mostrados

RAD001 /CCI-779 e NVP-BEZ235 PI3K bloco e mTOR alvos a jusante de uma forma dependente da dose -. MTORC1 regulação independente de 4E-BP1

a fim de caracterizar a relevância funcional desta via na UC foram utilizados os derivados de rapamicina RAD001 e CCI-779 e da PI3K-inibidor NVP-BEZ235. Como os efeitos de CCI-779 e tratamento RAD001 eram idênticos que só retratam resultados RAD001. Em primeiro lugar, os ensaios de resposta à dose foram realizados para avaliar a actividade de RAD001 e NVP-BEZ235 1 h após o tratamento celular. A actividade dos compostos foi caracterizada por o padrão de fosforilação de S6K1 /S6RP /4E-BP1 para ambas as substâncias e para além de Akt quando utilizar NVP-BEZ235. intensidades de sinal foram medidos por um sistema de imagem de quimioluminescência e concentrações inibidoras de 50% (IC50) para o nível de fosforilação normalizados para o nível de proteína foram calculados (figura 1B, D). RAD001 inibiu a fosforilação de S6K1 e S6RP mas não de 4E-BP1 (Figura 1B). Ao expor as células a NVP-BEZ235, inibição de S6K1 /S6RP foi observada em concentrações mais baixas do que as necessárias de IC50 para a inibição da fosforilação de Akt em T308 /S473 (figura 1C, D). 4E-BP1 fosforilação diminuiu muito em concentrações que se correlacionaram com aquelas necessárias para a inibição da Akt. Assim, a inibição da mTORC1 por derivados de rapamicina regulamentados apenas fosforilação S6K1 /S6RP enquanto que a inibição de PI3K e mTORC1 /2 inibiu tanto, S6K1 e 4E-BP1 /S6RP fosforilação. células T24 respondeu a uma concentração similar ao tratamento RAD001 como RT112 mas 3 vezes mais sensíveis ao tratamento com NVP-BEZ235.

tratamento

a longo prazo com RAD001 e NVP-BEZ235 resultados em S6K1 hiperactivação mediada por PI3K /Akt

tem sido descrito que a activação S6K1 resulta em um loop de feedback negativo que regula não só a atividade PI3K, que é provavelmente responsável pelo sucesso limitado dos derivados da rapamicina no uso clínico [17]. Assim, dirigiu-se ao efeito dos compostos utilizados neste circuito fechado de realimentação. Utilizou-se três concentrações diferentes de RAD001 e NVP-BEZ235 que resultaram em% de inibição de aproximadamente 50% a 100 dos seus alvos moleculares e efeitos sobre a activação da via de sinalização de PI3K ao longo de um período de 72 horas analisadas. RAD001 tratamento resultou em S6K1 desfosforilação e induzida hiperfosforilação de Akt em T308 e S473 de uma maneira dependente da concentração, ao longo do período de observação (1-72 h) em células RT112 enquanto que em células T24 hiperactivação Akt foi induziu apenas 24-72 horas após o tratamento (figura 1B /C, 2A, os dados de 72 h não mostrado). O estado de activação da Akt alvo a jusante da GSK3-β correlacionado com o nível de fosforilação de Akt em ambas as linhas celulares (Figura 2A). nível de fosforilação ou proteína 4E-BP1 não foi afetada pelo tratamento RAD001. Ao utilizar NVP-BEZ235 a desfosforilação inicial de Akt 1 h após o tratamento invertida depois de 24 h e até mesmo concentrações 100 vezes superior ao IC50 não foram suficientes para impedir a fosforilação no T308 e apenas parcialmente em S473 (figura 2B). Correspondente ao estado de activação de Akt, observou-se a fosforilação do substrato da GSK3 Akt-β. Notavelmente, o tratamento repetido com NVP recentemente preparada-BEZ235 1 h antes da colheita das células não impediu esta hiperactivação de Akt (dados não mostrados). Fosforilação de 4E-BP1 permaneceram suprimidos ao longo do período de observação (Figura 2C)

A, B:. Efeito da RAD001 ou NVP-BEZ235 tratamento durante 24 horas no nível de fosforilação da Akt, S6K1, 4E-BP1 e GSK3 -β em células RT112 e T24. Os lisados ​​celulares totais foram aplicados a SDS-PAGE e colocados a hibridar em membranas de PVDF, seguido por imunoblots para detectar a expressão e a fosforilação das proteínas representadas nível. O controlo (0) contidos mesma concentração de DMSO, nas amostras com compostos químicos. C: células RT112 foram transfectadas com dois oligonucleótidos específicos de ARNip independentes S6K1 e um oligonucleótido aleatório como siRNA de controlo (CTR siRNA). Três dias após a transfecção, expressão e do nível de fosforilação de S6K1, Akt e GSK3-β foram analisados ​​em imunotransfer�cias.

Se S6K1 induzida diretamente /atividade Akt PI3K foi abordada por silenciar a expressão S6K1 usando dois siRNAs específicos dirigidos contra S6K1. Dois dias após a transfecção, as análises Western blot demonstrou uma redução de 90-96% no nível de proteína S6K1 (Figura 2C). A infra-regulação da expressão S6K1 correlacionada com a hiperfosforilação de Akt em S473 e T308 e GSK3-β, apoiando a S6K1-PI3K /Akt ciclo de feedback descrito.

A inibição da PI3K /mTOR mas nem silenciamento de mTOR nem Akt expressão regula 4E-BP1 fosforilação

Estes resultados levaram-nos a caracterizar o circuito de sinalização de PI3K, mTOR, Akt e 4E-BP1 em maior detalhe. Em modelos mais sugeridas, S6K1 e 4E-BP1 são alvos a jusante de Akt e mTORC1 e fosforilação na maioria dos relatórios é simultaneamente regulada [14], [15]. Os nossos resultados demonstram que apenas as células UC tratados com NVP-BEZ235 mas não RAD001 exibiram supressão da fosforilação tanto S6K1 e 4E-BP1 sugerindo que 4E-BP1 é regulada de forma diferente do que S6K1. Desde Objectivos NVP-BEZ235 membros da família de proteínas de PI3K, PI3K ou o seu alvo a jusante de Akt ou mTOR pode estar envolvido na regulação 4E-BP1 fosforilação. Nós testado pela primeira vez se poderíamos verificar os efeitos da NVP-BEZ235 usando o LY293002 completamente caracterizado inibidor da quinase que foi originalmente concebido como um inibidor específico PI3K, mas aparece também actividade para outras cinases não relacionados PI3K [42], [43]. S6K1 fosforilação foi reduzido com uma IC50 de 3 nM enquanto o IC50 duplicou a 7 nM para induzir uma redução no Akt (S473 /T308) e 4E-BP1 fosforilação, assemelhando-se assim a cinética da actividade de NVP-BEZ235 em Akt /4E-BP1 fosforilação (Figura 3A e 1B)

a:. ensaio de resposta à dose com células tratadas 24 horas com o inibidor de PI3K LY294002. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​em imunomarcações que demonstrem os efeitos dependentes da dose sobre a expressão e a fosforilação nível de Akt, S6K1 e 4E-BP1 em células RT112. B: O silenciamento da expressão de mTOR 3 dias após a infecção com mTOR adenoviral shRNA ou shRNA controle (CTR shRNA). Os lisados ​​celulares totais foram analisados ​​em imunomarcações para a fosforilação e expressão nível de S6K1, S6RP, Akt e 4E-BP1. C: Akt expressão regula a fosforilação de S6K1 mas não 4E-BP1. Transfecção de células com oligonucleotídeos específicos siRNA furtiva ou controlar siRNA expressão silenciado de todas as três isoformas de Akt. 3 dias após a transfecção as células foram lisadas aplicada a SDS-PAGE transferidas para membrana de PVDF e nível de isoformas de Akt e de expressão e nível de fosforilação de 4E-BP1 e S6K1 expressão foram analisados.

A fim de examinar mais esta observação, foi utilizada uma abordagem shRNA adenoviral para silenciar a expressão da proteína mTOR, que deve resultar em inactivação específica de ambos, complexos de proteínas mTORC1 e mTORC2. Dois dias após a infecção, análises de Western blot confirmou um knockdown 85-96% no nível de proteína mTOR que permaneceu estável durante 5 dias (Figura 3B). O knockdown resultou em desfosforilação de S6K1 e S6RP sem afetar nível de expressão da proteína. Foi detectado apenas efeitos mínimos sobre 4E-BP1 fosforilação em relação ao nível de proteína 4E-BP1. Notavelmente, Akt fosforilação foi reduzida em 40-60% em resíduos T308 e S473.

passado, a influência de Akt em 4E-BP1 fosforilação foi caracterizado utilizando os siRNAs dirigidos contra as três diferentes isoformas de Akt. Três dias após a transfecção, a batida combinada para baixo de todas as três isoformas resultou em 90% de expressão da proteína reduzida de todas as três isoformas de Akt (Figura 3C). Somente a fosforilação S6K1 mas não o nível de fosforilação 4E-BP1 foram reduzidos sem afectar o nível de proteína, indicando que 4E-BP1 ao contrário S6K1 não está a jusante de Akt nas linhas celulares examinadas.

diafonia entre a via de sinalização de PI3K e MAPK ocorre múltiplos passos

Dada a importância da PI3K e MAPK biologia via, foi examinada a interacção das duas vias no cancro da bexiga. As células foram tratadas com RAD001, NVP-BEZ235 ou com o inibidor U0126 e activação estado MEK1 /2 de proteínas chave em ambas as vias de 1-72 horas após o tratamento, foram analisadas em Western blots. A inibição da mTORC1 por RAD001 activação induzida de ERK1 2 fosforilação /24-72 h após o tratamento (Figura 4A, painel superior). O mesmo efeito foi observado quando silenciar a expressão da proteína S6K1 que resultou no aumento da RAF1 /ERK1 /2 fosforilação (Figura 4B). No entanto, a inibição de tanto a PI3K e mTOR por NVP-BEZ235 induzida rapidamente ERK1 2 fosforilação /ao longo do período de observação de 1-72 h (Figura 4A, painel inferior). Conclui-se que a supressão de /actividade /mTOR PI3K Akt geralmente resulta em activação da via Raf /MEK /ERK sinalização, mas a cinética do processo depende de qual alvo molecular no antigo percurso é inibida

A.: células RT112 e T24 foram tratados com RAD001 ou NVP-BEZ235 durante 1 h ou 24 h. Expressão e fosforilação de status de ERK1 /2 foi analisada em imunoblots em lisados ​​de células inteiras. B: Dois dias após a transfecção com os oligonucleótidos de ARNsi contra S6K1 ou ARNsi de controlo (CTR siRNA), as células foram lisadas e a fosforilação e expressão de status de Raf e ERK1 /2 foi analisada em imunoblots. C: As células foram tratadas durante 24 h com RAD001, NVP-BEZ235 e U0126 sozinho ou em combinação e os efeitos sobre a expressão e a fosforilação nível de Akt, S6K1 e ERK1 /2 foi analisada em imunoblots

. em seguida, analisadas as consequências bioquímicas quando inibir tanto a via PI3K /AKT /mTOR e da via de MAPK, usando RAD001, NVP-U0126 BEZ235 ou em combinação ou sozinhos U0126. Quando as células foram tratadas com U0126 sozinho, ERK1 /2 fosforilação foi completamente abolida enquanto que a fosforilação de Akt em S473 e T308 foi regulada positivamente (Figura 4C). Curiosamente, não foi possível demonstrar qualquer alteração no S6K1 fosforilação. Ao combinar U0126 com qualquer RAD001 ou NVP-BEZ235, Akt hyperphosphorylation foi significativamente aumentada em comparação com o tratamento com uma ou outra substância única em células T24.

PI3K /AKT /mTOR e MAPK sinalização regulam a proliferação celular, viabilidade e apoptose

em seguida, determinaram como a manipulação da PI3K e MAPK sinalização influências de proliferação celular na UC. Em primeiro lugar, as células foram tratadas com RAD001, NVP-BEZ235 e U0126 sozinho ou em combinação, e a proliferação das células foi monitorizada ao longo do tempo. Três dias após o tratamento, RAD001 inibiu a proliferação celular em 62% em RT112 e 40% em células T24 relativos ao controlo de solvente (Figura 5A). O tratamento com a proliferação de células completamente inibida NVP-BEZ235 em células RT112 e reduziu-a em 66% em células T24. U0126 tratamento inibiu a proliferação em 70% e 76% em células RT112 ou T24, respectivamente. Combinando RAD001 ou NVP-BEZ235 com U0126 proporcionaram efeitos aditivos, com a combinação de NVP-BEZ235 /U0126 sendo mais eficaz (Figura 5A). Para caracterizar estes efeitos em maior detalhe, análise do ciclo celular foi medida através da combinação de incorporação de BrdU e coloração com 7-AAD, a resposta apoptótica medindo a actividade da caspase e a viabilidade /metabolismo por XTT-ensaios. Como para análise do ciclo celular, o tratamento RAD001 diminuiu a fracção de células em fase S de 11% em ambas as linhas celulares (Figura 5B). NVP-BEZ235 reduzida células em fase S, por 84% em RT112 e por 22% em T24, enquanto que as células U0126 reduzidas em fase S por 97% em T24, mas apenas em 52% em células RT112. A combinação de inibidores de PI3K e MAPK sinalização tinham efeitos aditivos na proliferação das células com a combinação de NVP-BEZ235 /U0126 ser mais eficaz na redução do número de células em fase S por 94-98%. Todas as substâncias induziu um aumento em células paradas em fase G1 que correlacionada com a diminuição de células que entram na fase S, indicando que a inibição de qualquer via dá origem a paragem em G1 em linhas celulares de UC (Figura 5B). A apoptose foi medida por actividade de caspase (Figura 5C) [11]. Ambos, e RAD001 tratamento NVP-BEZ235 diminuiu a activação da caspase em células RT112 por 32-45%. Em células T24, RAD001 e NVP-BEZ235 reduzida actividade de caspase por 43-48%. U0126 não teve nenhum efeito significativo sobre a actividade da caspase e não aumentar a actividade de RAD001 ou NVP-BEZ235 quando combinados em conjunto. Para medir a viabilidade celular, mesmo número de células foram analisadas utilizando um ensaio de XTT. Dependente do Fundo celular, observou-se uma redução de 30-50% com RAD001 e 70-85% com NVP-BEZ235 (Figura 5D). Curiosamente, não foi possível detectar efeitos aditivos pela inibição combinada da via PI3K /Akt /mTOR e MAPK. Concluímos que PI3K /mTOR e MAPK atividade da via na UC proliferação celular controle, apoptose celular e vitalidade e que ambas as vias pode substituir parcialmente a perda de uns aos outros com respeito à proliferação.

células RT112 e T24 foram tratados com RAD001 (5 nM), NVP-BEZ235 (100 nM para T24, 500 nM para RT112) e U0126 (25 nM) sozinho ou a combinação indicada e um controlo de DMSO (CTR). A: Para contagem de células, as células foram coradas com azul de tripano e o número de células vivas foi determinado. análise do ciclo celular após 24 horas de tratamento com compostos químicos, mediante a incorporação de BrdU em combinação com coloração com 7-AAD: B. C: Medição de caspase 3/7 actividade como um parâmetro para a apoptose e D: de XTT-teste para a detecção de viabilidade celular realizada 24 horas após o tratamento. Os valores apresentados são a média ± desvio padrão de 3 experiências independentes. Teste t de Student foi realizado para análise estatística. (*: P 0,05)

A actividade combinada de S6K1 e 4E-BP1 regular a proliferação celular em urothelial carcinoma

Finalmente , que abordou a questão por NVP-BEZ235 afeta o crescimento celular mais eficazmente do que RAD001. Nós demonstramos que NVP-BEZ235 ao contrário RAD001 influencia tanto, S6K1 e fosforilação 4E-BP1. Assim, usamos tanto oligonucleotídeos siRNA contra S6K1 ou 4E-BP1 ou combinados RAD001 com 4E-BP1 siRNAs para imitar o efeito adicional presumido de NVP-BEZ235. Dois dias após a transfecção ARNsi contra 4E-BP1 ou S6K1 reduzida a expressão da proteína por 80-96% (Figura 6A, 2C). As células silenciadas para S6K1 ou expressão 4E-BP1 exibiram reduziu significativamente a proliferação celular em 40% (RT112) a 60% (T24) comparado com os controlos (Fig. 6B), obtendo-se efeitos comparáveis ​​aos observados após o tratamento everolimus (Figura 5A). No entanto, a combinação de 4E-BP1 siRNA e everolimus tratamento reduziu o crescimento celular por 80-85%, no mesmo grau como se observa com NVP-BEZ235. Análise de proliferação celular demonstraram que o efeito foi novamente mediada por paragem do ciclo celular na fase G1 /G0 (dados não mostrados). Em resumo, tanto a alvo a jusante mTORC1 S6K1 e 4E-BP1 estão a um nível semelhante envolvida na regulação da proliferação celular UC, controlando a progressão do ciclo celular da fase G1 /0 a viabilidade celular e fase S

a:. Dois dias após transfecção com ARNsi contra 4E-BP-1, a expressão da proteína em células T24 e RT112 foi detectada em imunoblots. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. B: Crescimento de células vivas, silenciadas para S6K1 ou expressão 4E-BP1 ou células silenciadas para a expressão 4E-BP1 e incubadas com everolimus (RAD001) foram monitorados ao longo do tempo. Valores médios ± desvios-padrão são mostrados; comparações estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de Student. (*: p 0,05)

Discussão

Apesar de uma melhor compreensão da biologia do câncer da bexiga dentro últimos anos, apenas pequenas melhorias na gestão terapêutica desta doença foram alcançados durante as duas últimas décadas. As PI3K /Akt /mTOR e vias de sinalização MAPK são propensas a mutações e activação aberrante nesta entidade tumoral e pode proporcionar alvos adequados para as terapias mais eficazes [44]. Dessa forma, caracterizado ambas as vias de sinalização em relação ao status de ativação, o mecanismo molecular e relevância para a proliferação celular na UC. Pudemos confirmar circuitos reguladores descritos anteriormente que controlam a ativação destas vias. Nossos dados sugerem fortemente um novo mecanismo que controla a activação do elemento a jusante 4E-BP1 dentro desta rede de sinalização.