evidências

Abstract

Não está acumulando ativada que desregulado de sinalização JAK ocorre em uma ampla variedade de tipos de câncer . Em particular, as mutações em JAK2 pode resultar na activação constitutiva de factores de transcrição STAT, e levar a um crescimento oncogénica. JAK quinases são estabelecidos proteínas clientes Hsp90 e aqui vamos mostrar que a pequena molécula Hsp90 ganetespib novo inibidor (ex-STA-9090) apresenta potente

in vitro

e

in vivo

de actividade numa gama de sólido e células tumorais hematológicas que são dependentes da atividade JAK2 para o crescimento e sobrevivência. De nota, tratamento ganetespib resulta em esgotamento sustentado de JAK2, incluindo o constitutivamente ativa JAK2

mutante V617F, com subsequente perda de actividade STAT e reduziu a expressão do gene STAT-alvo. Em contraste, o tratamento com o pan-JAK P6 inibidor resulta em apenas efeitos transitórios nesses processos. Além disso diferenciar estes modos de intervenção, os estudos de expressão de ARN e proteína mostram que modula ganetespib adicionalmente proteínas reguladoras do ciclo celular, enquanto P6 não. O impacto concomitante de ganetespib em ambos o crescimento celular e sinalização divisão celular traduz a eficácia antitumoral potente em modelos de ratos com enxertos e divulgados JAK /leucemia impulsionado-STAT. No geral, nossos resultados suportam a inibição de Hsp90 como uma nova abordagem terapêutica para combater doenças dependentes de JAK de sinalização /STAT, com a ação multimodal de ganetespib demonstrando vantagens sobre os inibidores específicos-JAK

Citation:. Proia DA, Foley KP, Korbut T, Sang J, Smith D, Bates RC, et al. (2011) intervenção multifacetada pela Hsp90 Inhibitor Ganetespib (STA-9090) em células cancerosas com Activated JAK /STAT Signaling. PLoS ONE 6 (4): e18552. doi: 10.1371 /journal.pone.0018552

editor: Olivier Gires, Universidade Ludwig-Maximilians, Alemanha |

Recebido: 26 Janeiro, 2011; Aceito: 04 de março de 2011; Publicação: 14 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Proia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Todos os autores são ou foram funcionários da Synta Pharmaceuticals, Inc. e todos, exceto RC Bates e AF Rosenberg detenham ações ou opções em Synta Pharmaceuticals, Inc. Este não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

JAK2 está um membro ubiquamente expresso da família Janus quinase-associado (JAK) de tirosina-quinases não receptoras que funcionar para mediar a sinalização a jusante dos receptores do factor de crescimento e citocina [1]. activação inapropriada de sinalização subjacente JAK proliferação e sobrevivência celular numa variedade de tumores sólidos [2], [3] e neoplasias hematológicas [4]. Em particular, um ponto de mutação activadora em JAK2 (JAK2

V617F) foi descrito com alta frequência em desordens mieloproliferativas crónicas (MPD) [5], [6], [7], [8], [9], [ ,,,0],10] e a activação constitutiva de JAK2 causada por translocações cromossómicas foi classificado em diversos tipos de leucemia [11], [12], [13].

complexos de citocina-JAK activados recrutar e fosforilar moléculas efectoras, incluindo Transdutores de sinal e activadores de Transcrição (STAT) proteínas [14]. proteínas STAT mediar uma ampla gama de processos biológicos, incluindo o crescimento celular, diferenciação, apoptose, inflamação e resposta imune [15]. Duas estatísticas em particular, STAT3 e STAT5, representam os principais substratos para JAK2 que governam myelopoeisis [16], [17] e pode contribuir para a transformação celular [18], [19]. Sua activação persistente tem sido associada ao aumento da proliferação de células tumorais, a sobrevivência, a metástase e inflamação indutor de tumores em ambos os tumores sólidos e hematológicos [20]. Por conseguinte, inibir a este eixo de sinalização através da utilização de inibidores específicos de moléculas pequenas de JAK2 foi recentemente investigada como um ponto de intervenção terapêutica em várias indicações tumorais humanos [3], [21], [22], [23], [24] .

proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é uma chaperona molecular necessário para a estabilidade pós-tradução dos seus substratos proteicos ou “proteínas” cliente. As células cancerosas contêm níveis elevados de Hsp90 activa [25] e, porque muitas proteínas clientes desempenham papéis críticos oncogénicos, as células cancerosas são particularmente sensíveis à inibição de Hsp90. Além disso, uma característica única de segmentação Hsp90 é que a inibição resulta no bloqueio simultâneo de várias cascatas de sinalização oncogénicos, superando possíveis redundâncias pathway, e sensibilização de células cancerosas a agentes quimioterapêuticos [26], [27], [28], [29]. Assim, a Hsp90 representa um alvo molecular atraente para o desenvolvimento de novas terapias de cancro [28], [30], [31]. De relevância aqui, JAK quinases são estabelecidos clientes Hsp90, sugerindo que a inibição de Hsp90 pode ser eficaz no tratamento de doenças neoplásicas JAK-dirigidas [32], [33].

Para testar esta hipótese, foram utilizados a molécula pequena sintética ganetespib inibidor (STA-9090), um composto contendo resorcinol não relacionado com geldanamicina, que se liga no domínio de ligação a ATP de Hsp90. Em estudos pré-clínicos, o fármaco demonstrou actividade nanomolar baixa

In vitro

contra uma variedade de linhas celulares de cancro humano e eficácia antitumoral potente contra modelos de xenoenxerto humanos [34], [35]. Ganetespib está actualmente em ensaios clínicos tanto de tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Aqui mostramos que ganetespib potentemente induz apoptose numa variedade de linhas de tumores dependentes de sinalização persistente JAK /STAT em crescimento e sobrevivência. Demonstramos ainda que a droga também altera muitos elementos de regulação do ciclo celular em células cancerosas, uma actividade ausente de um inibidor específico da JAK.

In vivo

, ganetespib de coordenar impacto sobre o crescimento celular e divisão celular resulta em actividade antitumoral potente em JAK /modelos dirigidos-STAT de leucemia humana. Assim, a inibição da actividade de Hsp90 representa uma abordagem promissora para o combate de doenças dependentes de sinalização JAK /STAT constitutiva, com ganetespib demonstrando potenciais vantagens terapêuticas sobre inibidores específicos-JAK.

Resultados

Ganetespib inibe JAK2- mediada por transdução de sinal e a proliferação em cancros hematológicos

Com baixa potência nanomolar, ganetespib reduziu a viabilidade celular em um grupo de hematológica humano e as linhas celulares de tumores sólidos seleccionados pela sua dependência de JAK /STAT sinalização e variando tipo de cancro (Fig. 1A). Em cada uma das linhas testadas, ganetespib foi mais potente do que a Hsp90 ansamicina inibidor de 17-AAG. De nota, ganetespib foi superior a 100 vezes mais potente do que 17-AAG nas células set-2 e leucemia HEL92.1.7, linhas de células portadores JAK2

mutações V617F constitutivamente ativas que agem como seus condutores oncogênicos.

(a) fixar-2, HEL92.1.7, MV4-11, as células NCI-H1975 e DU145 foram tratados com ganetespib ou 17-AAG ao longo de um largo intervalo de doses (0,0001-1 uM) durante 72 horas e a viabilidade celular avaliada por Alamar coloração azul. (B) Ganetespib exibe inibição mais duradoura de JAK de sinalização /STAT em comparação com P6. HEL92.1.7 células foram cultivadas na presença de 250 nM ou 1000 nM ganetespib P6 e colhida entre 0 e 48 h. Os níveis de expressão das proteínas indicados foram determinados por Western blot. (C) Ganetespib é significativamente mais potente do que o 17-AAG. células set-2 foram tratados com as concentrações indicadas de ganetespib ou 17-AAG, durante 24 h, e analisadas para determinar JAK /STAT proteína e níveis-alvo utilizando os anticorpos indicados.

Usando as células HEL92.1.7 , comparou-se a actividade inibidora de JAK /STAT de ganetespib ao composto Pyridone-6 (P6) [36], um inibidor da pan-ATP competitivo reversível das JAKs (Fig. 1B). Ganetespib e P6 cada sinalização dependente de JAK2 bloqueados, como evidenciado pela perda de fosfo-STAT3 e STAT5-fosfo, e a sinalização ERK. No entanto, ganetespib era pelo menos quatro vezes mais potente e suprimiu STAT sinalização maior em comparação a P6. tratamento Ganetespib sozinho conduziu às segmentados, dependente de proteassoma (dados não mostrados) perda de JAK2 e os níveis de proteína fosfo-AKT (Fig. 1B), ambas as proteínas Hsp90 cliente. Assim, o tratamento ganetespib resulta na inibição sustentada de múltiplos alvos oncogênicos nestes modelos celulares de malignidade-driven JAK2. Efeitos semelhantes sobre a sinalização de JAK /STAT foi observada com células set-2, em que 50 nM ganetespib foi capaz de desestabilizar JAK2 suficientemente para provocar uma perda de activada (

ie

, fosforilado) STAT3 e STAT5 de expressão (Fig. 1C ). 17-AAG mostrou efeitos comparáveis ​​como ganetespib mas foi de 200 vezes menos potente, em linha com os dados de viabilidade descritos acima. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que ganetespib possui actividade inibidora superior de JAK /STAT para ambos P6 e 17-AAG em termos de potência ou duração da resposta.

Ganetespib ab-roga a sinalização de JAK /STAT em tumores sólidos

para além da sua incidência em malignidades hematológicas, a activação oncogénica STAT é também prevalente em uma gama de tumores sólidos. Por exemplo, a STAT3 persistentemente activados é encontrada em 50% dos adenocarcinomas do pulmão e é observado principalmente em tumores com mutações no receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) [37], [38]. A linha celular de cancro do pulmão de células não pequenas NCI-H1975 (NSCLC) expressa o cliente Hsp90 EGFR

L858R /T790M, uma forma constitutivamente activada e resistente a erlotinib de EGFR, e tratamento ganetespib resultou num decréscimo dependente da dose no EGFR expressão nestas células (FIG. 2A). Além disso, também induziu ganetespib potente degradação de JAK2 e perda de STAT3 fosforilado de forma dependente da dose. Inactivação de AKT e GSK3β, proteínas importantes na regulação da apoptose, foi observada com uma dose resposta semelhante à de sinalização JAK2 /STAT3. Recentemente foi demonstrado que a JAK2 pode modular a actividade dos reguladores apoptóticos adicionais, tais como mau e BCL-XL para promover a sobrevivência de células [21]. Consistente com isto, foi detectada uma redução concomitante nos níveis de Bad fosforilada (Fig. 2A), reduzindo assim a actividade pró-apoptótica de esta proteína. Estes dados sugerem um mecanismo potencial para explicar a resposta citotóxica observada com tratamento ganetespib (Fig. 1A).

(A) regulação negativa da proteína cliente em NSCLC. células NCI-H1975 foram doseados com as concentrações indicadas de ganetespib durante 24 h e os seus lisados ​​celulares analisados ​​para determinar JAK /STAT e os níveis de proteína Hsp90 cliente utilizando os anticorpos indicados. blocos (B) Ganetespib IL-6 induzida e atividade STAT3 constitutiva em células NSCLC. HCC827 células de cancro de pulmão foram tratadas com concentrações crescentes de ganetespib ou P6, durante 24 h, seguida por uma estimulação de 15 min com ou sem 50 ng /ml de IL-6 recombinante humana. Os níveis de JAK2, total e fosfo-STAT3, e PIM2 foram analisados ​​por Western blot. GAPDH é incluída como um controlo de carga. (C) a degradação da proteína cliente em células de câncer de próstata. células DU145 foram tratados com concentrações crescentes de ganetespib durante 24 horas e celulares lisados ​​sujeitos a western blot para determinar JAK /STAT e direcionar os níveis de proteína utilizando os anticorpos indicados. (D) a Hsp90 funcional é necessário para JAK2, mas não JAK1, estabilidade em células DU145. células DU145 foram tratadas com DMSO (controle, C), 15 nM, 60 nM ou 240 nM ganetespib durante 24 ou 48 horas e lisados ​​sondados por western blot com os anticorpos indicados.

O JAK /eixo sinalização STAT é um modulador chave de sinalização de citocina e um mecanismo proposto para a activação da STAT3 aberrante em cancro pulmonar envolve a regulação positiva de autócrina e /ou parácrina de sinalização de IL-6 [2]. Portanto, nós investigamos se ganetespib poderia inibir essa sinalização em células NSCLC. Na ausência de ligando externo, as células tratadas com HCC827 ganetespib exibiram uma diminuição dependente da dose, na expressão de JAK2, levando a uma perda da actividade de STAT3 e expressão do alvo a jusante PIM2 STAT (Fig. 2B). Biochemical inibição de JAK2 por P6, embora a concentrações mais elevadas, de forma semelhante regulada negativamente a actividade constitutiva de STAT3, mas não influenciaram os níveis de proteína total de JAK2. Da mesma forma, ambos os compostos bloquearam a estimulação de sinalização de JAK /STAT, quando a via foi activada por IL-6 tratamentos (Fig. 2B).

desregulada de IL-6 de sinalização /JAK2 também tem sido implicada em tumorigénese cancro da próstata [39 ], [40]. A linha de células de câncer de próstata DU145 expressa uma IL-6 loop de sinalização autócrina [41] e foi recentemente relatado para ser sensível aos efeitos de um novo inibidor de molécula pequena JAK2

in vitro

e

in vivo

[3], [41]. Ganetespib foi um potente indutor de morte celular nesta linha (Fig. 1A). Caracterização bioquímica de células DU145 revelaram efeitos inibidores semelhantes sobre a sinalização JAK2 seguintes ganetespib tratamento (Fig. 2C). Foi observada perda de JAK2, fosfo-STAT3 e fosfo-SHP2, um JAK2 interage fosfatase importante para a transdução do sinal de JAK2, a seguir à adição de ganetespib. Curiosamente, a quinase JAK1 relacionado expresso nesta linha de células não foi alvo para a degradação, mas em vez disso parece aumentar após a exposição ganetespib (Fig. 2D). Foram obtidos resultados semelhantes para a linha celular de cancro da próstata PC-3 (dados não mostrados). Estes dados mostram que a degradação seletiva de JAK2 em células da próstata DU145 foi suficiente para revogar subsequente ativação da sinalização da STAT3.

inibição Hsp90 regula negativamente a transcrição de alvos de sinalização JAK /STAT e genes do ciclo celular

Em HEL92 .1.7 células de eritroleucemia, inibição bioquímica de JAK2 por tratamento P6 resultou em uma perda de viabilidade celular, mas com 30 vezes menos do que a potência ganetespib (IC

50 valores 600 vs. 20 nM) (Fig. 3A). Para comparar o impacto celular de cada inibidor, nós identificado pela primeira vez condições em que a actividade JAK2 foi reduzida a níveis equivalentes por cada droga com base em suas diferenças cinéticas e potência. Tal como ilustrado na Figura 3B, o 4 horas P6 (1000 nM) e ganetespib 24 horas foram seleccionadas (250 nm) tratamentos por causa dos efeitos comparáveis ​​sobre STAT3 /5 sinalização. expressão de ARN de perfil em todos esses momentos revelados, como esperado, que muitos genes alvo de JAK /STAT (tais como membros da família SOCS e PIM) foram reprimidos por ambos os fármacos (Fig. S1, S1 Tabela). No entanto, os genes adicionais foram alterados por tratamento ganetespib que não foram afectadas nas células tratadas com P6 (Fig. 3 C, D). Além levando à regulação positiva esperada de genes de proteínas de choque térmico numerosos, o tratamento ganetespib também alterou seletivamente a expressão de um grande conjunto de genes envolvidos em actividades relacionadas com o ciclo celular, incluindo a replicação do DNA e reparação (BRCA1 /2), regulação do ciclo celular (CDC2 , CDC25), actividades centrossoma /fuso (BUB1 /3, CENPE /M, KIF14, FAM33A), condensação de cromossomas (TOP2A, NCAPG), e a replicação (RFC3 /4, família MCM) (Fig. S1). Com efeito, a análise dos genes alterados por agrupamento hierárquico e pontuação enriquecimento revelou que moduladores da divisão celular foram os processos mais importantes diminuíram por tratamento ganetespib (Tabela 1).

(A) efeitos comparativos de ganetespib e P6 sobre HEL92 .1.7 viabilidade de células tumorais. HEL92.1.7 células foram tratadas com ganetespib ou P6 ao longo de um largo intervalo de doses (0,0001 a 10 uM) durante 72 h e a viabilidade celular avaliada por Alamar Blue. (B) Os efeitos temporais e dependentes da dose contra alvos JAK /STAT por ganetespib e P6. células HEL92.1.7 foram tratados com ganetespib ou P6 para 4 e 24 h e lisados ​​de células sujeitas a western blot para determinar JAK2 /STAT e proteínas-alvo níveis usando os anticorpos indicados. (C) Affymetrix GeneChip análise das células tratadas com ganetespib e P6. HEL92.1.7 células tratadas com 250 nM ganetespib durante 24 h ou 1000 nM P6 durante 4 h. Os níveis de expressão de genes em DMSO tratada (isto é, controlo do veículo), as células (eixo X) são representados graficamente contra as de células tratadas com droga (eixo Y). (D) Diagrama de Venn do número de genes diferencialmente regulados por ganetespib e P6.

A modulação da expressão da proteína do ciclo celular por ganetespib induz a paragem do crescimento

Para estender estes resultados, analisámos experimentalmente os efeitos sobre o ciclo celular. Ganetespib induziu um G temporais

1 e G

2 /M prisão em células HEL92.1.7, com perda concomitante de fase S (Fig. 4A). Em contraste, o tratamento P6 induzida acumulação no G

1 única fase, sem a perda da fase S ou G

2 /M detenção. Nós também examinaram os efeitos alvo de ganetespib sobre mediadores críticos de divisão do ciclo celular no nível de proteína. Observamos redução dos níveis de proteína de ciclina-cinase 1 dependente (CDK-1), um regulador chave do G

2 /H do ponto de verificação, depois de uma exposição de 24 horas para ganetespib, um efeito que persistiu até pelo menos 48 horas (Fig. 4B). Em contraste, P6 não teve nenhum efeito sobre a expressão Cdk1. Além disso, o nível de fosfo-Chk2, um outro ponto de verificação quinase integrante, foi reduzido por tratamento ganetespib. Foram encontrados resultados semelhantes para fosfo-Chk1 (dados não mostrados). Tal como mostrado na Figura 4C, a desestabilização das quinases ciclina também foi associada a uma acumulação temporal das ciclinas A1 e B1, em resposta à adição do fármaco. Além disso, foram observados estes efeitos de ganetespib em ambos regulação JAK2 /sinalização STAT e do ciclo celular em tipos adicionais do cancro, incluindo cancro da mama (MCF-7), do estroma gastrointestinal (GIST882), pâncreas (HPAF) e da próstata linhas de células de tumor (DU145) ( A Fig. 4D). Em geral, estas influências adicionais sobre o mecanismo de divisão celular sugerem que ganetespib possui vantagens sobre inibidores específicos-JAK para controlar doenças malignas STAT-driven decidido.

(A) células HEL92.1.7 foram tratadas com 250 nM ganetespib ou 1000 nM P6 (ou DMSO como controlo) e a distribuição do ciclo celular por citometria de fluxo em 3, 5, 9 e 24 h pós-tratamento. (B) As células foram doseados com HEL92.1.7 ganetespib (250 nM) ou P6 (1000 nM) durante 48 h. As células foram colhidas nos pontos de tempo indicados e os níveis de total e fosfo-Cdk1, fosfo-Chk2 e GAPDH analisados ​​por Western blot. (C) Cinética de efeitos sobre ganetespib JAK /STAT e expressão de proteínas do ciclo celular. células HEL92.1.7 foram tratadas com 100 nM ganetespib, colhidas em intervalos de uma hora ao longo de um curso de tempo 11 h, e sujeito a western blot com os anticorpos indicados. (D) MCF-7, células GIST882, HPAF e DU145 foram doseados com concentrações graduais de ganetespib durante 24 h e analisadas por transferência de Western utilizando os anticorpos indicados.

Ganetespib prolonga a sobrevivência de uma JAK2

modelo do rato V617F-mutante de leucemia

humana

Para determinar se essas atividades duais de ganetespib em JAK2 sinalização /STAT e progressão do ciclo celular observada

in vitro

traduzir-se em eficácia antitumoral

in vivo

, estabelecemos um modelo de leucemia ortotópico usando HEL92.1.7 células. Isto resultou em doença disseminada com morbidade tipicamente resultante da paralisia dos membros traseiros causada por metástases coluna vertebral (dados não mostrados). Para estudar o efeito sobre a sobrevivência de ganetespib, começando um dia após implantação de células de tumor, a droga foi administrada intravenosamente, na sua dose mais elevada não-tóxico severamente (HNSTD) de 25 mg /kg, em uma programação 5 × /semana até ao dia 19. Como mostrado na Figura 5A, o tratamento ganetespib mais do que dobrou a sobrevida global mediana (76,5 dias.

vs

34 dias,

P Art 0,0001). O tratamento foi bem tolerado ganetespib, sem perda significativa de peso corporal encontrados ao fim de 3 semanas de administração (Fig. S2). O aumento da sobrevida dos animais tratados correlacionados com diminuiu dramaticamente carga de células tumorais na sua medula e da medula espinal, tal como determinado por análise histológica (Fig. 5B).

(A) análise de Kaplan-Meier da sobrevivência global em um modelo de leucemia estabelecida por IV injecção de células HEL92.1.7 em ratinhos SCID, o que resultou no desenvolvimento de doença disseminada. Começando um dia após implantação de células de tumor, era ganetespib i.v. doseados a sua HNSTD (25 mg /kg) sobre a cinco vezes por programação semana durante 3 semanas até ao dia 19 (n = 10 /grupo). *

P Art 0,0001; 2-sided teste log-rank. (B) Ganetespib inibe drasticamente a carga de células tumorais na medula espinal e na medula óssea adjacente. coloração Immunohistochemistical (H E) de secções transversais da coluna lombar do controlo do veículo (painéis da esquerda) ou tratados ganetespib (painéis da direita) animais. As inserções são ampliadas nos painéis inferiores. ampliação original: 40 × em painéis superiores; 200 × nos painéis inferiores.

Ganetespib exibe potente

in vivo

eficácia em STAT5 impulsionado xenotransplantes AML

MV4-11 células de leucemia mielóide aguda expressar a actividade de STAT5 constitutiva como uma consequência de uma mutação duplicao em tandem interna (ITD) na tirosina cinase de receptor de FLT3, outra proteína Hsp90 cliente [42] e, como tal, representam um modelo alternativo de oncogénese impulsionado-STAT. Estas células são altamente sensíveis a ganetespib

in vitro

(Fig. 1A) e avaliou-se a sua dose-resposta a ganetespib tratamentos em xenotransplantes. Ganetespib foi administrada por via intravenosa a ratinhos SCID com tumor, quer ao HNSTD diária ou semanal de 25 mg /kg ou 150 mg /kg, respectivamente. Como mostrado na Figura 6A, o esquema de tratamento semanal resultou na inibição do crescimento tumoral significativa e dependente da dose, enquanto o regime diário de dosagem (25 mg /kg de 5 × /semana, tal como utilizado no modelo ortotópico acima) resultou na regressão do tumor significativa ( 84%). Em ambos os regimes de dosagem, o crescimento do tumor foi suprimido durante até uma semana ou mais, uma vez o tratamento foi interrompido. Após este período, como evidenciado pelo grupo de tratamento uma vez por semana, o crescimento do tumor pode re-iniciar.

(A) ratinhos SCID foram implantados subcutaneamente com MV4-11 células de leucemia mielóide aguda. Ratinhos portadores de xenoenxertos estabelecida MV4-11 (100-200 mm

3, n = 8 ratinhos /grupo) foram i.v. doseada (pontas de seta) com ganetespib em 25 ou 150 mg /kg uma vez por semana, durante 3 semanas, ou no HNSTD de 25 mg /kg cinco vezes por semana, tal como indicado. % T /C os valores são indicados à direita de cada curva de crescimento e as barras de erro são o D.P. (B) ganetespib inibe STAT-5 fosforilação e expressão Cdk1 em xenoenxertos de tumores em ratinhos SCID. ratinhos SCID que possuem tumores MV4-11 (n = 4 ratinhos /grupo) foram tratados com veículo ou ganetespib a 25 mg /kg ou 150 mg /kg a pontos de tempo indicados entre 6 h e 144 h (6 dias). Os tumores foram ressecados e os níveis de p-STAT5, Cdk1, Hsp70 e GAPDH foram determinadas por western blot.

Para determinar se estas respostas tumorais correlacionada com a modulação do alvo

in vivo

, ratinhos adicionais que carregam xenoenxertos de MV4-11 foram tratados com uma dose única de veículo sozinho ou ganetespib em 25 ou 150 mg /kg. Os tumores foram colhidos entre 6 e 144 horas depois e análise farmacocinética foi realizada através da análise dos níveis de fosfo-STAT5, Cdk1 e Hsp70 (Fig. 6B) de expressão. De acordo com o

in vivo

dados de crescimento do tumor, foram observados efeitos dose-dependentes sobre a duração da inibição alvo dentro dos tumores. A 150 mg /kg de dose única ganetespib reprimido activação de STAT5 e suprimiu a expressão de Cdk1 durante mais de três dias, consistente com a sua eficácia na administração de uma dose por semana. A 25 mg /kg, potente inibição da actividade de STAT5 foi alcançado dentro de 6 horas, como foi a perda de Cdk1 às 24 horas após a administração ganetespib. De nota, actividade STAT5 recuperado nestes tumores por 24 horas, enquanto que a expressão Cdk1 permaneceram suprimidos através de, pelo menos, 48 ​​horas, mesmo com esta dose baixa (Fig. 6B). Embora a recuperação relativamente rápida activação de STAT5 deveria ter permitido o tumor para reiniciar o crescimento, a supressão mais durável dos reguladores do ciclo celular parece ter mantido o crescimento dos tumores presos até que a próxima dose de droga. Estes resultados fornecem fortes evidências de que a perda de sinais de crescimento celular e divisão celular orquestradas por conta ganetespib para a atividade antitumoral potente da droga neste modelo de coordenadas.

Discussão

Persistent JAK /STAT activação é oncogênico e característica de muitas doenças malignas humanas e, assim, oferece um ponto atraente de intervenção para a terapêutica molecularmente direcionados. Neste estudo, mostra-se que tem actividade anti-tumoral ganetespib profunda em uma matriz de JAK /STAT-cancros impulsionado e, mais importante, pode revogar a sinalização aberrante através de vários mecanismos. Ganetespib alvo eficazmente a montante do regulador de JAK2, incluindo a JAK2 constitutivamente activa

mutante V617F, para a degradação de uma gama de tumores hematológicos e sólidos tipos com subsequente perda prolongada da STAT3 e STAT5 de sinalização. Os resultados não só sublinhar o papel patogênico da sinalização STAT na tumorigênese, mas apoiar o potencial utilidade terapêutica de ganetespib para uma variedade de cancros humanos. A este respeito, a inibição sustentada do eixo de sinalização JAK2 /STAT obtidos por ganetespib foi mais eficaz do que a observada com o P6 inibidor da pan-JAK, e ganetespib foi uniformemente mais potente do que a ansamicina baseado Hsp90 inibidor de 17-AAG em nossos ensaios.

enquanto JAK2 mutação é um meio comum para estimular a actividade oncogénica STAT, perturbações em outras redes de sinalização, tais como aquelas mediadas pelo EGFR, IL-6 /IL-6R ou FLT3, pode também contribuir para a sinalização em STAT activada células cancerosas [2], [43]. Os nossos resultados mostram que a inibição de Hsp90 perturba eficazmente estes, bem como, com ganetespib potencialmente degradar EGFR e bloqueia tanto a IL-6 e mediada por FLT3 activação das proteínas STAT. Assim, enquanto ganetespib impõe directamente os seus efeitos farmacológicos sobre Hsp90, as consequências a jusante implica claramente uma gama substancial de proteínas de cliente e vias bioquímicas. Deste modo, a inibição por Hsp90 ganetespib pode ser visto como uma modalidade de multi-nodais, em vez de uma abordagem terapêutica específica do alvo, tal como a engendrada por uma JAK2 ou outro inibidor de cinase (Figura 7).

exerce Ganetespib efeitos antitumorais potentes através de perturbação de múltiplas cascatas de sinalização, incluindo o eixo de sinalização JAK /STAT e mediadores ciclo celular. (A) A via de JAK /STAT é um mecanismo de sinalização principal de uma grande variedade de citoquinas e factores de crescimento. Hiperactivação desta via, por meio de ligandos de receptor activado tirosina quinases (EGFR ou FLT3), receptor de citocina mediada por activação de JAK2, ou activação de mutações, tais como JAK2

V617F, está muitas vezes associada com a oncogénese. Regulação do ciclo celular envolve uma série de processos altamente coordenados e essenciais, incluindo o controle de ponto de verificação e detecção /reparação de danos genéticos, crítica para a progressão correto e divisão celular. (B) A inactivação de Hsp90 por resultados ganetespib na degradação mediada por proteassoma dos componentes de sinalização a montante (indicadas a cinzento) crítico para STAT, e MAPK de activação AKT, resultando assim na inibição do crescimento. Além disso, a infra-regulação concomitante de genes reguladores do ciclo celular chave induzidas por ganetespib (como mostrado na Tabela 1) resulta na paragem do ciclo celular em G

1 e G

2 /M fases do ciclo celular, e subsequente perda de fase S.

Em mais apoio deste, enquanto ambos ganetespib e P6 alterar um conjunto comum de metas JAK /STAT, único tratamento ganetespib exerceu efeitos concomitantes sobre o mecanismo de regulação do ciclo celular. Nos dados de células leucêmicas apresentados, a exposição a ganetespib resultou em L

1 e G

2 /M detenção, em parte através da degradação de Cdk1 e acumulação atípico de ciclinas A1 e B1. Além disso, a fase S foi revogada. Além de genes associados com a replicação do DNA e do ciclo celular, vários componentes do centrossoma e fuso foram afectados ao nível transcricional pela ganetespib, de acordo com descobertas anteriores de que estes componentes são sintetizados na fase S e que a Hsp90 é essencial para a montagem do centrossoma [44], [45]. É importante ressaltar que esta era uma resposta geral em todas as células estudadas, como observamos efeitos combinatórios semelhantes na inibição JAK /STAT com perda de atividade da quinase dependente da ciclina na AML, da mama, do estroma gastrointestinal, do pâncreas e próstata tipos de tumores.

Ganetespib também mostrou potente

in vivo

atividade. Em ratos com estabelecida MV4-11 (STAT5-driven) xenoenxertos, a administração semanal de ganetespib crescimento tumoral significativamente inibido de um modo dependente da dose. Além disso, uma dose diária de ganetespib também foi altamente eficaz e resultou na regressão do tumor significativo durante a administração do fármaco. Neste modelo, o crescimento do tumor reaparece cerca de uma semana após o tratamento com drogas foi parada (para a dose alta, 1 x /semana coorte). Importante, a nossa análise farmacodinâmica demonstrou que estas respostas tumorais correlacionada com o grau e duração da STAT5 e Cdk1 perda de proteína induzida por os regimes de dosagem diferentes. A ligação apertada de STAT5 sub-regulação com a inibição do crescimento do tumor seis horas após a administração do fármaco em qualquer das doses indica a resposta rápida desta via de sinalização para a administração da droga. Na dose de 150 mg /kg, STAT5 de sinalização, mas não a expressão Cdk1, devolvido por seis dias. A perda sustentada de Cdk1 e outras proteínas do ciclo celular, presumivelmente, mantém a paragem do ciclo celular e impede o crescimento de re-ocorrem entre as doses no calendário semanal, mesmo na presença da actividade de STAT5 re-emergente. Do mesmo modo, a expressão Cdk1 foi suprimida mais longo em comparação com STAT5 na dose de 25 mg /kg, e é provável para explicar a potente actividade de ganetespib no mais frequente 5 × /semana regime. Estes dados sugerem fortemente que a administração de ambos os ganetespib programação foi suficiente para abolir a ambos os sinais de sobrevivência e de crescimento de células a longo o suficiente para impedir o crescimento do tumor. Porque ganetespib presumivelmente conduz à perda de ainda mais proteínas do cliente, a sua actividade antitumoral potente provavelmente reflecte o seu efeito combinado sobre estas proteínas alvo adicionais também.

Num sistema que imita de forma mais precisa a patologia da doença leucémica, o eficácia de ganetespib também foi avaliada num modelo de doença disseminada usando HEL92.1.7 células. Ganetespib efetivamente aumento da sobrevivência neste modelo ortotópico, mais do que duplicando o tempo médio de sobrevivência dos ratos. sobrevivência prolongada foi associada com a carga tumoral drasticamente reduzida na medula óssea, como evidenciado por uma diminuição significativa da infiltração de células leucémicas humanas e reduzida metástases coluna vertebral. Colectivamente, estes dados são consistentes com um efeito direto da ganetespib sobre o crescimento de células leucémicas

in vivo

e demonstrar o potencial utilidade terapêutica deste composto para JAK2

malignidades-driven V617F.

A relação causal entre a actividade constitutiva de JAK2 e neoplasia resultou no desenvolvimento de uma variedade de inibidores potentes e selectivos de pequenas moléculas JAK2 [46].