Abstract
TMPRSS2
/
ERG
rearranjo,
PTEN
deleção do gene, e receptor de andrógeno (
AR) amplificação do gene têm sido observadas em vários estágios do câncer de próstata humano. Nossa hipótese é que usando esses marcadores como um painel combinado permitiria uma melhor diferenciação entre baixo risco e câncer de próstata de alto risco. Foram analisadas 110 amostras de próstata primário de câncer, 70 amostras de tumores metastáticos de 11 pacientes, e 27 tecidos de xenoenxerto derivados de 22 pacientes com câncer de próstata avançado com hibridização fluorescente in situ (FISH) análise com sondas destinadas à
TMPRSS2
/
ERG
,
PTEN
, e
AR
gene loci. foi avaliada heterogeneidade das aberrações detectadas. padrões genéticos também foram correlacionados com níveis de transcrição. Entre as amostras com dados completos disponíveis, o painel FISH de três marcador detectado anomalias cromossômicas em 53% dos cancros da próstata primário e 87% dos metastático (Met) ou (CRPC) tumores resistente à castração. O número de marcadores com resultado FISH anormal teve uma distribuição diferente entre os dois grupos (
P Art 0,001). Ao nível do paciente, Met /tumores CRPC são 4,5 vezes mais propensos a mostrar anormalidades do que pacientes com câncer primário (
P Art 0,05). Heterogeneidade entre os tumores Met /CRPC é principalmente inter-paciente. heterogeneidade intra-paciente é principalmente devido a diferenças entre o tumor de próstata primário e as metástases, enquanto vários sites metastáticos mostraram anormalidades consistentes. variabilidade intra-tumor é mais proeminente com o
AR
número de cópias em tumores primários.
AR
número de cópias correlacionados bem com o
expressão AR
mRNA (rho = 0,52,
P Art 0,001). Especialmente entre os
TMPRSS2: tumores CRPC fusão positivo ERG
,
AR
mRNA e
ERG
níveis de mRNA estão fortemente correlacionados (rho = 0,64,
P
0,001). No geral, o painel FISH de três marcador pode representar uma ferramenta útil para a estratificação de risco de pacientes com câncer de próstata
Citation:. Qu X, Randhawa G, Friedman C, Kurland BF, Glaskova L, Coleman I, et al. (2013) Um painel de peixe de três Marcador detecta mais aberrações genéticas de
AR
,
PTEN
e
TMPRSS2 /ERG
em cancros resistente à castração ou metastático de próstata do que na Primária Os tumores de próstata. PLoS ONE 8 (9): e74671. doi: 10.1371 /journal.pone.0074671
editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América
Recebido: 03 de maio de 2013; Aceito: 04 de agosto de 2013; Publicação: 30 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Qu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por PNW CA097186 SPORE P50, P50CA138293, P01CA085859, PC093372 e PC093509 concedido pelo Instituto Nacional do Câncer. A geração de xenotransplante e coleta de amostra clínica foi apoiada por Richard M. Lucas Foundation. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a descoberta da recorrente
rearranjos ETS
genéticas em cânceres de próstata levou a estudos que avaliam o papel funcional da
genes ETS
na patogênese da doença e, como diagnóstico e prognóstico biomarcadores. O tipo mais comum de
ETS
rearranjo, a fusão de andrógeno-regulamentado
TMPRSS2
com o oncogênico
ERG
é detectada em aproximadamente metade dos tumores de próstata, mas nenhuma das glândulas benignas [1]. No entanto, os estudos que avaliam o significado prognóstico da
TMPRSS2
: resultados inconsistentes
ERG
fusão têm rendido [2] – [5]. fatores genéticos adicionais são susceptíveis de trabalhar em conjunto com a fusão durante a progressão do câncer. Estudos recentes têm mostrado que as aberrações genéticas não são apenas comum no cancro da próstata, mas também interagir uns com os outros através de vias relacionadas, contribuindo assim para a progressão para doença invasiva.
TMPRSS2
é regulada por androgénios, e o receptor de androgénio (AR) é frequentemente amplificada em doentes tratados com a terapia de privação de androgénio [6], [7].
PTEN
eliminação, outra aberração comum em cancro da próstata, foi correlacionada com a expressão de jusante p-Akt e associada a mortalidade específica do cancro [8], [9].
ETS
rearranjos do gene foram mostrados para cooperar com
PTEN
eliminação e impacto prognóstico do câncer de próstata [10], [11]. Crosstalk entre PI3K e AR vias de sinalização foi recentemente sugerido como um mecanismo para o desenvolvimento de câncer de próstata resistente à castração (CRPC) [12], [13].
PTEN
eliminação foi mostrado para suprimir a expressão do gene andrógeno responsivo, modulando
AR
atividade do fator de transcrição. Além disso,
PTEN
e
AR
expressão foi mostrado para correlacionar inversamente no câncer de próstata [14].
Uma questão crítica preocupações clínicas que identificam características de cancros da próstata diagnosticados recentemente que distinguirá agressiva de comportamento indolente. A heterogeneidade molecular dos cancros da próstata sugere que os biomarcadores individuais podem não ser suficientes, e que múltiplos marcadores genéticos podem melhor associar com o resultado. No presente estudo, utilizou-se uma fluorescência de três marcador de hibridização in situ (FISH) do painel para detectar
TMPRSS2
e /ou
ERG
rearranjos,
AR
amplificação do gene, e
PTEN
eliminação em ambas as amostras de câncer de próstata primário e CRPC e comparou a prevalência, concordância e interação destes três marcadores. Com a referência de dados de expressão de ARNm correspondentes gerados a partir de amostras de tumor a partir do mesmo paciente também foi demonstrado como os resultados de FISH correlacionadas com alterações na expressão de genes. Intra e inter-paciente heterogeneidade do tumor também foi analisada.
Materiais e Métodos
Aquisição Amostra
Ética Declaração.
O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Boards (IRB) do Fred Hutchinson Cancer Research Center e da Universidade de Washington Medical Center. IRB dispensou a necessidade de consentimento por escrito para este estudo porque foram utilizados apenas materiais de-identificados, que eram do banco de tecidos da Universidade de Washington Urology.
As amostras dos pacientes.
De-identificado arquivados sem tratamento amostras de cancro da próstata primário (n = 110) foram obtidos a partir da Universidade de Washington (UW) e Virgínia Mason Hospital, em Seattle. Um total de 83 tumores primários gerados dados analisáveis por pelo menos um marcador FISH no painel, incluindo 69 pacientes com
TMPRSS2
/
ERG
dados PEIXE, 65 pacientes com
AR
dados de peixes e 42 pacientes com
PTEN
dados peixe. amostras de tumores metastáticos (n = 70) foram coletadas em UW de autópsias realizadas dentro de 2 a 4 horas após a morte de 11 pacientes CRPC no âmbito do programa autópsia rápida [15]. Os tumores foram obtidos a partir de vários locais de órgãos, imediatamente congelados e armazenados a -80 ° C. Todos os tecidos foram seccionados para a H E de coloração e, para verificação da histologia, revisado por um patologista. análise de FISH foi focado em áreas cancerosas. Um total de 67 tumores rendeu dados analisáveis por pelo menos um marcador FISH no painel, incluindo 56 tumores de 10 pacientes com
TMPRSS2
/
ERG
dados PEIXE, 65 tumores de 11 pacientes com
dados PEIXES AR
, e 62 tumores de 11 pacientes com
PTEN
dados peixe.
xenoenxertos de cancro da próstata.
xenoenxertos de cancro da próstata (linhas LuCaP) foram originalmente isolado a partir de vários órgãos de pacientes avançada [16]. análises de peixe foram bem sucedidos em 27 linhas LuCaP, representando 22 pacientes, um dos quais também estava entre os pacientes metastáticos descritos acima. Estes incluíram 27 tumores de 22 pacientes com
TMPRSS2
/
ERG
dados PEIXE, 26 tumores de 21 pacientes com
AR
dados de peixe, e 25 tumores de 21 pacientes com
PTEN
dados peixe. Juntos, combinando tumores de doentes metastáticos e xenotransplantes derivados de pacientes com câncer de próstata em estágio avançado, o estudo avaliou um total de 94 tumores de 32 pacientes.
Fluorescent Hibridização In Situ (FISH)
TMPRSS2
/
ERG
rearranjo foi avaliada com o nosso ensaio FISH 4 cores romance como descrito separadamente [17]. “
TMPRSS2: ERG
” refere-se à presença de fusão dos dois genes. “
TMPRSS2
/
ERG
rearranjo” refere-se a vários subtipos de rearranjo de um ou de ambos os genes, tal como especificado na seção Resultados. análise FISH de
amplificação AR
gene foi realizada utilizando a sonda SpectrumOrange AR (Xq12) combinado com o SpectrumGreen rotulados ChrX centrômero (Xp11.1-Q11.1) sonda CEP X como o controle (Abbott Molecular, IL) .
PTEN
deleção do gene foi examinada usando o
PTEN
/CEP10 dual-cores da sonda FISH set (Abbott Molecular, IL), incluindo o SpectrumOrange marcado PTEN (10q23) sonda eo SpectrumGreen marcado Chr10 centrômero (10p11.1-10q11.1) CEP 10 sonda.
Para cada amostra, uma gama de 25 a 50 núcleos interfásicos intactos e não sobrepostos foram enumeradas manualmente utilizando uma lente de imersão em 100 × óleo em um Zeiss Z1 microscópio (Carl Zeiss Canada Ltd, Canadá).
AR
ganho e
PTEN
deleção foram analisados pela contagem do número de sinal do gene e o sinal de centrómero correspondente por núcleo.
AR
ganho foi definida como um número de cópias médio de
AR
por núcleos igual ou superior a 2. Verdadeiro
AR
amplificação do gene foi definida como a razão entre o número total de
AR
sinais dividido pelo número total de centrômero do cromossomo X igual ou superior a 2. as amostras com
PTEN
eliminação heterozigotos tinha uma relação entre o número total de
PTEN
sinais dividido pelo número total de sinais de CEP10 igual ou inferior a 0,75. A relação de
PTEN
/CEP10 igual ou inferior a 0,2 é considerado homozigoto
PTEN
eliminação. Por paciente de nível de análises de pacientes CRPC com vários tumores, por expressão de um dado marcador foi considerada anormal se a aberração foi visto em pelo menos um tumor.
expressão de matriz
Agilent 44 K humano inteiro do genoma microarrays expressão de oligonucleótidos (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) foram usadas ao perfil xenoenxertos de cancro da próstata e metástases de tecido macio resistente à castração humano de próstata. Recém xenotransplantes congelados foram processados para extrair RNA total que foi amplificado uma rodada; as amostras do paciente foram microdissecadas de captura laser e amplificado duas rondas, como descrito anteriormente [18]. rotulagem sonda e hibridação foi realizada após a Agilent sugeriu protocolos e imagens de matriz fluorescentes foram recolhidos usando o DNA Agilent G2565BA scanner de microarray. Agilent software Feature Extraction foi usada para grade, extrair e normalizar os dados. rácios de expressão foram log
2 escalados e dizer-centrado em cada gene.
Análise Estatística
Para complementar as comparações de tumor primário arquivados com uma coorte separada de pacientes com doença metastática, nós examinou a heterogeneidade intra-paciente de
AR
e
PTEN Compra de pacientes com doença metastática, levantando a hipótese de que os tumores de próstata podem diferir lesões metastáticas contemporâneos. Lineares modelos mistos com efeitos aleatórios de pacientes foram montados em tumores não-próstata, e um intervalo de confiança de 95%, calculado para um assunto específico [19] previsões de expressão média. Se tumor de próstata status de número de cópias de um sujeito caiu fora do intervalo de confiança, ele seria interpretado como evidência de potenciais diferenças entre o status do número de cópias de lesões primários e metastáticos. Um modelo linear de efeitos mistos eo% ICC9 SAS macro foi usado para calcular coeficientes de correlação intraclasse e seus intervalos de confiança [20]. regressão logística e equações de estimação generalizadas (GEE) foram utilizados para comparar as taxas de anormalidade para amostras primários e metastáticos, o controle de fonte de tecido (rápida autópsia vs xenotransplante) e dentro de ambulatório correlação para análise ao nível de tumor. Heterogeneidade de variância intratumoral para diferentes locais do tumor também foi explorada através de modelos lineares mistos. inferência estatística adicional incluído coeficientes de correlação de Spearman e o teste de Wilcoxon para comparar as distribuições de o número de marcadores com expressão anormal.
P
-Valores foram em frente e verso; análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SAS /STAT, versão 9.3 (SAS Institute, Inc., Cary, NC).
Resultados
A prevalência de aberrações genéticas detectadas pelo Painel de peixe de três marcador em localizada primários e metastáticos ou Castração resistente (Met /CRPC) pacientes
O painel de peixe de três marcador (Figura 1) utilizado em nosso estudo detectou aberrações genéticas frequentes no câncer de próstata, e estes foram significativamente mais comuns no Met /tumores CRPC do que em tumores primários não tratados (Figura 2A).
(a) Ilustração da técnica FISH 4 cores para a detecção de rearranjos de
TMPRSS2
e /ou
ERG
. sondas FISH alvo 5 ‘-
TMPRSS2
(vermelho, sonda I), 3′ –
TMPRSS2
(verde, sonda II), 5 ‘-
ERG
(ouro, sonda III), e 3 ‘-
ERG
(azul, sonda IV) simultaneamente, detectar vários padrões de sinais, incluindo normal (i), fusão única (ii), de fusão dupla /complexo (iii), rearranjo alternativo sem fusion (iv), e aumento do número de cópias (CNI), sem rearranjos. imagens peixe capturado de (i) e (ii) são mostrados no painel esquerdo do 1C; de imagens (iii) – (v) são mostrados abaixo da ilustração correspondente. (B) sondas de peixe utilizado para detectar
amplificação AR
gene e
PTEN
deleção do gene
AR
amplificação do gene foi analisada utilizando sondas de segmentação
AR
(laranja ) e do centrômero do cromossomo X (verde, CEPX).
PTEN
deleção do gene foi detectada usando sondas de segmentação
PTEN
(laranja) e do centrômero cromossomo 10 (verde, CEP10). (C) imagens PEIXES interfase Representante. Superior esquerdo, normal,
TMPRSS2
e
ERG
padrão de sinal demonstrando dois conjuntos de quatro sondas por núcleo; Inferior esquerdo,
TMPRSS2
:
ERG
fusão como sinais vermelhos e azuis justapostos simultâneos com falta ou separação dos sinais verde e ouro intersticiais; Top médio, normal,
AR
padrão de sinal demonstrando uma laranja
AR
e um sinal de X verde por núcleo; Inferior central,
amplificação AR
gene apresentando mais de duas vezes o número de
AR sinais
do que os sinais CEPX; Superior direito, normal,
PTEN
padrão de sinal demonstrando 2 laranja
PTEN Comprar e 2 sinais CEP10 verdes por núcleo; canto inferior direito,
PTEN
eliminação mostrando nenhum ou 1 cópia do
PTEN
sinais por núcleo.
Um paciente com múltiplos tumores foi considerado anormal por um determinado marcador se a aberração foi visto em pelo menos um tumor. gráficos (A) Pie demonstrar a percentagem de indivíduos sem (branco), um (cinza claro), dois (cinza escuro), e três anormalidades (preto) detectado pelo painel entre o câncer de próstata primário (n = 34) eo metastático ou cancro da próstata resistentes à castração (Met /CRPC) coorte (n = 30), respectivamente. Entre os pacientes primários, um asterisco foi usada para destacar o ganho de AR moderada (média
AR
por núcleo = 1,5, mas 2). (BD) Prevalência de cada subtipo de anomalias detectadas pelo marcador de peixes individuais entre os pacientes primários (um tumor por paciente, n = 34), tumores MET /CRPC (n = 81) e MET /CRPC pacientes /xenotransplantes (n = 30 ), respectivamente.
TMPRSS2
/
ERG
anormalidades são categorizados como fusão única (azul claro), fusão dupla /complexo (azul escuro), rearranjos alternativos (verde), e copiar aumento número (CNI) do alelos do gene normal (amarelo).
AR
FISH detectou moderada
AR
ganho (azul claro), ganho de X (azul escuro) e
AR
amplificação do gene (verde).
PTEN
anormalidades PEIXES inclui heterozigotos (azul claro) e homozigoto (verde)
PTEN
exclusões. (E) A co-ocorrência de alterações nos três marcadores mostrados como gráficos 3D esfera para a coorte de câncer primário (esquerda) e coorte Met /CRPC (direita).
TMPRSS2
/
ERG
,
PTEN
, e
AR
resultados são apresentados em X, Y e Z., respectivamente. O valor apresentado em cada um dos eixos gamas de 0 a 1. “0” indica a normal para um determinado marcador. Para
TMPRSS2
/
ERG
, “0.5” indica rearranjos, incluindo a fusão e rearranjos alternativas; “1” significa CNI dos alelos normais sem qualquer rearranjo. Para
PTEN
FISH, tanto eliminações heterozigotos e homozigotos são apresentados como “1”. Para
AR
FISH, “1” indica
AR
copiar ganho número ( = 2,0). Os pacientes com a mesma combinação de anormalidades estão agrupadas em uma esfera, o volume da qual é proporcional à percentagem de pacientes na coorte respectiva. Somente os pacientes com dados disponíveis de todos os três marcadores estão incluídos. A esfera verde na trama primária paciente denota moderada
AR
ganho ( 1,5, mas 2,0).
Dos 34 tumores primários em que todos os 3 marcadores pôde ser avaliado , 16 (47%) não apresentaram aberrações envolvendo
AR
,
PTEN
ou
TMPRSS2 /ERG
; 11 (32%) eram anormais por um único marcador. tumores seis dos pacientes (18%) foram detectados anormal por dois marcadores, incluindo 3 com
TMPRSS2
:
ERG
fusão e homozigoto
PTEN
exclusão, 2 com
TMPRSS2
:
ERG
fusão e heterozigotos
PTEN
exclusão, e 1 com não-fusão rearranjo alternativo juntamente com heterozigotos
PTEN
eliminação. Nenhum dos pacientes eram anormais por todos os três marcadores porque não havia detectável
AR
anomalia quando o corte para
AR
ganho foi definido como = 2,0
AR
por núcleo, uma determinada arbitrariamente corte rigoroso. Dois pacientes seriam classificados como leve
AR
ganho se estiver usando
AR
copiar número por núcleos
= 1,5 como o valor de corte, estabelecida como média + 3 DP baseado em resultados de enumeração de células epiteliais da próstata normais de 18 amostras diferentes.
de pacientes /xenoenxertos com resultados peixe de todos os três marcadores, 4 (13%) não apresentaram valores de marcação anormais a 30 MET /CRPC. Cinco (17%) foram mostrados como anormal por apenas um marcador; 13 (43%) foram detectados como anormais por dois marcadores, incluindo 8 (27%) como anormal pela
TMPRSS2
/
ERG
e
AR
FISH e 5 ( 17%) por
TMPRSS2
/
ERG
e
PTEN
. Oito pacientes (27%) foram anormais por todos os três testes.
Nós, mais subtipos avaliadas de aberrações genéticas detectadas por cada marcador na /coorte CRPC Met (Figura 2 B-D). Rearranjos de
TMPRSS2
e /ou
ERG
foram detectadas em 14 pacientes (47%), incluindo 5 (17%) com o típico único
TMPRSS2
:
ERG
fusão, 5 (17%) com dual ou complexo
TMPRSS2
:
ERG
de fusão, e 4 (13%) com rearranjos alternativas sem fusão. aumento do número de cópias (CNI) do cromossomo 21 foi observada em 10 pacientes (33%) usando os botões
TMPRSS2
/
ERG
sondas de peixe.
AR
ganho de uma ou mais lesões foi observada em 18 pacientes (60%), incluindo 6 (20%) que resultaram de ganho do cromossoma X e 12 (40%) com a verdadeira
AR
amplificação do gene (
AR
/X = 2). Supressão de
PTEN
foi detectada em 15 pacientes (50%), incluindo 5 com deleção homozigótica.
Um teste de Wilcoxon sugeriu que o /coorte CRPC Met (n = 30) tinham geralmente mais alterações detectadas por FISH do que o grupo de cânceres primários (N = 34) (W = 1287,
P Art 0,001).
AR
ganho, incluindo o ganho moderado (W = 1334,
P Art 0,001), e a combinação de
TMPRSS2 /ERG
e
PTEN
alterações (W = 1181,
P
= 0,005) também foram significativamente mais comuns nos tumores MET /CRPC.
a investigação de marcadores individuais refletiu tendências únicas de mudanças de cada anomalia genética durante o progressão do câncer de próstata. Cerca de 80% do MET /amostras CRPC foram identificados por
TMPRSS2
/
ERG
FISH como anormal, em comparação com 48% em amostras primárias, ea diferença foi estatisticamente significativa (Tabela 1; Figura 2B ) (
P
= 0,03). Esta diferença parece ser devida à aberração CNI em vez de o
TMPRSS2: ERG
si fusão; a percentagem de doentes com fusão ou rearranjo alternativo permanece semelhante, mas a percentagem de pacientes com fusão dupla, em oposição a fusão único é claramente maior no Met /categoria CRPC que no grupo do tumor primário (Figura 2B). Examinando tumores individuais (ajuste para intrapessoal correlação e xenoenxerto status), as chances de um Met /tumor CRPC exibindo uma anormalidade foi de 4,5 vezes maior do que as probabilidades de um tumor primário (
P
= 0,05). Enquanto quase todos os pacientes com câncer primário mostrou normal,
AR
status, mais de 70% do MET /pacientes CRPC demonstraram vários graus de
AR
número de cópias do gene ganho (Tabela 1; Figura 2C). PTEN FISH mostrou aumento heterozigotos
PTEN
exclusão e homozigoto
PTEN
exclusão no Met /CRPC em comparação com pacientes primárias (Tabela 1; Figura 2D) (
P =
0,07 na nível de tumor,
P = 0,003
no nível do paciente). É de notar, para as avaliações de nível paciente havia uma hierarquia, por isso, se uma lesão era heterozigoto eo outro homozigoto, o nível paciente foi considerado homozigoto.
Os dados de todo o painel em diferentes indivíduos mostrou que pacientes com câncer de próstata com
PTEN
eliminação também tendem a apresentar resultados anormais em
TMPRSS2
/
ERG
FISH (Figura 2E). Entre os 34 pacientes com câncer primário com dados disponíveis de todos os três marcadores, 6 dos 8 indivíduos com
PTEN
eliminação (75%) também mostrou um anormal
TMPRSS2
/
ERG
resultado FISH (Figura 2E). Entre os 30 pacientes MET /CRPC com dados disponíveis a partir, quer com ambos, ou todos os três marcadores, 13 dos 14 indivíduos com
PTEN
eliminação (93%) também apresentaram anormalidades no
TMPRSS2
/
ERG
análise FISH. Em pacientes /CRPC Met, anormal
TMPRSS2 /ERG
resultados de peixe também foram mais prevalentes entre os pacientes que demonstram ganho de
AR
, e vice-versa (Figura 2E). Dezesseis dos 17 pacientes (94%) com
AR
ganho mostrou
TMPRSS2
/
ERG
anormalidades. Dezesseis dos 24 pacientes (67%) com
TMPRSS2
/
ERG
anormalidades também demonstrou
ganho de AR
. Resultados FISH detalhadas sobre todas as amostras metastáticos de cada paciente CRPC estão resumidos na Tabela 2. Os resultados das amostras de xenotransplante estão listadas na Tabela 3.
intra e Comparação Inter-paciente de Genomic aberrações e heterogeneidade na Castração resistente prostate cancer
o FISH 3 marcador análises rendeu duas observações de pacientes com câncer de próstata metastático: (1) dentro do mesmo paciente, aberrações em tumores metastáticos foram, em geral consistente em tumores; (2) vários tumores da próstata primários de pacientes CRPC exibiu um perfil distinto de metástases distantes. analisa FISH para
AR
número de cópias (Figura 3A) e
relação de PTEN
/CEP10 (Figura 3B) apresentaram resultados discordantes entre os tumores primários e lesões metastáticas. Em particular, para o paciente # 9, o tumor de próstata mostrou
AR
copiar aumento número, enquanto que as lesões metastáticas todos tiveram média
AR Art 2. Para o paciente # 11, os tumores de próstata primários mostrou normal,
AR
resultados, enquanto as lesões metastáticas mostrou
AR
ganho. Da mesma forma, a lesão da próstata em pacientes # 3 demonstraram heterozigotos
PTEN
exclusão quando todas as lesões metastáticas tinha normal de
PTEN
. Em contraste, para o paciente # 11, as lesões metastáticas mostrou homozigoto
PTEN
eliminação enquanto a lesão de próstata não o fez. Em outros casos (# 8 e # 10), tumores de próstata não diferiu de lesões metastáticas na anormal
vs
sinais marcadores normais, mas estavam fora do intervalo de confiança de 95% para a média de assuntos específicos com base em linear modelos mistos apto para lesões metastáticas.
resultado FISH de cada tumor é representado por um personagem plotagem (cinza por lesões metastáticas, vermelho para próstata) com lesões múltiplas no mesmo paciente, ao mesmo coordenada X. intervalos de confiança para os valores do número de cópia média de assuntos específicos são mostrados em preto. Limiares para sinais anormais são marcados como linhas tracejadas horizontais em cada parcela. (A) Número médio de
AR
por núcleo. (B) Média
PTEN
/
CEP10
ratio.
Em geral, mais de 75% da variabilidade foi entre-paciente, com relativamente pouco intra- variação paciente: o coeficiente de correlação intraclasse foi de 0,76 (IC 95% 0,54-0,90) para a média
AR
e 0,82 (IC 95% 0,62-0,92) para o
PTEN
/CEP10. No entanto, quando a totalidade do painel foi avaliada para cada indivíduo, 4 (# 3, # 5, # 9 e # 11) dos 8 pacientes (50%) com os dados disponíveis a partir de todos os três marcadores nos tumores da próstata locais mostraram diferentes perfis entre os tumores primários e metastáticos. Comparação adicional utilizando dados de marcadores individuais mostraram diferentes níveis de desvio do primário a partir de tumores metastáticos. Dos 8 pacientes com disponível
TMPRSS2
/
ERG
resultados pescar em tumores no local da próstata, 3 (37,5%) tiveram resultados na próstata diferentes daqueles em outros sítios metastáticos (Tabela 2). Curiosamente, o paciente # 5 demonstrou fusão dupla deleção entre os sítios metastáticos, enquanto apenas fusão deleção única foi detectado em um tumor da próstata, do mesmo paciente. Nas análises de
AR
, 3 (# 3, # 9 e # 11) dos 10 pacientes (30%) apresentaram resultados na próstata, que desviou de tumores extra-prostática. A avaliação da
PTEN
eliminação mostrou que 2 (# 3 e # 11) de 9 pacientes (22,2%) demonstraram diferente
PTEN
resultados PEIXES entre o local de próstata e tumores metastáticos. Em paciente # 11, todos metástases extra-prostática mostrou
PTEN
eliminação, enquanto que os tumores de próstata mostraram normais
Resultados da PTEN
homozigotos. Da mesma forma, os dados do painel para xenotransplantes também indicou que as linhas de xenotransplante derivados do mesmo paciente tendem a mostrar a mesma anormalidade genômica (Tabela 3). As avaliações
Intra-tumorais de Genomic heterogeneidade na metastáticos Pacientes
a seguir, procurou avaliar a variação no alterações genômicas detectadas pelo painel de FISH em células individuais compreendendo um tumor primário ou metastático. Encontramos variação intratumoral substancial no
AR
copiar o número de tumores no local de próstata. modelos lineares previu
AR
número de cópias a nível celular por tipo de tumor, com efeitos aleatórios de pacientes. Tabela estimativas 4 shows para o número de
AR
por célula, e para as estimativas dos parâmetros de covariância que mostram como variação dentro do tumor e erro de medição diferentes entre os tipos de tumores. tumores no local da próstata tinha a mais alta estima intrapessoal
AR
desvio padrão (1,43
AR
por célula). Vários tumores da próstata e metástases em linfonodos teve algumas contagens anormalmente elevadas que podem ter contribuído para a estimativa. Para o
PTEN /CEP10
razão, as estimativas de covariância também foram encontrados para ser heterogênea por tipo de tumor (χ
2
6 = 20, p = 0,003), mas dentro no paciente de próstata
PTEN /Tablet CEP10 heterogeneidade intratumoral não foi diferente do de metástase (χ
2
1 = 0,7, p = 0,40). Tabela 4 sugere que as diferenças de heterogeneidade à base de tecido foram devido à baixa variação dentro do paciente nas lesões peritoniais e supra-renais. Estes efeitos podem ser confundidos com os efeitos do paciente, uma vez que alguns pacientes tiveram lesões adrenais ou peritoneal. Por um teste de razão de verossimilhança, modelos estatísticos com estimativas de variáveis independentes separadas para cada tipo de tumor ajustar os dados melhor do que um modelo que não fez distinção entre tumores (χ
2
6 = 412,
P 0,001), e um modelo que distingue entre o tecido da próstata e outras lesões (χ
2
5 = 332,
P
. 0,001)
Correlação de Genomic Alterações e expressão gênica em Castração resistente Prostate Cancer
a fim de investigar a relação funcional de aberrações genéticas detectadas por nosso painel, nós correlacionados nossos achados peixe com dados de expressão gênica de 91 combinando /amostras CRPC Met, incluindo 65 tumores de pacientes e 26 xenoenxertos (Tabela S1).
em primeiro lugar, em comparação
AR
número de cópias, determinado por FISH, com o
AR
transcrição abundância, determinada por cDNA microarray , a partir da mesma amostra de tumor. Observou-se uma ampla gama de
expressão AR
em tumores MET /CRPC (Figura 4A). O número médio de
AR
por núcleo eo nível de relação
AR
mRNA foram positivamente correlacionados com rho = 0,52 (
P Art 0,001) (Figura 4A). Quando normalizada com a mediana
AR
nível de todos os tumores com tanto a expressão do mRNA
AR
dados FISH e mRNA expressão (n = 88), as amostras com
AR
ganho (n = 48), incluindo o ganho de X (n = 17) e
AR
amplificação (n = 31), expressa
AR
ARNm de 2,5 ± 0,3 vezes (média ± SE) do que a maior mediano, enquanto os tumores sem ganho de
AR
(n = 40) tiveram
AR
nível de mRNA de 0,7 ± 0,2 vezes em comparação com a mediana (W = 1106,
P
0,001). Quando os tumores com
AR
ganho foram subdivididos em grupos de ganho de X (n = 17) vs
AR
amplificação do gene (n = 31), os nossos dados mostraram que
AR
mRNA foi expressa em um nível semelhante entre os dois (W = 361,
P =
0,24).
(a) Gráfico de dispersão demonstra a correlação entre os peixes e expressão de dados de
AR
(n = 88). O eixo X indica o número médio de
AR sinais
por núcleos. O eixo Y indica a AR
nível do mRNA detectado na matriz expressão relativa à mediana. Preto círculos abertos representam amostras com uma média de menos de 2
AR
por núcleos. quadrados azuis indicam amostras com o ganho de número de cópias de
AR
devido ao ganho de X. triângulos negros representam amostras com
amplificação do gene AR
. (B) Gráfico de dispersão demonstra o efeito de
TMRPSS2
:
ERG
fusão e
expressão AR
sobre a abundância de
ERG
transcrição (n = 80 ). X e Y-axis denota abundância relativa de mRNA
AR
e
ERG
em comparação com a mediana, respectivamente. círculos abertos e praças cheios representam os tumores sem e com
TMPRSS2
:.
ERG
fusão, respectivamente
Em seguida, avaliaram o efeito da
TMPRSS2