Abstract

Fundo

Para esclarecer as mutações genéticas associadas com neoplasias intraductais papilar mucinoso (IPMN) e tumores pancreáticos relacionados com IPMN, realizamos análises relacionadas ao câncer perfil genético utilizando suco pancreático pura e ressecado tecidos pancreáticos.

Métodos

suco pancreático Pure foi recolhido de 152 pacientes [nove com um pâncreas normal, 22 com pancreatite crônica (PC), 39 com adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), e 82 com IPMN] e tecidos ressecados do pâncreas foram coletados de 48 pacientes (seis IPMNs e 42 PDACs ). O DNA extraído foi amplificado por reação em cadeia da polimerase multiplex (PCR) segmentação 46 genes relacionados com o cancro contendo 739 hotspots de mutação. As mutações foram analisados ​​usando um sequenciador de DNA à base de semicondutores.

Resultados

Entre os 46 genes relacionados com o cancro,

KRAS Comprar e

Gnas

mutações eram mais frequentemente detectado em ambos os casos PDAC e IPMN. Em suco pancreático pura,

Gnas

mutações foram detectadas em 7,7% dos casos PDAC e 41,5% dos casos IPMN (

p Art 0,001 vs. outros). Todos os casos PDAC com

Gnas

mutações (n = 3) foram acompanhados por IPMN. A análise multivariada revelou que

Gnas

mutações em casos IPMN foram associados com os principais ductos pancreáticos dilatada (MPD,

p

= 0,016), enquanto não foram observadas associações estatisticamente independentes com variáveis ​​clínicas para

KRAS

mutações. Nos tecidos pancreáticos ressecados,

Gnas

mutações foram detectados em 50% dos casos PDAC concomitante com IPMN, 33,3% dos casos PDAC derivados de IPMN, e 66,7% dos casos IPMN, enquanto nenhum

GNAS

mutações foram detectadas em casos de PDAC sem IPMN.

Conclusões

O

GNAS

mutação foi encontrada especificamente nos casos com IPMN e especulou-se que alguns PDACs pode ser influenciada pela IPMN concomitante mas separadamente-localizado no seu mecanismo patogénico. Além disso, o

GNAS

mutação foi significativamente associada com dilatação MPD em casos IPMN, sugerindo seu papel na hipersecreção de muco

Citation:. Takano S, Fukasawa M, Maekawa S, Kadokura M, Miura M , Shindo H, et al. (2014) Sequenciamento profundo de genes relacionados a câncer revelaram

Gnas

mutações para ser associado com intraductais papilar mucinoso Neoplasias e seu principal pâncreas Duct dilatação. PLoS ONE 9 (6): e98718. doi: 10.1371 /journal.pone.0098718

editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemanha |

Recebido: 31 de janeiro, 2014; Aceito: 02 de maio de 2014; Publicação: 04 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Takano et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (25860527, https://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/) e por doações da Fundação para o Avanço da Ciência Internacional (https://www.fais.or.jp/grant/fy25/01_file/2013_01members.pdf). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

intraductal neoplasia mucinoso papilar (IPMN) é um tumor pancreática exócrina caracterizada pela dilatação cística dos principais e /ou pancreáticas ramo de condutas; estas condutas são revestidas com um epitélio atípico produtoras de mucina que muitas vezes prolifera de uma forma papilar [1] – [3]. IPMN está associado a um espectro de doenças que vão desde adenoma para o adenocarcinoma ductal pancreático invasiva (PDAC). PDAC pode ser derivado de IPMN ou concomitantemente pode desenvolver-se em outras regiões de um pâncreas em que IPMN desenvolveu. As duas formas relacionadas-IPMN de PDAC são considerados diferentes entidades de doença devido aos seus diferentes aproximações para a IPMN no pâncreas. No entanto, o prognóstico destas formas relacionadas-IPMN de PDAC é muitas vezes melhor do que a de PDAC comum, se o diagnóstico precoce é feito [4], [5]. Em contraste, as características genéticas dessas duas formas relacionadas com IPMN de PDAC e as razões para os seus prognósticos diferentes não são totalmente compreendidos.

PDAC surge como resultado do acúmulo de mutações genéticas e epigenéticas que conferem uma seletiva vantagem de células cancerosas [6], [7]. Mutações no

KRAS

,

CDKN2A

,

TP53

, e

SMAD4

têm sido relatados em casos de PDAC usando métodos convencionais, tais como sequenciação directa [ ,,,0],8]. Recentemente, a análise de todo o exome usando a próxima geração de sequenciamento revelou também alterações de alta frequência nesses poucos genes [6], [7], [9].

Em contraste, as mutações oncogênicas somáticas no nucleotídeo guanina proteína de ligação, alfa-estimulante (

GNAS

) -encoding proteína G, foram recentemente identificados em 41-66% dos casos IPMN [10] – [12].

Gnas

mutações também foram identificadas em diversos tumores do sistema endócrino [13], alguns adenomas hipofisários [14], e na síndrome de McCune-Albright [15]. Estas mutações surgem muito cedo no desenvolvimento natural do IPMN [10] e são altamente específicos para IPMN [11], [12], [16]. Com exceção de uma pequena percentagem de pancreáticas neoplasias intra-epiteliais (PanINs),

Gnas

mutações raramente foram detectados na maioria dos casos de PDAC ou outras neoplasias císticas [11], [12], [16]. No entanto, não se sabe como a apresentação clínica da IPMN pode ser influenciada pela

GNAS

mutação. Além disso, também é desconhecido se PDACs relacionadas com IPMN estão associados com

Gnas

mutações

A detecção dessas mutações no suco pancreático [17] -. [21] ou em amostras obtidas por via endoscópica ultra-som aspirativa por agulha fina (EUS-FNA) [22] auxilia no diagnóstico da doença em estágio inicial. No entanto, apenas alguns genes comumente mutados podem ser analisados ​​em amostras pequenas, devido às limitações na tecnologia de sequenciamento convencional. Para aliviar essas limitações, à base de semicondutores da próxima geração seqüenciamento foi recentemente desenvolvido e permitiu a sequenciação rápida, profunda e rentável de uma ampla gama de DNA a partir de amostras pequenas clinicamente obtidos [23].

neste estudo, a sequenciação à base de semicondutores foi empregado para conduzir a análise de mutação genética relacionada ao câncer de neoplasias pancreáticas utilizando pequenas amostras de tecido. Usando suco pancreático pura, investigamos o perfil mutacional das neoplasias pancreáticas e da associação desse perfil com as variáveis ​​clínicas. Além disso, usando tecidos ressecados, foram comparadas as diferenças no perfil mutacional dos dois tipos de PDACs que foram relacionados com IPMN (PDAC derivado de IPMN e PDAC concomitante com IPMN).

Materiais e Métodos

pacientes e amostras

Os sucos pancreáticos puros e informações clínicas associadas foram obtidos de 152 casos [CP (pancreatite crônica), n = 22; PDAC, n = 39; IPMN, n = 82; pâncreas normal, n = 9] que foram tratados no Hospital Universitário Yamanashi 2000-2012 (Tabela 1). exames pancreáticas aprofundados foram realizados em todos os casos. drenagem nasopancreatic endoscópica (ENPD) foi realizada durante a colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (CPRE) para obter o suco pancreático para o teste citológico. O suco pancreático puro foi obtido imediatamente e armazenado a -80 ° até à sua utilização. Nos casos de doença biliar e um pâncreas normal, o ENPD foi realizada para evitar pós-ERCP pancreatite, e os sucos pancreáticos recolhidos foram classificados como normais casos pancreáticas na análise. tecidos ressecados foram obtidos no mesmo hospital 2006-2012 a partir de casos com IPMN (n = 6) e PDAC (n = 42), como mostra a Tabela 2. Das amostras de tecido PDAC, 21 foram macrodissected espécimes congelados e 21 foram microdissectados espécimes embebidos em parafina e fixado em formalina (FFPE), ao passo que seis das amostras IPMN eram espécimes congelados. O diagnóstico e classificação de IPMN foram baseadas nas diretrizes de consenso internacional para a gestão dos IPMN e neoplasias císticas mucinoso do pâncreas que foram estabelecidos em 2006 [1]. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário de Yamanashi revisão humana. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.

DNA extração

DNA dos tecidos ressecados foi extraído utilizando o Kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, Valencia, CA, EUA ) para as amostras congeladas e Kit QIAamp DNA FFPE (Qiagen) para as amostras FFPE. ADN a partir do suco pancreático puro foi extraído utilizando o Kit Mini sangue DNeasy (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Em média, 1,4 ug e 0,3 ug de DNA foram extraídos dos espécimes congelados e amostras FFPE, respectivamente, e cerca de 3-4 ug de DNA foram extraídos a partir de 400 mL de suco pancreático puro.

Preparação de bibliotecas de amplicon

O Painel Ion AmpliSeq cancro (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) foi utilizado para gerar bibliotecas alvo amplicon, como descrito anteriormente [23]. Resumidamente, 10 ng de DNA foi amplificado por PCR utilizando pré-misturados Piscinas Ion AmpliSeq cancro de iniciadores contendo 190 pares de iniciadores e a AmpliSeq HiFi Master Mix (Ion AmpliSeq Biblioteca Kit, Life Technologies). Os 190 produtos de amplificação foram tratados com multiplexados FUPA Reagente (Life Technologies) para a digestão parcial das sequências de iniciadores e a fosforilação. Os fragmentos amplificados foram então ligado a adaptadores de o ião de código de barras Xpress Adaptadores 1-16 Kit (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Após a ligação, os fragmentos amplificados foram submetidos a nick-translation e amplificação por PCR da biblioteca adicional para completar a ligação entre os adaptadores e fragmentos amplificados. O Kit DNA Bioanalyzer Alta Sensibilidade (Agilent, Santa Clara, CA, EUA) foi utilizado para visualizar o tamanho e alcance e para determinar as concentrações de biblioteca.

Emulsão PCR e sequenciamento

bibliotecas diversificadas códigos de barras foram amplificadas por PCR em emulsão sobre as partículas de iões Esfera (ISPs) utilizando o One touch Ion 200 Kit Molde V2 (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Após os ISPs molde foram recuperados a partir da emulsão, os ISPs molde positivos foram biotinilados durante o processo de emulsão e enriquecido com Dynabeads grânulos MYONE Estreptavidina C1 (Life Technologies). A sequenciação foi realizada num Sequenciador de Personal Genome Máquina (Life Technologies) utilizando o kit de sequenciação de iões PGM 200 (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Uma vez que as células tumorais mutada-DNA pode existir populações como menores nas amostras por causa das pequenas proporções entre o resto dos tecidos tumorais e /ou a contaminação com células não tumorais, análise de sequenciação profunda foi realizada neste estudo para detectar mutações a uma taxa a partir de 1%. Torrent Software Suite v2.2 (Life Technologies) foi usada para analisar a lê código de barras, para alinhar lê para o genoma de referência, e para executar métricas, incluindo a eficiência chip carga e contagens totais de leitura e qualidade. Variantes foram identificados com software v2.0 Variant chamador (Life Technologies). O valor da base segmentada qualidade foi fixado em 21, o que é igual a 0,79% da probabilidade de erro de detecção de mutações. O limiar do rácio de detecção de mutação foi fixado em ≥1%. O Painel Ion AmpliSeq Câncer (Life Technologies), que foi utilizado na amplificação da biblioteca, tem como alvo 739 locais de mutação de 46 genes relacionados com o cancro que foram relatados no Catálogo de Somatic Mutações em Câncer (COSMIC; mutações de ponto de acesso) [24]; estas mutações de ponto de acesso detectados foram analisados ​​em combinação com as variáveis ​​clínicas. Os 46 genes relacionados com o cancro estão listados no eixo horizontal do gráfico na Figura 1 e Figura 2.

O eixo y da figura representa o percentual de casos com mutações em cada gene. A. Nenhuma mutação foi detectada no suco pancreático puro a partir de casos com tecido de pâncreas normal. B.

GNAS

mutação foi detectada em um caso (4,5%) com CP (pancreatite crônica) e uma pequena lesão cística. C.

GNAS

e

KRAS

mutações foram detectadas em 7,7% (três de 39 casos) e 20,5% (oito de 39 casos), respectivamente, que tinha adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). O

GNAS

mutação foi detectada em todos os casos com neoplasia mucinoso papilar intraductal (IPMN, n = 3). D.

GNAS

e

KRAS

mutações foram detectadas em 41,5% (34 de 82 casos) e 39,0% (32 de 82 casos), respectivamente, com IPMN.

o eixo Y da Figura representa a percentagem de casos com mutações em cada gene. A. No tecido ressecado, o

KRAS

mutação foi detectada em 84,6% (22 de 26 casos) dos casos de pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) que não tiveram neoplasia mucinoso papilar intraductal (IPMN). B.

KRAS Comprar e

Gnas

mutações foram detectadas em 80% (oito dos 10 casos) e 50% (cinco de 10 casos), respectivamente, dos casos PDAC concomitante com IPMN. C.

KRAS Comprar e

Gnas

mutações foram detectadas em 66,7% (quatro de 6 casos) e 33,3% (dois de 6 casos), respectivamente, dos casos PDAC derivados de IPMN. D.

KRAS Comprar e

Gnas

mutações foram detectados em 100% (n = 6) e 66,7% (quatro de 6 casos), respectivamente, dos casos IPMN não-invasivos.

a análise estatística

as associações entre as mutações genéticas e variáveis ​​clínicas foram avaliadas por meio do teste exato de Fisher ou o χ

2 de teste e variáveis ​​com um

p

valor 0,2 foram incluídos na análise multivariada. Os dados contínuos, tais como tamanho do cisto e presença de nódulos murais foram classificados de acordo com receiver operating análise característica (ROC) (dados não mostrados). Para a análise multivariada, foi utilizado um modelo de regressão logística múltipla, e um

p

-valor. 0,05 foi considerado significativo

Resultados

análise da sequência profunda de 46 genes relacionados ao câncer em suco pancreático puros

as mutações relacionadas ao câncer nos 46 genes foram analisados ​​no suco pancreático pura dos 152 casos, com uma média de 2.114 leituras por amplicon. As variantes extraídos com a lista de genes alterados, frequência variante, leia profundidade e IDs COSMIC a partir dos dados deep-seqüenciamento de cada caso correspondente ter sido anexado como informação de apoio a este documento como arquivos de Microsoft Excel formatados (File S1-S4) . Nenhuma mutação foi detectada no suco pancreático dos nove casos com tecido de pâncreas normal (Fig. 1A). Um

GNAS

mutação foi detectado em um caso com CP que foi acompanhada por um pequeno cisto (5 mM); isto pode ter sido representante de uma lesão IPMN início (Fig. 1B e a Fig. 3A).

KRAS

,

GNAS

, e

TP53

mutações foram detectadas em ambos os casos PDAC e IPMN (Fig. 1).

KRAS

mutações foram detectadas em 20,5% dos casos PDAC (

p

= 0,0074 vs. normal e CP) e 39,0% dos casos IPMN (

p Art 0,001 vs . normal e CP).

Gnas

mutações foram detectadas em 7,7% dos casos PDAC e 41,5% dos casos IPMN (

p Art 0,001 vs. outros). IPMN estava presente em todos os casos PDAC que continham a

GNAS

mutação (n = 3).

A. Um caso de CP com um pequeno cisto (seta azul) que tinha o

GNAS

mutação (Fig. 1B) no suco pancreático pura na colangiopancreatografia por ressonância magnética (CPRM). B-D. PDAC com

Gnas

mutações distintas concomitante IPMN. Nos casos em 30 (b) e 31 (c), MRCP imagem revelou estenose na MPD na cabeça do pâncreas perto do PDAC (seta amarela). O IPMN foi localizado no corpo do pâncreas (seta azul). A tomografia computadorizada no caso de 28 (D) revelou que a PDAC foi localizado no corpo do pâncreas (cabeça de seta amarela), ao passo que o IPMN foi localizado na cabeça do pâncreas (seta azul). Uma lista de casos B-D é mostrada na Tabela 4.

Desde a nossa análise demonstrou que o

GNAS

mutação foi específico para IPMN, as associações entre as variáveis ​​clínicas selecionadas e

GNAS

status aos 82 IPMN casos foram analisados ​​estatisticamente para esclarecer a relevância clínica ea importância do

GNAS

mutação no suco pancreático. A análise univariada revelou uma associação entre o

GNAS

mutação e do tipo IPMN (principal tipo conduta) e da quantidade de dilatação (≥6 mm) na MPD (Tabela 3). Na análise multivariada, apenas dilatação MPD foi independentemente associada com

GNAS

mutação (Tabela 3). Por outro lado, o

KRAS

mutação foi associado com a localização (corpo pâncreas e da cauda, ​​

P

= 0,044) e uma quantidade de dilatação (≥6 mm) no MPD (

p

= 0,01) pela análise univariada; no entanto, não houve associação clínica independente com esta mutação após a análise multivariada (dados não mostrados).

análise da sequência profunda de 46 genes relacionados com o cancro em ressecado tecidos tumorais de pâncreas

Depois que encontramos o

GNAS

mutação em casos que tiveram PDAC concomitante com IPMN, bem como em casos que tiveram apenas IPMN a partir da análise do suco pancreático, o próximo sequenciado amostras de tecido para determinar os possíveis padrões de mutações em IPMN , PDAC derivado do IPMN, PDAC que estava com concomitante IPMN e PDAC sozinho. A sequenciação foi realizada em 48 tumores pancreáticos ressecados (PDAC sem IPMN, n = 26; PDAC concomitante com IPMN, n = 10; PDAC derivado de IPMN, n = 6; IPMN não invasiva, n = 6; a Fig. 2). O número médio de leituras por amplicon foi 2.582. As variantes extraídos com a lista de genes alterados, frequência variante, leia profundidade e correspondente ID COSMIC a partir dos dados deep-seqüenciamento de cada caso foram anexadas a este documento como informação de apoio em arquivos de Microsoft Excel formatados (File S5-S8) .

KRAS

mutações foram detectadas em 84,6% dos casos PDAC sem IPMN, 80% dos casos PDAC que eram concomitante com IPMN, 66,7% dos casos PDAC que foram derivadas a partir de IPMN, e 100% dos casos IPMN.

Gnas

mutações foram detectados em 50% dos casos PDAC que foram concomitante com IPMN (

p

= 0,0007 vs. PDAC sem IPMN), 33,3% dos casos PDAC que foram derivadas de IPMN (

p

= 0,03 vs. PDAC sem IPMN), e 66,7% dos casos IPMN (

p

= 0,0004 vs. PDAC sem IPMN), enquanto nenhum

Gnas

mutações foram detectadas em casos de PDAC sem IPMN.

Gnas

mutações foram, assim, apenas detectada em IPMN e PDAC IPMN-associado (concomitante PDAC com IPMN e PDAC derivado de IPMN). Uma lista detalhada das mutações do gene é fornecida na Tabela 4. Assim, foram observadas características semelhantes em mutações genéticas para estas três categorias da doença (Tabela 4).

imagens radiológicas de PDAC concomitante com IPMN

As imagens radiológicas para os casos de 28, 30 e 31 na Tabela 4 são apresentados na Figura 3 como imagens representativas que demonstraram PDAC concomitante com IPMN. Nestes casos, o

gnas

mutações foram detectadas em PDAC e a concomitante IPMN foi localizado numa região separada pancreático. Por exemplo, estenose do ducto pancreático, como resultado da PDAC eram evidentes na cabeça do pâncreas, no caso de 30 (Fig. 3B) e a caixa 31 (Fig. 3C), enquanto que o IPMN era visível no corpo do pâncreas. No caso 28 (Fig. 3D), uma lesão de massa de baixa densidade de PDAC e as múltiplas lesões císticas de IPMN foram aparentemente separados no pâncreas.

Associação dos padrões de mutação entre suco pancreático e ressecado tecidos tumorais pancreáticas

Alguns genes tais como

ATM

,

BRAF

,

IDH1

, e

RB1 ​​

foram detectados apenas no suco pancreático (Fig . 1), mas não nos tecidos ressecados (Fig. 2). Em contrapartida, a percentagem de casos com mutações de

KRAS

ou

GNAS

foi maior nos tecidos ressecados do que no suco pancreático (Fig. 1, 2). A fim de investigar se os perfis mutacionais do suco pancreático representada correctamente os dos tumores pancreáticos, os perfis mutacionais entre o suco pancreático e tecidos tumorais pancreáticas ressecados foram comparados em 21 casos em que ambas as amostras estavam disponíveis. Entre os

KRAS

(n = 17) e

GNAS

(n = 7) mutações encontradas nos 21 tecidos tumorais pancreáticas ressecados, o

KRAS Comprar e

GNAS

mutações foram detectados no suco pancreático em 41,2% (17/07) e 71.4% (07/05) dos casos, respectivamente (Tabela 5), ​​indicando que a sensibilidade do suco pancreático para a detecção de mutações dos tumores pancreáticos pode atingir cerca de 50%. Se olharmos para as especificidades entre o

KRAS

(n = 11) e

GNAS

(n = 4) mutações encontradas nos tecidos pancreáticos ressecados de the15 casos PDAC,

KRAS

e

gnas

mutações foram detectados no suco pancreático de 27,3% (11/03) e 50% (04/02) dos casos, respectivamente. Entre os

KRAS

(n = 6) e

GNAS

(n = 3) mutações encontradas nos tecidos pancreáticos ressecados dos seis casos IPMN,

KRAS Comprar e

gnas

mutações foram detectados no suco pancreático em 66,7% (06/04) e 100% (3/3) dos casos, respectivamente. A percentagem de casos com mutações foram maiores em IPMN que em PDAC; Portanto, nós pensamos que as mutações detectadas no suco pancreático pode ser alternativa para medir as mutações em pessoas a partir de tecidos, pelo menos nos casos com IPMN, de acordo com esta análise. Como resultado, foi analisada a associação entre as variáveis ​​clínicas e

Status GNAS

com o suco pancreático nos casos com IPMN.

Discussão

Neste estudo , sequenciamento de DNA baseados em semicondutores foi realizada em amostras clinicamente obtidos de suco pancreático pura e tecido pancreático ressecado, com foco em IPMN e tumores IPMN-associados. A análise do suco pancreático revelou que o

GNAS

mutação era específico para IPMN e que o

GNAS

mutação foi especificamente associados com IPMN com dilatação MPD. A análise dos tecidos ressecados no que se refere ao

GNAS

estado mutacional demonstrou que PDAC IPMN-associados (ambos com concomitante PDAC IPMN e PDAC derivado de IPMN) partilhada mutacionais características semelhantes e que estas características são diferentes dos de ordinário PDAC.

Entre os 46 genes relacionados com o cancro seqüenciados em nosso estudo,

KRAS Comprar e

Gnas

mutações foram detectados com alta freqüência, enquanto outros, incluindo

TP53

,

SMAD4

, e

CDKN2A

mutações foram detectadas em apenas alguns casos como mencionado anteriormente. Desde tem havido vários relatos anteriores que analisaram

KRAS

mutações no PDAC ou IPMN, focamos nossa análise sobre o

GNAS

mutação. Recentes avanços em sequenciamento de última geração têm revelado alterações genéticas detalhadas em casos com PDAC [6], [7], [9] e IPMN [12], [16]. Jones et al [7], Biankin et al [9], e Wang et al [6] conduzida análise de sequenciação de todo o exome de PDAC pâncreas e revelou que

KRAS

,

TP53

,

SMAD4,

e

CDKN2A

eram os genes mais frequentemente alteradas, conforme relatado anteriormente [8]. Destes quatro genes, mutações para o

TP53

,

SMAD4

, e

CDKN2A

genes foram detectados em apenas alguns casos com PDAC em nosso estudo. Embora deleção homozigótica foi reportado no

SMAD4

e

CDKN2A

genes em estudos anteriores [8], a identificação precisa da deleção homozigótica em amostras clinicas tem sido difícil por causa da contaminação de ADN a partir de células normais . No entanto, detecção com sucesso de deleção homozigótica do ADN foi possível para estes genes na análise de linhagens celulares do cancro do pâncreas puros (dados não mostrados). Porque só a 73

TP53

mutações hot spot de entre mais de 1000 locais de mutação listados no banco de dados COSMIC foram alvo das Piscinas Ion AmpliSeq Cancer Primer [24] e, além disso, foram utilizadas amostras de baixo tumor-celularidade,

TP53

alterações podem ter sido subestimada em nosso estudo. Estas alterações genéticas podem ter sido detectados por outros métodos, tais como imuno-histoquímica ou de cópia em número análise de variação. Parecia estranho que algumas mutações como

ATM, BRAF, IDH1

, e

RB1 ​​

só foram detectados no suco pancreático e não nos espécimes ressecados. No entanto, uma vez que todos os tecidos utilizados para a análise foi de apenas uma parte de todo o tumor, era possível que o suco pancreático pode ser mais representativo de mutações a partir de todo o tumor em certas condições.

Wu et al [16 ] e Furukawa et al [12] realizaram a sequenciação de todo o exome de IPMN a partir de tecidos ressecados e descobriu que

KRAS

,

GNAS

, e

RNF43

eram genes frequentemente mutados. Neste estudo, o

KRAS Comprar e

Gnas

mutações foram também detectados no suco pancreático e ressecado tecidos dos casos com IPMN.

Gnas

mutações têm sido relatados em várias neoplasias no sistema endócrino [13], [24], alguns adenomas hipofisários [14], e na síndrome de McCune-Albright [15].

Gnas

mutações também têm sido previamente relatada em IPMN [11], [12] casos que tiveram cistos pancreáticos [10], [12], [16] com uma taxa de detecção de 41-66% a partir de tecidos ressecados , fluidos de quisto pancreáticos, ou o suco pancreático estimulada-secretina recolhida a partir do duodeno. Mais recentemente, foi relatado que as neoplasias papilares intraductais do ducto biliar [25], [26], do piloro adenoma da glândula do estômago e do duodeno [27], e de baixo grau neoplasmas mucinosos apendicular [28] se assemelhava IPMN histologicamente e que estes neoplasias apresentam uma frequência elevada de

Gnas

mutações.

GNAS

codifica o α-subunidade de uma proteína-G estimuladora (Gαs) e uma mutação em

GNAS

causa a activação constitutiva de adenilil-ciclase e um nível elevado de cAMP [29], [30 ]. Embora os papéis /funções do

gnas

mutações em IPMN PDAC ou não tenham sido elucidadas, estas mutações podem ser associadas com mais do que iniciação do tumor com a progressão do tumor porque a mutação foi também observada em tumores de baixo grau [ ,,,0],10], [12]. Em nosso estudo,

Gnas

mutações foram detectadas em 41,5% do suco pancreático pura e em 66,7% das amostras de tecidos ressecados de casos com IPMN; estas taxas de mutação eram quase iguais aos relatórios anteriores. Em contraste,

KRAS

mutações têm sido relatadas em tecidos ressecados de ambos IPMN e PDAC, com os respectivos intervalos de taxas de detecção de 48-81% [12], [16] e 78-100% [7], [ ,,,0],9], [12], o que indica que

KRAS

mutações pode ser associada com ambas as doenças; No entanto, a taxa de mutação foi um pouco mais elevada em PDAC. O

KRAS

taxas de detecção de mutação em nosso estudo foram equivalentes a esses estudos dos tecidos ressecados, tanto no IPMN e casos PDAC.

Gnas

mutações foram associadas com dilatação MPD em IPMN casos através da análise multivariada. Kanda et al relataram uma associação independente de

Gnas

mutações com o desenvolvimento de múltiplos cistos nos casos com cistos pancreáticos e Marco et al relatou que IPMN com um fenótipo intestinal tem sido sempre associado com

GNAS

mutações [10], [31]. Nossos dados confirmam a especificidade do

Gnas

mutações IPMN e sugeriu um papel funcional da

Gnas

mutações na formação de IPMN. Em particular, uma vez que o MPD dilatação sem obstrução na IPMN tem sido geralmente considerado como sendo o resultado da hipersecreção de muco,

gnas

mutações podem ter um papel na regulação positiva de hipersecreção de muco. Na verdade, tem sido relatado recentemente que a introdução do

GNAS

mutação em células cultivadas resulta na regulação positiva de genes de mucina, suportando nossa hipótese [32]. Um estudo recente relatando a alta frequência do

GNAS

mutação, especialmente no tipo intestinal IPMN que tem a produção de muco visível, apoiado nossos resultados, bem [31]. Mais estudos de uma possível relação causal entre a

Gnas

mutações e MPD dilatação são garantidos.

Foram observados os padrões de mutação similares de genes relacionados ao câncer entre a PDAC que era concomitante com IPMN eo PDAC derivado de IPMN neste estudo. Em estudos anteriores,

Gnas

mutações não foram detectados em PDAC comum com algumas excepções [12], [33]. Convencionalmente, estes tumores foram classificados em três grupos: ordinário PDAC, concomitante com PDAC IPMN e PDAC derivado de IPMN [4], [5]. Uma classificação de PDAC esquemática em termos da relação com IPMN é fornecida na Figura 4. Em PDAC comum, não IPMN é identificado no pâncreas (Fig. 4A). PDAC derivado de IPMN é um cancro invasivo, em que pode ser observada uma transição histológica de IPMN para PDAC (Fig. 4C) [4]. Por outro lado, PDAC concomitante com IPMN é um adenocarcinoma ductal que é considerada como sendo uma entidade diferente a partir da doença PDAC derivado de IPMN (Fig 4D.); as lesões PDAC são separadas e distintas das lesões IPMN concomitantes no pâncreas na imagiologia radiológica e exame histológico. Uma incidência anual de um desenvolvimento PDAC independente de 0,8-4,1% tem sido relatada em casos com IPMN durante o follow-up [5], [34] – [36]. Embora concomitante PDAC com IPMN podem desenvolver independentemente do IPMN, seu comportamento biológico se assemelha ao de PDAC derivado de IPMN porque seu resultado é mais favorável em comparação com os resultados de PDAC comum. Embora outro relatório estudando

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estado PDAC concomitante com IPMN não mostrou nenhuma mutação em seis concomitante PDAC com casos IPMN, a sua sensibilidade de detecção pode ter sido menor do que o esperado porque eles só detectado

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mutações no 1 de 6 IPMN casos [37]. A partir do padrão mutacional de

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observada neste estudo, nós especulamos que PDAC concomitante com IPMN e PDAC derivado de IPMN pode compartilhar alguns mecanismos moleculares semelhantes com a patogênese da PDAC.

A. O

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mutação foi detectada em PDAC comum, sem IPMN. B.

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mutações foram detectadas em IPMN. C.

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mutações foram detectadas em PDAC derivado de IPMN primário. D.

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mutações foram detectadas, não só em IPMN mas também em PDAC que se desenvolveu separadamente do IPMN.

Nossa pesquisa mostrou que o câncer relacionadas perfil genético por sequenciação à base de semicondutores é possível usando amostras clínicas pequenas. Por outro lado, a sensibilidade de detecção foi um pouco inferior na nossa análise, em parte, devido a uma profundidade de sequenciação insuficiente para cada gene para um grande número de genes alvo em uma única análise.