Abstract

Fundo

O tratamento de câncer de próstata metastático (PCA) com agentes únicos apenas demonstrou a eficácia modesta. Trabalhamos com a hipótese dupla inibição de diferentes caminhos em ACP resulta na inibição do tumor melhorada. As cinases da família Src (SFK) e crescimento factor-1 (IGF-1) de sinalização eixos semelhantes à insulina são anormalmente ativados em ambas as APC e metástases ósseas primárias e regular as funções distintas e sobrepostas em progressão CaP. Foram examinados os efeitos antitumorais da inibição combinada destas vias.

Materiais e Métodos

Src andIGF-1 receptor (IGF-1R) inibição foi conseguida

in vitro

por curto hairpin (sh) RNA e

in vitro

e

in vivo

por inibidores de pequenas moléculas (dasatinib e BMS-754807, contra SFK e IGF-1R Receptor /insulina (RI), respectivamente).

resultados

In vitro

, a inibição do IGF-1 afetados sinalização de sobrevivência e proliferação celular. bloqueio SFK sozinho teve um efeito modesto sobre a proliferação, mas aumentou significativamente o bloqueio de IGF-1R. Estes resultados correlacionados com uma inibição forte de IGF-1 induzida por fosforilação Akt1 dasatinib, ao passo que a fosforilação Akt2 foi SFK independente e somente inibida pela BMS-754807. Assim, a inibição completa de ambos os genes Akt, que não eram vistos por uma ou outra droga sozinho, é provável que um mecanismo importante para a sobrevivência diminuiu de células APC. Além disso, o dasatinib e BMS-754807 inibiu

in vivo

crescimento do xenoenxerto humano primário MDA CaP 133, com a inibição correspondente de Akt em tumores. Além disso, o crescimento tanto ortotópico e intratibial tumor de células PC-3 foram mais fortemente inibida pela dupla SFK e IGF-1R bloqueio /IR em relação ao sozinho cada via, com uma diminuição correspondente na marcadores de remodelação óssea.

Conclusões

dupla IGF-1R /IR e SFK inibição pode ser uma abordagem terapêutica racional na CaP, bloqueando processos tanto independentes e complementares essenciais para o crescimento do tumor

Citation:. Dayyani F, Parikh NU, Varkaris AS , Song JH, Moorthy S, Chatterji T, et al. (2012) Combinada Inibição de IGF-1R /IR e Src Familiares Quinases Aprimora antitumorais Efeitos no cancro da próstata, diminuindo ativado sobrevivência Pathways. PLoS ONE 7 (12): e51189. doi: 10.1371 /journal.pone.0051189

editor: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de julho de 2012; Aceito: 30 de outubro de 2012; Publicação: 26 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Dayyani et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. F.D. foi apoiada por Estados Unidos National Institutes of Health subvenção T32 CA009666; F.D., G.E.G., J.C.A., e C.J.L. foram apoiados por uma P50 CA140388-01; F.D., G.E.G., e C.J.L. foram também apoiou de uma subvenção pela Fundação do Câncer de Próstata. Este trabalho também foi apoiado pelo NIH através do Centro de Grant Apoio do cancro do MD Anderson, 5 P30 CA016672-35. S.N.M. foi apoiado por uma bolsa Cancer Research Program da próstata em UTMDACC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos. Eles declaram que J. C. e M. G. são empregados pela Bristol-Myers Squibb. Isto não altera a sua adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

cancro da próstata metastático (PCA) é responsável por um número estimado de 28.000 mortes em 2012 [1]. Em avançado, castração metastático resistente à PCA (CRPC), existem poucas opções de tratamento. Há apenas 3 aprovado pela FDA agentes quimioterápicos para CRPC: docetaxel e cabazitaxel [2], [3], os quais mostram apenas uma modesta vantagem de sobrevivência para homens com CRPC e, mais recentemente, o acetato de CYP17 inibidor de abiraterona, aprovado para uso após falha docetaxel (ClinicalTrials.gov Identificador: NCT00638690), melhorando a sobrevida global de 3,9 meses [4]. Para CRPC metastático minimamente sintomática, um estudo randomizado de fase 3 mostraram vantagem de sobrevivência com a vacina Sipuleucel-T [5] .Assim, enquanto agentes promissores estão a melhorar a sobrevida de pacientes APC, agentes terapêuticos adicionais são claramente necessárias para a doença de estágio avançado [6].

os recentes avanços na compreensão das vias de sinalização que regulam o crescimento de células CaP no osso levaram a numerosos ensaios clínicos com terapias direcionadas. Um dos alvos mais promissores em CaP são as cinases da família Src (SFKs), uma família de receptores não-tirosina-quinases de proteína, a expressão e as actividades específicas dos quais são aumentados em vários tipos de tumores humanos [7]. dados pré-clínicos em PCA mostraram que a inibição da proliferação SFKs diminui e, mais fortemente, invasão e migração de [8], [9]. Além disso, a actividade de Src é importante no microambiente, que afecta a função de osteoclastos. Assim, Src inibidores bloco, em interações parte, tumorais /microambiente que levam ao “ciclo vicioso” de metástase óssea [10]. Em estudos utilizando

in vivo

experimentos camundongo ortotópico, a inibição da SFKs diminuiu tanto o crescimento do tumor de próstata e desenvolvimento de metástases linfáticas, [11]. Com base, em parte, nestas descobertas e alguns resultados promissores a partir de um ensaio de fase 1/2 [12], o dasatinib, um pequeno inibidor multi-quinase com selectividade molécula forSFK /Abl [8], foi testado em combinação com docetaxel em uma fase aleatória 3 julgamento para pacientes com CRPC (ClinicalTrials.gov ID: NCT00744497).

as análises do estudo de fase 1/2 indicam inibição SFK mais docetaxel não produziu respostas clínicas significativas na maioria dos pacientes, mas foram extremamente promissora para um subconjunto de pacientes [13]. Assim, a identificação de vias de sinalização adicionais que contribuem para o crescimento metastático de CaP e podem aumentar os efeitos de inibição de Src é susceptível de produzir combinações de inibidores promissores que serão mais eficazes para o tratamento de CaP.

Uma tal via desregulada em PCA é mediada pelo receptor de factor de crescimento 1 semelhante à insulina (IGF-1R). IGF-1R está implicada na proliferação e sobrevivência de muitos tipos de tumores [14] e é sobre-expresso em CaP [15]. sinalização de IGF-1R foi associada a risco de CaP, e um dos seus ligandos, IGF-2, também é sobre-expresso em metástases CaP ósseas [16], em que promove a proliferação e sobrevivência de células de CaP [17], [18], [ ,,,0],19], [20], [21]. Estudos com anticorpos monoclonais para o IGF-1R foram implicados como este receptor importante na progressão CaP em sensível androgénio, bem como modelos de tumores resistentes ao [22]. Embora sinalização IGF-1R é mediada, em parte, pela via de Src, outras vias de sinalização a jusante de IGF-1R são Src independente e não afectados por inibição de Src [14]; estas vias adicionais foram recentemente demonstrado desempenhar um papel importante na sobrevivência celular CaP [23]. A activação de Src e IGF-1R também activa Akt, um efector a chave de Akt mTOR PI3K //, que é activado de modo aberrante na maioria dos tumores malignos, promover o crescimento celular, a proliferação, a sobrevivência e [24], [25] .No entanto, se esses inibidores são igualmente eficazes na inibição Akt1, 2 e 3 funções não é conhecido, e se combinando-produzido melhores resultados na inibição desta via de sobrevivência foi um objetivo deste trabalho. Aqui, foram examinados os efeitos individuais e combinados de dasatinib, um inibidor SFK, e BMS-754807, um inibidor de molécula pequena potente e reversível de IGF-1R [26] e o receptor de insulina (IR), com actividade contra vários tumores sólidos

in vitro, bem como em vários modelos de xenoenxerto [26]. Como inibidores de ter efeitos fora do alvo, também foi empregue knockdown molecular destas vias. Nós demonstramos que a inibição destas vias produz efeitos biológicos complementares

in vitro

e

In vivo

e que, na presença de IGF-1, a inibição de ambas as vias é necessária para inibir potentemente fosforilação de Akt e mediadores a jusante da sobrevivência da célula cancerosa.

Materiais e Métodos

culturas de células

PC-3 e LNCaP células foram obtidas a partir da American Type Culture Collection. Eles representam ambas as variantes adenosina e de pequenas células da ACP [27]. células PC3-LG [29] PC3-MM2 [28] e foram gentilmente cedidas pelo Dr. Isaías Fidler (The University of Texas MD Anderson Cancer Center). PC-3 de tipo selvagem e as células transfectantes estáveis ​​foram mantidas em DMEM meio F-12 (Hyclone), complementado com soro bovino fetal a 10% (FBS; Hyclone) e 1% de penicilina /estreptomicina (Gibco). as células do tipo selvagem e LNCaP transfectantes estáveis ​​foram mantidas em meio RPMI 1640 (Hyclone), complementado com 10% de FBS e 1% de penicilina /estreptomicina. BMS-754807 foi fornecido pela Bristol-Myers Squibb, e dasatinib foi gentilmente cedido pelo Dr. John C. Araujo (MD Anderson). autenticação celular e triagem mycoplasma foi realizada a cada seis meses, de acordo com as diretrizes institucionais.

transfectantes estáveis ​​

construções de RNA-GFP-puromicina pronto-a-transfecção hairpin curto (sh) contra humanos IGF1-R (# SR302344) e Src (# SR304574) foram adquiridos a OriGene Technologies. Um controlo negativo mexidos universal shRNA (# SR30004) foi fornecida pelo fabricante. As células foram transf ectadas usando Fugene 6 reagente (Roche) segundo as instruções do fabricante. Os clones estáveis ​​foram seleccionados com puromicina. knockdown alvo foi verificada 3-4 semanas após transfecção por Western blot, conforme descrito abaixo.

proliferação celular ensaio

Células (3 x 10

4per poço) foram cultivadas em 6 poços pratos para até 96 horas com e sem dasatinib (100 nM) ou BMS-754807 (0,5-5 mM). Para contagem de células em vários pontos de tempo, as células foram lavadas uma vez com PBS (Gibco), incubados com o reagente de dissociação TrypLE (Gibco), e contou-se utilizando um analisador automático de viabilidade celular (XR Vi-celular; Beckman Coulter). Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

coloração Anexina V

Coloração de células apoptóticas foi realizada utilizando um kit de detecção de anexina V-PE (BD Pharmingen) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram cultivadas durante 48 horas, seguido de coloração com anexina V-PE. As células foram analisadas num BD FACS Canto de fluxo FACSCalibur utilizando o software diva FACS (BD Biosciences).

Ciclo

celular

As células foram cultivadas durante 24 horas, colhidas e lavadas uma vez em PBS, em seguida, ressuspenderam-se em gelo-etanol frio a 70% e manteve-se a -20 ° C durante 1 hora. As células foram em seguida lavadas outra vez em PBS e tratou-se durante 45 minutos com ARNase isenta de ADNase (Invitrogen) a 37 ° C. O iodeto de propídio foi adicionado a uma concentração final de 1 ug /ml, e as células foram incubadas durante 20 minutos à temperatura ambiente. A análise foi realizada em um BD FACS Canto citômetro de fluxo, usando o software Diva FACS.

Animais

ratinhos nus /Ncr nu-nu suíços foram adquiridos a partir da área de produção animal do Departamento de Experimental radiação em Oncologia MD Anderson. Todos os ratos foram alojados e mantidos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos acordo com as diretrizes Animal Care Institucional e Comitê de Uso do MD Anderson. O Animal Care e Use Committee MD Anderson Institucional (IACUC) revisaram este estudo e, especificamente, aprovou-a.

tumores de xenoenxerto

enxertos subcutâneos de MDA CaP 133 (um xenoenxerto de um paciente de castração resistente derivado a partir de uma metástase óssea que expressa AR e PSA e cresce apenas em ratinhos e não em cultura de células) foram geradas como descrito anteriormente [30]. Em resumo, os fragmentos de tumores foram implantados subcutaneamente em ratinhos imunodeficientes combinados graves (SCID) com um tamanho inferior a 1 mm

3. Os tumores foram deixados crescer até atingirem o tamanho de 3 mm

3, e em seguida, os ratos (n = 4 para cada grupo) foram tratados diariamente com dasatinib e BMS-754807, sozinho e em combinação, durante 26 dias. Os tumores foram medidos duas vezes por semana, e o volume foi calculado utilizando a fórmula

V = W

2 × L /2

. No dia 26, os ratinhos foram sacrificados, os tumores foram colhidos, e lisados ​​de proteína foram preparadas como indicado abaixo para Western blots.

prostáticos ortotópico /injecções intratibial

intraprostática injecção de PC3 que expressam luciferase células -Lg foi feito como publicado anteriormente pelo nosso grupo [31]. Resumidamente, anestesiaram-se ratinhos Swiss 40 nu-nu /nu Ncr (8-12 semanas de idade) com 2% de isoflurano numa câmara de isoflurano em oxigénio e, em seguida, colocado numa posição supina. A incisão mediana foi feita na parte inferior do abdômen e a próstata foi exteriorizado como descrito por Park et al. [32]. Cinquenta microlitros de HBSS contendo PC3-LG (total, 5 × 10

5 células) foi ortotopicamente injectada tal como descrito anteriormente [31] para um lobo lateral da próstata. A ferida foi fechada com agrafos cirúrgicos de metal. Dez dias após a injecção de xenoenxerto, o enxerto do tumor foi determinada por

In vivo

bioluminescência de imagem (sistema IVISTM 100; Xenogen Co.) com os ratinhos sob anestesia com isoflurano a 2% inalação. Trinta e dois ratinhos que apresentam actividade de luciferase próximo do valor médio e foram seleccionados ao acaso, utilizando um programa Excel (Microsoft) em 4 grupos (n = 8 para cada grupo): controlo de veículo, BMS-754807 sozinha (12,5 mg /kg de corpo peso /dia), o dasatinib sozinha (12,5 mg /kg de peso corporal /dia), e uma combinação de BMS-754807 (6,25 mg /kg de peso corporal /dia) e dasatinib (12,5 mg /kg de peso corporal /dia). Estas concentrações foram escolhidos deliberadamente em níveis em que a atividade de agente único não era esperado. Todas as drogas foram administradas por sonda oral 6 dias /semana. Os ratinhos foram sacrificados 4 semanas após a injecção das células. Os tumores primários da próstata foram excisados ​​e pesados ​​

Intratibial injecção de células PC3-MM2 foi realizada como previamente descrito [28].; Resumidamente, os ratinhos nus foram anestesiados como acima, e de 2,5 × 10

5 células foram injectadas na tíbia como descrito [28]. Doze dias após a injecção, os ratinhos foram tratados com solução salina (n = 10) dasatinib (n = 9), BMS-754807 (n = 9), ou de ambos (n = 8), nas dosagens descritas acima. Quatro semanas após o início do tratamento, os ratinhos foram sacrificados. raios-X foram tiradas de todos os ratinhos, e a partir de 4 ratos em cada grupo, as tíbias foram colhidas e preparado, e a tomografia computadorizada foi realizada como descrito anteriormente [32], [33].

destruição óssea após intratibial injecção de células PC3-mM2 em ratinhos nus foi avaliado baseado no seguinte pontuação: 0 = alterações mínimas; 1 = lesões ósseas líticas, córtex intacto; 2 = destruição Cortex, não tecidos moles significativa inchaço; 3 = destruição Cortex, a participação significativa dos tecidos moles.

Immunoblotting

Immunoblotting foi realizada como descrito anteriormente [34]. Resumidamente, as células foram lisadas e clarificados, e as proteínas foram separadas por 8% de SDS-PAGE, seguido de transferência para membranas de polyvinylidenedifluoride (Millipore). As membranas foram incubadas com anticorpos contra Src, Yes, Fyn, Lyn, IGF-1R, Akt, ERK1 /2, e S6 (todos adquiridos a partir de Cell Signaling) e LC3 (Sigma), seguido de anticorpos secundários de rábano silvestre conjugado com peroxidase (Bio -Rad).

a imunoprecipitação

para determinar a fosforilação de Akt1 e especificamente 2, PC-3 de células foram privadas de soro até 48 horas e, em seguida, incubadas durante 2 horas com dasatinib (100 nm), BMS-754807 (5 uM), ou ambos, seguido de estimulação de 15 minutos com 50 ng /mL de rhIGF-1 (R D Systems). As células foram então colhidas, e 500 ug de proteína foi utilizado para imunoprecipitação, tal como descrito anteriormente [35]. As amostras foram incubadas com anticorpos específicos contra Akt1 ou Akt2 (Cell Signaling) durante a noite a 4 ° C. Após a imunoprecipitação, 50 uL de proteína Adicionou-se esferas de agarose, e as amostras foram incubadas novamente durante 2 horas a 4 ° C. As amostras foram em seguida centrifugadas a 5000 rpm durante 2 minutos. O sobrenadante foi descartado, e cada amostra foi lavada com 500 ul de tampão de lavagem do ensaio de quinase de imunocomplexo e centrifugada 3 vezes. Em seguida, 30 ul de SDS a tintura foi adicionada às proteínas precipitados, e as amostras foram testadas por Western blot e incubadas com fosfo-Akt (Cell Signaling) seguindo o protocolo descrito acima.

Estudos histológicos

H e e coloração TUNEL foram realizados em MDA CaP 133 tumores de xenoenxertos após o explante como descrito anteriormente [36], [37]. Em cada grupo, 5 campos de alta potência (HPF) diferentes foram examinados, o número de células positivas TUNEL foram contadas e foi calculada a média do número de células positivas TUNEL /HPF. Hoechst mancha foi utilizado para a coloração de núcleos de células.

ELISA

A determinação quantitativa de fosfatase alcalina de murino e N-telopéptido, em soro de ratinho foi realizada utilizando os respectivos kits de ELISA (ELISA ZST) de acordo com o fabricante do instruções. Todas as curvas padrão tinha um R2 de ≥0.990. Os controlos positivos para cada ensaio foram fornecidos pelo fabricante.

Estatísticas

Para comparações estatísticas de variáveis ​​contínuas, o Student

t

foi usado -teste, e por valores discretos, o teste do qui-quadrado foi utilizado; α 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

inibição IGF-1R afeta a proliferação celular e apoptose

Nós testamos o nosso raciocínio para a inibição combinada da Src e IGF-1R. vias de determinar os efeitos sobre o crescimento e apoptose, em seguida, a transdução de sinal, seguido por efeitos sobre o crescimento tumoral em vários modelos animais relevantes. As células foram cultivadas em FBS a 10%, suficiente para levar a activada de IGF-1R. Sob estas condições, a inibição de Src e IGF-1R pela combinação de dasatinib e BMS-754807 reduziu a proliferação celular em células PC-3 e LNCaP, como mostrado na Fig. 1A. Primeiro, confirmou expressão da SFKs Src, Yes, Fyn, Lyn e em todas as células CaP examinados (Fig. S1A). Para determinar se os inibidores afetado principalmente Src e IGF-1R, estáveis ​​knockdowns shRNA mediadas foram feitas para

SRC

e

IGF-1R

, respectivamente. A 90% knockdown das respectivas enzimas de sinalização foi alcançada (Fig S1B.). inibição SFK com dasatinib diminuição da proliferação de células PC-3, consistente com resultados anteriores [11]; knockdown de

IGF-1R

diminuição da proliferação de 96 horas mais de dasatinib fizeram (

P Art 0,05; S1C), ea combinação da inibição da SFK e

IGF-1R

diminuiu knockdown a proliferação (

P Art 0,05). Estes resultados foram confirmados por ensaio de MTS de uma cultura de 96 horas (dados não mostrados). A inibição da proliferação observada com BMS-754807 era mais pronunciada em ambas as linhas celulares do que com shIGF-1R, sugerindo que o fenótipo observado com BMS-754807 é provavelmente devido, em parte, à capacidade de BMS-754807 para inibir o receptor de insulina (IV) bem como [26] .Para analisar especificamente os efeitos de BMS-754807 em IGF-1 a estimulação do IGF-1R, determinou-se o efeito de doses crescentes do inibidor sobre a clivagem de PARP. Como mostrado na Figura S1D, a clivagem de PARP era dependente da dose. Também examinamos o tempo-dependência da inibição do crescimento. Na presença de BMS-754807, a cinética de crescimento foram inibida de uma forma dependente do tempo maneira em relação às células não tratadas (Figura S1E). Estes resultados são consistentes com BMS-754807 que afectam o crescimento celular por meio de apoptose aumentada

células PC-3 LNCaP ou (A) foram cultivadas durante 96 horas com e sem o dasatinib. (DSA; 100 nm) e BMS-754807 ( BMS-807; 2 uM para PC-3 e 0,5 uM para células LNCaP), isoladamente e em combinação, e os números de células foram determinados como descrito nos métodos. (B) As células PC-3 e LNCaP foram incubadas durante 24 horas com e sem DSA (100 nM) e BMS-754807 (5 uM para PC-3 e 1 ^ M para células de LNCaP), isoladamente e em combinação, e ciclo celular coloração após 24 horas foi realizada utilizando iodeto de propídio. (C) células PC-3 foram incubadas durante 48 horas com e sem DSA (100 nM) e BMS-754807 (2 uM), sozinhas e em combinação, e a percentagem de células apoptóticas foi determinada por análise de citometria de fluxo de anexina-V coloração. (D) Esquerda: coloração do ciclo celular com iodeto de propídio em células-shIGF-1R PC-3. Direita: PC-3-shIGF-1R e as células de controlo foram incubadas durante 48 horas com e sem DSA (100 nM), e a percentagem de células apoptóticas foi determinada por análise de citometria de fluxo de coloração com anexina-V. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. *

P Art 0,05; N. S. não significativa.

Em células LNCaP PC-3 e, o tratamento com a combinação de dasatinib e BMS-754807 aumentou a paragem do ciclo celular e morte celular, tanto em relação ao inibidor sozinho (Fig. 1B). Ao examinar a contribuição específica de cada composto, descobrimos que a incubação de ambas as linhas celulares com BMS-754807 aumentou a proporção de subg

1 células (Fig. 1B), correlacionando com uma fração maior de células anexina-V-positivos em 48 horas (quando a morte celular foi início-(Fig. 1C), assim como com o correspondente clivagem de PARP (Fig. S1F). em contraste, não houve aumento na subg

uma fracção de células e anexina-V-positivas foram observados com o adição de dasatinib única. para o rastreio de possível indução de autofagia, também testaram se as drogas induzida conversão de LC3-I lc3-II, um processo indicativo de actividade autophagic. Como mostrado na Fig. S1G, nem a droga (por si só ou em combinação) produziu quantidades significativas de LC3-II, sugerindo autofagia não é uma das principais causas de morte celular.

uma vez que apenas BMS-754807 induziu a apoptose, que, em seguida, realizada uma experiência semelhante com as células PC-3-1R para shIGF determinar se a diminuição da expressão do IGF-1R especificamente apoptose aumentada. Com efeito, como pode ser visto na Fig. 1D, knockdown de

IGF-1R

em células PC-3 aumentou a proporção de células subg

1, bem como a anexina-V-positivos em comparação com células de controlo shRNA. Knockdown de

SRC

teve pouco efeito (dados não mostrados).

A combinação de dasatinib e BMS-754807 resulta numa inibição mais potente de Akt do que uma ou outra droga sozinho

a seguir foi testado se a inibição combinada da SFKs e IGF-1R vias de sinalização afectadas de forma diferente do que qualquer um dos agentes sozinho. Em primeiro lugar, analisou potenciais intermediários a jusante destas vias, ERK1 /2 e Akt. As experiências foram realizadas na presença e ausência de IGF-1, porque o IGF-1 é abundante no microambiente de pacientes CRPC. Em condições privadas de soro (para suprimir a linha de base activação IGF-1R), que confirmou a inibição alvo com ambas as drogas depois de IGF-1 de estimulação (Fig. 2A). ERK1 /2 ou fosforilação expressão não foi afectado por qualquer inibidor sozinho ou quando usados ​​em combinação (Fig. S2). Em contraste, a activação de Akt foi parcialmente inibida por cada inibidor por si só e completamente inibidos pela combinação. Para compreender melhor o mecanismo de inibição da Akt, que demonstrou pela primeira vez a expressão de Akt1 e 2 (Fig. 2B, C), mas não Akt3 (dados não mostrados), para níveis detectáveis ​​em células PC-3. Na ausência de IGF-1, Akt2, mas não Akt1, é parcialmente activado (Fig. 2B, C). Na presença de IGF-1, Akt1 e Akt2 torna-se activado fosforilação aumenta ainda mais. Como mostrado na Fig. 2B, 80% de Akt1 fosforilação é inibida pelo dasatinib, enquanto que o dasatinib é ineficaz na inibição induzida por IGF-1-fosforilação Akt2 (figura 2C.). Em contraste, BMS-754807 parcialmente, mas não completamente, reduziu tanto a fosforilação de ambos Akt1 e 2 na presença de IGF-1. bloqueio duplo do IGF-1R e SFK com combinadas dasatinib BMS-754807 e inibe completamente detectável Akt1 e 2 fosforilação na presença de IGF-1 (Fig. 2B, C). Para investigar os efeitos sobre um alvo a jusante de Akt, examinou-se a fosforilação S6. De acordo com os resultados da inibição de Akt, inibição parcial da fosforilação S6 foi visto com ambos dasatinib e BMS-754,807 por si só, e a inibição completa foi observada com a combinação (Fig. 2D), o que sugere que a inibição de funções Akt requer tanto dasatinib e BMS- 754.807. Assim, a combinação de dasatinib e BMS-754807 sobrevivência diminui em parte, devido à completa inibição de Akt.

células PC-3 (A) foram privadas de soro durante 72 horas e então pré-incubados durante 2 horas com BMS-754807 em qualquer das 2 uM ou 5 uM, com dasatinib a 100 nM, ou com ambos os agentes. Após 2 horas, as células foram estimuladas com 50 ng /mL de recombinante humana o IGF-1 (rhIGF-1) durante 3 minutos. Em seguida, a proteína foi recolhido e a (fosfo) -proteins IGF-1R, Src, e Akt foram determinados por Western Blot (WB). Vinculina foi utilizado como controlo de carga. (B e C) células PC-3 foram estimuladas com DSA (100 nM) e BMS-754807 (5 uM), como acima, e, em seguida, as células foram colhidas e imunoprecipitadas para Akt1 (B) ou Akt2 (C), seguida de imunotransferência para fosfo-Akt. (D) PC-3 células foram tratadas como em (A), e western blot foi executado para S6 e fosfo-S6.

O tratamento de tumores de xenoenxerto humanos primários com dasatinib e BMS-754807 é eficaz camundongos

in vivo

e induz a apoptose tumor

Para determinar o efeito da inibição combinada de Src e IGF-1R em um xenotransplante direta de células CaP humanos crescendo em modelos de ratos, primeiro tratados ostentam a primários de xenoenxerto humano MDA 133 CaP tumores (castração-resistente, AR positivo) com dasatinib e BMS-754807 sozinho e em combinação (n = 4 para cada grupo). Como mostrado na Fig. 3A, às 3 semanas, havia um aumento no tamanho do tumor no grupo de controlo, bem como os grupos individuais com a droga, ao passo que a taxa de crescimento do tumor foi significativamente reduzida no grupo de combinação. Este efeito foi mesmo mais pronunciado no dia 26, altura em que os ratinhos foram sacrificados.

(A) MDA CaP 133 (derivadas de metástases ósseas), as células foram implantadas subcutaneamente em ratinhos nus como descrito nos Métodos. Uma vez que os tumores atingiram um volume de 3 mm

3, os ratinhos foram tratados com dasatinib e BMS-754807 sozinho e em combinação (n = 4 para cada grupo). Os tumores foram medidos duas vezes por semana. É mostrado o aumento relativo do tamanho do tumor ao longo do tempo em cada grupo. *

P Art 0,05. (B) Os ratinhos foram submetidos a eutanásia 16 dias após o início do tratamento, os tumores foram colhidos, e manchas de Western foram realizadas para os -proteins indicado (total e fosfo). São mostrados resultados representativos de um tumor em cada grupo de tratamento. (C) Quantificação da coloração TUNEL para detectar a apoptose. É mostrada a média (± SEM) número de células em apoptose por campo de alta potência (HPF) em cada grupo.

imuno em tumores de flash-congelados colhidos de ratinhos tratados com agente único demonstrou inibição da src fosforilação por dasatinib e fosforilação de IGF-1R pela BMS-754807, demonstrando que essas drogas atingiu os seus objectivos principais. Exatamente como observamos no

in vitro

estudos, Akt e fosforilação S6 foi apenas parcialmente inibida por cada droga sozinho. Em contraste, foi observada inibição robusta de Akt e S6 fosforilação no grupo de combinação (Fig. 3B). Além disso, a apoptose foi aumentado, como determinado por coloração TUNEL de tumores tratados com BMS-754807 e ainda aumentada no grupo de combinação (

P

= 0,01; Fig. 3C). Estes resultados sugerem que a inibição combinada da Src e IGF-1R é eficaz em xenoenxertos humanos primários, mediadas em parte por inibição quase completa da fosforilação de Akt.

Para examinar de inibição do tumor, as células PC 3 ortotópicos LG (escolhido para o seu receptor de androgénio [Ar] estatuto -negativa e crescimento robusto em modelos ortotópicos) foram injectadas nas próstatas de ratinhos nus e tratados como descrito na secção de Métodos. Quatro semanas após a injecção das células, os ratinhos foram mortos e os tumores excisados ​​e pesados ​​(Fig. S3A). tumores representativos dos 4 grupos de tratamento (total n = 8 para cada grupo) são apresentados na Fig. S3B. Não houve diferença significativa no peso do tumor entre o controlo, o dasatinib, BMS-754807 e grupos com as concentrações utilizadas (como esperado), mas os ratinhos tratados com a combinação de drogas tinham tumores significativamente menores (

P 0,03; Fig S3 a, B)

O dasatinibe e BMS-754807 inibição PC3-MM2 induzida por destruição óssea e diminuem marcadores de remodelação óssea

in vivo

Para.. investigar se dasatinib e BMS-754807 reduziu a remodelação óssea induzida pela APC, que injetaram células PC3-MM2 intratibialmente em ratinhos nus. Duas semanas após a injecção, os ratinhos foram tratados durante 4 semanas com qualquer um dos fármacos sozinhos ou em combinação (controlo, n = 10; dasatinib, n = 9; BMS-754807, n = 9; combinação, n = 8). Neste momento, os raios-X foram tomadas e os ratinhos foram sangrados a seguir a eutanásia. Os ossos envolvidos foram colhidas por tomografia computadorizada. CaP celular induzida pelo crescimento do tumor e destruição óssea, medido em raios-x simples, foi marcado na forma cega como descrito nos Métodos. Considerando que, tal como esperado, o tratamento com dasatinib sozinha exibiram alguma inibição da destruição óssea, a combinação de dasatinib e BMS-754807 intratibial crescimento do tumor mais eficazmente inibida no osso (Fig. 4A, B). No entanto, apenas a combinação de fármacos reduziu significativamente os níveis séricos dos marcadores de renovação óssea (Fig. 4C, D), indicando modulação de ambas as células APC e o seu microambiente do osso, interferindo assim com o ciclo vicioso [10]. Considerando que a modificação de murino N-telopéptido, um substituto para a actividade dos osteoclastos, é indicativa de inibição da linha celular osteolíticas PC3-MM2, a diminuição observada em fosfatase alcalina de murino (que representa a actividade osteoblástica) da interdependência destas células no processo de remodelação óssea. Dasatinib sozinho foi mostrado para induzir a maturação de osteoblastos [38]; assim, possivelmente aumentando a secreção de RANKL, que por sua vez activa osteoclastos normalmente. No entanto, como mostrado na Src – /- de rato [39], Src é também um importante regulador da função dos osteoclastos, e isto é confirmado pela conservação óssea em dasatinib-alone células tratadas (Figura 4B.). No entanto, nos modelos utilizados, dasatinib como um único agente com a concentração mais baixa utilizada é insuficiente para inibir o crescimento do tumor, o que sugere que sob estas condições, a expressão de RANKL activa, pelo menos, parcialmente a função dos osteoclastos, mas que a adição de BMS-754807 ao dasatinib provavelmente inibe a maturação dos osteoblastos, diminuindo ainda mais a actividade dos osteoclastos. Este resultado parece ocorrer em cada modelo, e, portanto, é uma característica consistente de esta combinação de drogas.

células PC3-MM2 osso destrutivos foram injectados intratibialmente em ratinhos nus. Após o tratamento com dasatinib, BMS-754807 sozinhos e combinados, os ratos foram sacrificados, e raios-x e tomografia computadorizada (TC) de ossos longos foram feitas (controle, n = 10; dasatinib, n = 9; BMS-754807 , n = 9; combinação, n = 8). O sangue foi coletado para marcadores de formação óssea no soro. (A) O grau de destruição óssea, foi às cegas graduada de forma semi-quantitativa baseada em raios-x de todos os ratos. O gráfico mostra a percentagem de lesões de alto grau (isto é, 2 ou 3) em cada grupo de tratamento. *

P Art 0,05 vs. combinação única dasatinib. (B) scans CT representativos (em cima) e raios-x (em baixo) obtidos com ratos em cada grupo. Setas e números indicam o local da lesão e o grau de destruição óssea. (C e D) Os níveis séricos de fosfatase alcalina de murino (C) e N-telopéptido (D) foram determinadas por ELISA. Bares indica SEM.