Sumário

Integração de papilomavírus humanos (HPV) de DNA no genoma do hospedeiro é um evento etiológico fundamental na progressão da cérvix normal a neoplasia intraepitelial, e, finalmente, para cancro cervical invasivo. No entanto, tem havido pouco trabalho sobre como o estado de integração HPV relaciona-se com o resultado do tratamento de carcinomas do colo do útero. No estudo atual, o HPV E2 e número de cópias do gene E6 foram medidos em 111 tecidos de câncer do colo do útero usando em tempo real QPCR. padrões de integração foram divididas em quatro grupos: cópia única integrada com os componentes episs�icas (grupo 1), única cópia integrado sem componentes episs�icas (grupo 2), multic�ia conjunto integrado repetição (grupo 3), e (Grupo 4) grupos de baixo HPV . Um modelo de previsão de recaída foi construído utilizando multivariada Cox modelo de riscos proporcionais para classificar os pacientes em diferentes grupos de risco para a sobrevida livre de doença (DFS). O modelo foi validado internamente utilizando reamostragem de bootstrap. análise oligonucleotídeo microarray foi realizado para avaliar os padrões de expressão genética em relação aos diferentes grupos de integração. taxa de DFS foi inferior na ordem dos doentes no grupo 4, o grupo de 2/3, eo grupo 1. A análise multivariada mostrou que o grau histológico, o grupo de estágio clínico e padrão de integração foram fatores prognósticos significativos para pobres DFS. O modelo prognóstico atual previu com precisão o risco de recaída, com uma área sob a curva ROC (AUC) de 0,74 (Bootstrap corrigido, 0,71). Em conclusão, estes dados sugerem que padrão de integração HPV é um fator prognóstico potentes para o tratamento sob medida de câncer cervical

Citation:. Shin HJ, Joo J, Yoon JH, Yoo CW, Kim JY (2014) estado físico Integração Papilomavírus humano em Câncer do colo do útero está associada ao tratamento Resultados dos pacientes tratados com radioterapia. PLoS ONE 9 (1): e78995. doi: 10.1371 /journal.pone.0078995

editor: Anthony W. I. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 12 Agosto, 2013; Aceito: 25 de setembro de 2013; Publicação: 10 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Shin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional do Câncer, Goyang, Coreia (Grant 1.310.300 e 1.110.033). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Integração do papilomavírus humano do ADN (HPV) tem sido considerada como um acontecimento crítico no processo da carcinogénese do colo do útero. ADN de HPV é encontrado para estar presente em formas integradas em células hospedeiras com o aumento da frequência de epitélio cervical normal a neoplasia intra-epitelial e cancro invasivo do colo do útero [1], [2], [3]. No entanto, existem relatórios mostrando que epissomal ADN do HPV está presente em uma porção substancial dos cancros cervicais invasivos, sugerindo a integração nem sempre é necessário para a progressão maligna [4], [5]. cópia única integração do HPV resulta em rompimento da estrutura de leitura aberta E1 ou E2 (ORF) [2], [4],. Como uma alternativa, a integração de várias cópias de HPV pode ocorrer como repetições em tandem cabeça-com-cauda [6], [7]. Quando isto ocorre, apenas a cópia viral que flanqueia o ADN celular é interrompido na região E1 ou E2, enquanto as cópias internas têm E1 e E2 intacta quadros de leitura aberta (ORF do). Considerando que a perda do E2 ORF podem desregular a transcrição de E6 e E7, é possível que a ORF de E2 intactos, mas que são encontradas com múltiplas cópias em tandem de HPV genomas integrados, pode expressar e restabelecer o controle transcricional de E6 /E7. No presente estudo, avaliou-se o significado prognóstico de diferentes padrões de integração HPV para DFS de câncer cervical. análise de microarray foi então usada para comparar as diferenças na expressão genética total entre esses padrões de integração diferentes.

Materiais e Métodos

As características dos pacientes

Este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board do Centro Nacional do Câncer, Coréia e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. 111 pacientes consecutivos foram recrutados de julho de 2003 a julho de 2008 com diagnóstico de HPV 16, 18, ou 58 escamosas positivo, adeno, ou carcinoma adeno do colo do útero. As características clínicas desses pacientes estão apresentados na tabela 1. work-ups de diagnóstico incluídos retossigmoidoscopia em todos os pacientes, a ressonância magnética (RM) da pelve ± abdômen em 110 pacientes, e quer a tomografia por emissão de positrões (PET) scan ou PET /CT (tomografia computadorizada) scan em 93 pacientes. Todos foram tratados com radioterapia, que consiste em radioterapia externa (RT) e braquiterapia de alta taxa de dose. Durante EBRT, concomitante semanal cisplatina 40 mg /m

2 foi dado a todos os pacientes, exceto 9 pacientes que tiveram uma escala de desempenho pobre. Após a conclusão do tratamento primário, os pacientes foram acompanhados a cada 3 meses durante os primeiros 2 anos, a cada 4 meses durante o terceiro ano, e a cada 6 meses depois. Detalhes da radioterapia foram descritos anteriormente [8].

em tempo real da reacção em cadeia da polimerase de genes de HPV E6 e E2

, extracção, amplificação, e genotipagem de ADN foram realizados como previamente relatado [8]. PCR em tempo real foi realizado com o sistema ABI Prism 7900HT e TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Applied Biosystems, Perkin-Elmer, Foster City, CA). Os iniciadores e as sondas foram concebidos para amplificação específica das regiões de charneira E2, que são conhecidos por ser interrompida mais frequentemente durante o processo de integração virai [2]. A informação sobre a sequência de cada um dos iniciadores utilizados estão disponíveis na Tabela S1. Cinquenta nanogramas de ADN alvo a partir de cada espécime de biópsia foram usadas por reacção e curvas padrão foram produzidas por amplificação de uma série de diluições de 10

6 -10

3 cópias de um clone de ADN de HPV em pBR322. Pelo menos três não-molde misturas reaccionais de controlo foram incluídas em cada teste e todas as experiências foram realizadas em triplicado.

A classificação dos tumores cervicais com o estado físico de genomas de HPV

sobre a base do número de cópias relativas de E2 e E6, os pacientes foram classificados em 4 grupos; Single-cópia integrado com componentes episs�icas (grupo 1) e sem componentes episs�icas (grupo 2), multic�ia conjunto integrado repetição (grupo 3), e os grupos de baixa HPV (4 grupo). Grupo 1 tumores ainda contêm HPV episs�ica com a amplificação de ambos E6 e E2, embora os níveis de E2 são reduzidos. Grupo 2 têm tumores sem amplificação E2. Grupo 3 tumores têm níveis iguais de E2 e E6 que indica multic�ia conjunto integração repetida HPV. Grupo 4 tumores não possuem amplificações E2 e E6. Estes quatro grupos acabaram por ser re-classificados em três grupos com base em seus resultados clínicos diferentes (grupo 1 vs. grupo 2/3 vs. grupo 4).

análise Microarray

análise Microarray foi realizada para 39 pacientes dos quais poderiam ser obtidas amostras de tumor fresco congelado. Apenas os pacientes com infecção por HPV16 foram incluídos na experiência microarray para evitar heterogeneidade causadas por diferentes genótipos de HPV. Como resultado, 14, 9, 12, e 4 amostras de integração groups1 a 4, respectivamente, foram analisados ​​utilizando a expressão de genes de microarranjos 44K v.1.0 humano inteiro (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA). Todos os dados numéricos foram normalizados com per-spot e per-chip normalização (normalização dependente da intensidade), e normalização per-gene (a mediana) usando GeneSpring 7.3.1. análise de tendência linear com base em Posição foi usado para testar a tendência linear em expressões de genes entre diferentes padrões de integração ordenados por resultados clínicos. método de permutação com 250.000 re-amostragem foi realizada para avaliar a correspondente

p

-valor. Os níveis de expressão em escala log 2 foram usadas na análise, e a taxa de detecção falsa (FDR) [9] foi controlada a 0,05. dados de microarranjos foram depositados na expressão gênica Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) e são acessíveis através de Gene Expression número de série Omnibus GSE49288.

A análise estatística

características demográficas e clínicas são apresentados como contagens e percentagens para as variáveis ​​categóricas e média e gama de variáveis ​​contínuas. As diferenças de distribuição entre grupos foram avaliadas pelo teste de Pearson Chi-quadrado ou teste exato de Fisher. de correlação de Spearman foi obtido para medir a associação entre o HPV carga viral e copiar números. As diferenças no número de cópias entre os grupos foram testadas por meio do teste de Kruskal-Wallis. A Cox modelo de risco proporcional multivariada foi utilizada para prever o DFS depois de ajustar os efeitos de outros potenciais fatores de confusão, como idade, fase de grupos, o status nodal, grau histológico, e tipo histológico. O modelo final foi escolhida com base no resultado da análise univariada, bem como a apreciação da importância biológica ou clínica das variáveis. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SAS versão 9.1 (Cary, NC) e software estatístico R, versão 2.12. Todos os relatados

p

-Valores são duas faces.

Validação do modelo de previsão utilizando de bootstrap resampling

A capacidade de discriminação do modelo de Cox multivariada para predizer a doença 2 livre sobrevivência foi avaliada utilizando a estatística C, uma medida de concordância análoga à área sob a curva receiver operating characteristic (ROC). A calibração do modelo foi avaliada por meio do teste do qui-quadrado tipo de Hosmer-Lemeshow, comparando a diferença entre as taxas de sobrevivência de 2 anos observados e previstos pelo modelo desenvolvido para pacientes em cada quintil. Com base na taxa de sobrevivência previsto, três grupos foram formadas dividindo-se os pacientes em tercis. A diferença nas distribuições de sobrevivência destes três grupos foram comparadas pelo teste de log-rank. O modelo preditivo foi validado utilizando 1000 amostras de bootstrap como uma validação interna para corrigir o viés de alta na estimativa estatística C devido a re-substituindo os dados.

Resultados

E6 e E2 número de cópias do gene e padrão de integração

Classificação dos doentes, com base na quantidade relativa de E2 e E6 números de cópias resultou em 31, 24, 37, e 14 pacientes dos grupos 1 a 4, respectivamente. Os rácios de ciclo limiar (Ct) de E2 /E6 dos pacientes em cada grupo são mostrados por um gráfico de dispersão (Fig. 1). 5 pacientes tinham padrões inclassificáveis. E6 e E2 número de cópias mostrou uma correlação positiva em group3 (r = 0,83,

p Art 0,0001) e com o grupo1 (r = 0,43,

p = 0,02

), mas não em group2 ( r = 0,008,

p

= 0,97), nem no grupo 4 (r = 0,26,

p = 0,37

).

os rácios E2 /E6 Ct dos pacientes em cada grupo são descritos como pontos no gráfico de dispersão. As barras horizontais representam o valor mediano com intervalo interquartil.

univariada e análise multivariada dos resultados do tratamento

Durante o acompanhamento, 33 pacientes (29,7%) desenvolveram progressão da doença, incluindo 25 metástases distantes ou 10 recidivas locais. Entre esses pacientes, três tiveram ambos. Treze pacientes morreram ea causa da morte de 2 pacientes entre eles era doença cardiovascular e desconhecidos, respectivamente. Eles foram censurados na data da morte. Os pacientes foram acompanhados por mediana de 29 meses (variação, 2-67 meses). O período médio de follow-up para os pacientes sem recorrência foi de 36 meses (variação de 6-67 meses). Quando os quatro grupos foram re-classificados em três grupos, a taxa de DFS dos pacientes no grupo 1 foi o mais elevado, seguido por grupos 2/3 e grupo 4 em ordem decrescente. As taxas de risco (HR) e intervalo de confiança foi de 1,90, intervalo de confiança (IC) 0,70-5,15,

p

= 0,207 para o grupo 2/3 contra o grupo 1, HR 3,52; IC 1,11-11,14,

p

= 0. 032 para o grupo 4 contra o grupo 1, respectivamente (

p

= 0,083 pelo teste de log-rank, Fig. 2 e Tabela 2) na análise univariável. Outros parâmetros prognósticos significativos para DFS incluída fase de grupos, metástase nodal, grau histológico, tipo histológico e tabagismo por análise univariável. Na análise multivariada, padrão de integração (geral

p

= 0,014; para o grupo 2/3 vs. grupo 1,

p

= 0,03, HR 3,15; IC 1,12-8,9; para o grupo 4 vs . grupo 1,

p = 0,004

, HR 6,78; IC 1,86-24,79), grau histológico, o grupo de estágio clínico, e permaneceu significativa (Tabela 2)

grupo. 1; integração cópia HPV único, com componentes episs�icas, Grupo 2; integração cópia HPV único sem componentes episs�icas, Grupo 3; Multicopy conjunto repetido integração, Grupo 4; baixo HPV.

O desempenho dos modelos preditores de resultados e validação interna

A C-estatística do modelo para prever a sobrevivência 2 anos foi de 74% (IC 95% , 65% -83%) e o bootstrap validado estatística C foi de 71%. O tipo de Hosmer-Lemeshow estatística de teste do qui-quadrado foi 9,02, com a correspondente

p

= 0,435, que indica um bom ajuste. O teste de log-rank resultou em uma diferença significativa entre as distribuições de sobrevivência dos três grupos de pacientes definidos pela taxa prevista de sobrevivência (

p Art 0,0005). (Fig. 3 e Tabela 3)

análise Microarray das 39 amostras de cancro do colo do útero

654 genes foram selecionados como mostrando significativamente diferentes expressões entre os grupos de integração classificados pelo estado físico do DNA do HPV (grupo 1 vs grupo 2 /3 vs. group4). Porque as taxas de sobrevivência dos pacientes tendem a diminuir a partir grupo1 a 4, genes que exibiram uma tendência correlata nos seus níveis de expressão foram examinados. Como resultado, as expressões médios de 429 genes entre os quais mostraram-se no aumento gradual (241) ou diminuir (188) no fim do Grupo 1 para 4 (Fig. 4). Depois de uma selecção rigorosa com base na taxa de erro sábio família (correcção de Bonferroni) inferior a 5%, moduladores transmembranares de adesão celular, tais como claudina, ocludina, e sindecam permaneceu como genes que mostram uma diminuição significativa do grupo 1 a 4. Os reguladores de pequena GTPase transdução de sinal mediada tais como proteína de controlo da divisão celular 42 (CDC42) proteínas efetoras, ativando proteínas Rho GTPase, e p21 (CDC42 /Rac) quinase -activated 2 (PAK2) também diminuiu significativamente. Estes genes são conhecidos por desempenhar um importante papel na reorganização das fibras de actina de stress, a adesão de uma célula para outra célula, a matriz extracelular. Entre os genes com tendência crescente de expressão do Grupo 1 a 4 foram os reguladores de transcrição, tais como a associada-MYC factor X (MAX) e factor de necrose tumoral (TNF). Além disso, havia moléculas associadas com cromatina remodelação tais como AT-rich 1A domínio interativa (SWI-like), AT-rich domínio interativa 4B (RBP1-like, BRCAA1) e DNA helicase chromodomain proteína de ligação. funções biológicas destes genes foram examinados utilizando os recursos DAVID Bioinformática versão 6.7 (https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Informações detalhadas dos genes e

p -valor de

a tendência linear estão listados na Tabela S2. análise ontologia gene utilizando este instrumento indica que o nível de expressão de genes relacionados com a diferenciação dos queratinócitos e linfócitos-T foi muito baixa no grupo 4. Especialmente, o receptor alfa do retinóide X (NM_002957) foi significativamente reduzida no grupo 4 ao mesmo tempo que foi mais altamente expresso no grupo 1 (dados não mostrados). Isto suporta a observação da falta de diferenciação epitelial em tumores com DNA de baixo HPV.

Discussão

No estudo atual, o valor prognóstico do estado físico do HPV foi examinada em localmente tumores cervicais avançadas. Nosso estudo revela que os tumores cervicais com componentes episs�icas têm sobrevida pós-radioterapia superior quando comparado com aqueles com HPV puramente integrado. Verificou-se também que o prognóstico do cancro do colo do útero é significativamente diminuída em tumores com nível não detectável de ADN de HPV.

Foi anteriormente mostrado que os tumores invasivos não são sempre compostas por células com ADN de HPV integrado 100%. Há aproximadamente 17~20% dos pacientes com cancro invasivo com epissomal misto e formas integradas de HPV [4], [5], ou até mesmo formas epissomais apenas em 7% dos pacientes [4]. Além disso, vários estudos têm demonstrado que o estado físico do HPV no câncer cervical está associada com os resultados do tratamento [4], [10], [11]. padrões de integração virai foram avaliadas por transferência de Southern do local de E1 /E2 [10] ou pelo método de amplificação de sinal de DNA viral in situ [11] ou de ambos estes métodos [4].

quantidades relativas de E2 e E6 foram utilizados neste estudo e, surpreendentemente, verificou-se que um terço (37/111) das amostras tinha a integração de várias cópias de HPV. A presença de múltiplas cópias de HPV genomas de repetição conjugadas em tumores é conhecido por ser produzido pelo método de replicação em círculo rolante de HPV [12]. Embora o prognóstico dos pacientes com tanto a integração cópia HPV único sem componentes episs�icas e conjunto integração repetida multic�ia era pobre em nosso estudo, a importância biológica desta observação precisa ser esclarecido.

Apesar de genotipagem do HPV e real rigorosa PCR em tempo, havia 14 pacientes com indetectável HPV E2 e E6 em seus tumores que apresentaram a pior taxa de sobrevivência entre os grupos de integração 4. É possível que os tumores sem DNA de HPV pode representar aqueles com mais características de cancro de células estaminais que carecem de diferenciação epitelial em que a replicação virai é restringido com a replicação do HPV abortivo [13]. Consistente com esta hipótese, a análise de microarray apresentou baixa expressão de genes relacionados com a diferenciação dos queratinócitos e linfócitos-T. Além disso, com base nestes dados, é também assumido que diferenças entre os grupos na remodelação da cromatina pode induzir a expressão diferencial dos vários genes. Especialmente, as moléculas associadas com a sinalização de Rho-GTPases pode contribuir para o desenvolvimento em fenótipo metastático através de enfraquecimento da adesão celular e alterações morfológicas como EMT (transição epitelial-mesenquimal) nos tumores com taxas de sobrevivência pobres, tal como sugerido no nosso estudo anterior [14] . Mais estudos devem ser feitos para provar esta ideia

Os dados atuais são consistentes com nosso trabalho anterior, que descreveu alta carga viral. (HC2test; Digene Corp) foi fortemente associado com um bom prognóstico, enquanto os pacientes com carga viral inferior se saíram muito pior após a radioterapia [8]. Em resumo, nós determinamos padrões de integração de HPV utilizando um novo método de PCR quantitativo de análise da estequiometria de HPV E6 e E2 e determinada a sua relação com o resultado clínico pós-radiação. padrões de integração foram assim encontrado para ser um forte fator prognóstico mostrando uma boa correlação com outros fatores prognósticos conhecidos, tais como estágio, estado nodal, tipo histológico e estado de diferenciação. Um estudo mais aprofundado usando números maiores de amostras e métodos adicionais de análise de padrões de integração HPV no câncer do colo do útero serão necessários para confirmar estes resultados.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Primer e sequências de sondas para o gene E2 e E6-PCR em tempo real

doi:. 10.1371 /journal.pone.0078995.s001

(DOC)

Tabela S2.

genes que mostraram aumentar (a) e diminuindo (b) a partir de tendência linear grupo1 para grupo4; O nome, a função, a mudança vezes (FC) dos genes e p-valor da tendência linear são apresentados na rubrica de classificação ontologia gene

doi:. 10.1371 /journal.pone.0078995.s002

(DOC)