Abstract

Fundo

TM4SF1 é abundante no pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) e afeta o desenvolvimento desse tipo de câncer. Além disso, resistência a múltiplas drogas (MDR) é geralmente associado com chemoresistance tumor no câncer de pâncreas. No entanto, a correlação entre TM4SF1 e MDR permanece desconhecida. Esta pesquisa tem como objetivo investigar o efeito da TM4SF1 sobre a resistência gemcitabina no PDAC e explorar o mecanismo molecular possível entre TM4SF1 e MDR.

Métodos

A expressão de TM4SF1 foi avaliada em linhas celulares de cancro do pâncreas e linhas de células humanas do pâncreas ducto epitelial (HPDE) por RT-PCR quantitativo. TM4SF1 siRNA transfecção foi realizada utilizando o reagente de transfecção Hiperfect para derrubar TM4SF1. Os transcritos foram analisados ​​por RT-PCR quantitativo, RT-PCR e transferência de Western para um estudo mais aprofundado. Obtiveram-se a proliferação celular e a apoptose para investigar a sensibilidade de gemcitabina de células de cancro do pâncreas após o silenciamento TM4SF1

In vitro

. Foi demonstrado que a sinalização celular mediada de TM4SF1 quimiorresistência em células de cancro através da avaliação da expressão de genes de resistência a múltiplas drogas (MDR), utilizando RT-PCR quantitativo.

In vivo

, foram utilizados modelos de tumor pancreático ortotópico para investigar o efeito da proliferação após o silenciamento TM4SF1 por um shRNA mediada por lentivírus em MIA linhas celulares PaCa-2.

Resultados

A expressão de ARNm de TM4SF1 foi maior em sete linhas de células de cancro do pâncreas do que em linhas celulares de HPDE. Em três linhas de células sensíveis a gemcitabina (L3.6pl, BxPC-3, SU86.86), a expressão de TM4SF1 foi menor do que em quatro linhas celulares resistentes a gemcitabina (MIA PACA-2, PANC-1, Hs766T, AsPC- 1). Avaliamos que TM4SF1 era um alvo putativo para a resistência gemcitabina em células de câncer de pâncreas. Usando AsPC-1, Mia PaCa-2 e PANC-1, investigamos que TM4SF1 silenciando a proliferação das células afectadas e as percentagens de aumento da apoptose celular mediada por tratamento com gemcitabina em comparação com células que foram tratadas com o controlo negativo. Esta resistência foi associada com a expressão de genes de resistência a múltiplas drogas, incluindo ABCB1 e ABCC1.

In vivo

, silenciamento de TM4SF1 em MIA linhas celulares PaCa-2 aumentou a eficácia do tratamento à base de gemcitabina em modelos de tumores pancreáticos ortotópicos avaliada usando a imagem de bioluminescência não invasiva.

Conclusão

Estes resultados sugerem que TM4SF1 é um antigénio de superfície da membrana que é altamente expresso em células de cancro do pâncreas e aumenta a quimiorresistência de gemcitabina. Assim, TM4SF1 pode ser um alvo promissor para superar o chemoresistance de câncer pancreático

Citation:. Cao J, Yang J, Ramachandran V, Arumugam T, Deng D, Li Z, et al. (2015) TM4SF1 promove a resistência gemcitabina de câncer pancreático

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 10 (12): e0144969. doi: 10.1371 /journal.pone.0144969

Autor: James Freeman, da Universidade do Texas Health Science Center, United States |

Recebido: 26 de agosto de 2015; Aceito: 25 de novembro de 2015; Publicação: 28 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Cao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo NIH-DK05207 (em CD Logsdon), CA016672 concessão Cancer Center apoio central (para UT MD Anderson Cancer Center), a Lockton Endowment (em CD Logsdon) e National Natural Science Foundation da China, 81.301.826 (para Jia Cao)

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) é a malignidade humana mais agressivo com uma alta taxa de mortalidade [1]. A taxa média de sobrevida em 5 anos dos pacientes diagnosticados com PDAC é de 7,1% ea duração média de sobrevivência é menor do que 6 meses [2, 3]. Desde falta de sintomas específicos início, a maioria dos pacientes são diagnosticados em fases tardias. A quimioterapia usando gemcitabina é considerado como um tratamento de primeira linha para câncer de pâncreas localmente avançado e metastático para prolongar o tempo de sobrevivência e melhorar a qualidade de vida dos pacientes [4]. No entanto, a taxa elevada de resistência a gemcitabina diminui a eficácia anti-tumoral [5]. Assim, ainda são necessários métodos quimioterápicos eficazes com urgência para melhorar o resultado para este cancro

A multirresistência (MDR) é caracterizada por uma resistência cruzada aos medicamentos quimioterápicos com sites de destino [6].. Os principais mecanismos de chemoresistance gemcitabina estão relacionados com a captação de drogas, metabolismo e ação [4]. Uma das razões mais comuns para resultar em MDR em células cancerosas é através de sobre-expressam o trifosfato de adenina (ATP) liga�o ao cassete transportadores (ABC). Estes transportadores contribuir para o MDR, induzindo o mecanismo anti-apoptótica, aumentar o efluxo de drogas intracelulares e redução das concentrações de droga [7]. Recentemente, estudos demonstraram que a resistência gemcitabina em células de cancro do pâncreas é associado com a expressão de MDR [8,9]. Portanto, é importante para inibir estes transportadores para restaurar a sensibilidade à resistência quimioterapêutico no cancro pancreático.

TM4SF1 é um membro da família de quatro transmembranar do domínio com uma topologia de tetraspanina e homologia de sequência com IL-TMP, TM4SF5, L6D, OCTM4, e TCCE518. Os níveis de expressão são TM4SF1 aumentada em vários carcinomas epiteliais humanos, incluindo o do pulmão, da mama, do cólon, do ovário, da próstata e carcinomas renais [10-12]. Ela desempenha um papel crítico na regulação da angiogénese tumoral, motilidade, migração e invasão [13, 14]. Importante, recentemente estudo mostrou que TM4SF1 de direccionamento de anticorpos de drogas conjugados representam um agente terapêutico promissor contra as células de tumor e na vasculatura do tumor [15]. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar se TM4SF1-superexpressão linhas celulares de cancro do pâncreas estão envolvendo na resistência gemcitabina e para delinear o mecanismo.

No presente estudo, buscou-se determinar se TM4SF1 poderia conferir câncer de pâncreas com a capacidade de gemcitabina resistance.We descobriram que TM4SF1 foi altamente expressa em linhas celulares de cancro pancreático gemcitabina-resistência. Silenciamento de TM4SF1 aumentou a sensibilidade gemcitabina de células quimiorresistentes e diminuiu a expressão de ABCB1 e ABCC1

in vitro

.

In vivo

, células sem TM4SF1 tinha reduzido o crescimento do tumor no pâncreas e aumento da capacidade de resposta aos tratamentos com gemcitabina. Estes resultados sugerem que TM4SF1 deve ser investigado como um alvo potencial para terapia de câncer pancreático.

Materiais e Métodos

medicamentos e reagentes

A gemcitabina foi comprado de Eli Lilly and Co (Indianapolis, IN). Todos os reagentes foram fornecidos pela Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), a menos que especificado abaixo.

linhas celulares de cancro do pâncreas e condições de cultura

As linhas celulares de cancro pancreático humano Hs766T, MIA PaCa-2, PANC-1, AsPC-1, BxPC-3, L3.6PL e SU.86.86 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). células BxPC-3 e AsPC-1 foram rotineiramente cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10% num C incubadora a 37 °, em uma atmosfera humidificada de CO2 a 5%, ao passo que todas as outras linhas celulares de cancro pancreático cresceu em Dulbecco modificado Eagle médio, ducto pancreático humano (células epiteliais HPDE) [16] fornecido pelo Dr. Tsao (Universidade de Toronto) foram cultivadas em meio livre de soro de queratinócitos. As linhas celulares foram obtidas da ATCC e foram autenticado por curto de repetição em tandem de perfis e passadas no nosso laboratório para menos de 6 meses após a recepção ou ressuscitação.

quantitativo em tempo real A análise de PCR reversa transcrição

o ARN total foi isolado a partir de linhas de células de cancro do pâncreas e HPDE, e a qualidade do ARN foi determinada como descrito anteriormente [17]. O ARN foi usado para a análise quantitativa reversa reacção em cadeia de polimerase. Em tempo real, reação em cadeia de polimerase reversa quantitativa foi realizada com verde SYBR como o tag usando um iCycler. (Bio-Rad) .Sequence dos iniciadores está disponível, mediante pedido

A transcrição reversa PCR análise

A PCR foi realizada usando um estojo de PCR (Promega) com o seguinte programa de amplificação:. Pré- desnaturação durante 3 minutos a 94 ° C, a desnaturação durante 30 segundos a 94 ° C, emparelhamento durante 30 segundos a 60 ° C, extensão durante 30 seg a 72 ° C, e um passo de alongamento final a 72 ° C durante 10 min. A PCR foi realizada durante 30 ciclos. Após a PCR, 5 ul de produtos PCR foram corridos num gel de agarose a 1% e visualizadas por densitometria de pixel relativa.

transfecção transiente de ARN interferente pequeno

AsPC-1, Mia PaCa-2, e células PANC-1 foram plaqueadas em placas de 100 mm e transfectadas transitoriamente com controlo pequeno ARN interferente (siRNA [siControl]) e TM4SF1 siRNA (siTM4SF1) em concentrações finais de 10 nmol /L, com reagente de transfecção Hiperfect (QIAGEN). A sequência de siRNA alvejando TM4SF1 foi AAGGACCACTATGTCTTGATT. ARNm foram isolados a partir AsPC-1, MIA PACA-2, PANC-1 e células para a RT-PCR quantitativa após 48 horas.

análise de transferência de Western

A proteína foi extraída com tampão RIPA suplementado com 1% de PMSF durante 30 minutos. Cada proteína de 50 ug de extracto que contenha foi separado por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 10% e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF). As membranas foram bloqueadas em leite em pó magro a 5% durante 3 h, em seguida, incubadas com anticorpo de coelho anti-TM4SF1 (Abcam, diluição 1: 1000) a 4 ° C durante a noite. As membranas foram incubadas com anticorpo IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano durante 2 h à temperatura ambiente. As manchas foram detectadas utilizando o ECL (Millipore) e exposto a filme de raios-X para visualizar as imagens.

Desenvolvimento de ARN gancho de cabelo estável curto-linhas celulares que expressam

O silenciamento de TM4SF1 em células de cancro pancreático linhas foi conseguida utilizando infecção por lentivírus. Os vectores plasmídicos contendo lentivirais-controlo e TM4SF1 curto de ARN gancho de cabelo (shRNA; Abrir Biosystems) foram co-transfectadas com vectores de empacotamento e o lentivírus foi produzido em células 293T através de transfecção de cálcio, tal como descrito anteriormente [17] .TM4SF1 shRNA contendo vectores foram titulados, e MIA PaCa-2 foi infectado com 25 ul de sobrenadante viral /por mililitro de meio misturado com polibreno (meio 4 ug /mL). As células foram então seleccionados de acordo com a sua resistência à puromicina (1-3 ug /ml). linha de células de câncer pancreático estável foi desenvolvido depois.

Proliferação ensaio

Nós usamos ensaio MTS para examinar os efeitos da gemcitabina após silenciar TM4SF1 sobre a proliferação de AsPC-1, Mia PaCa-2 e PANC linhas celulares -1. As células que crescem em uma placa de 6 poços foram tratadas com ARNsi de controlo ou siTM4SF1. 24 h após a transfecção, as células foram recolhidas e 1500 células foram plaqueadas em placas de 96 poços. Depois as células foram tratadas com gemcitabina, durante 48 h, 15 � de MTS solução foi adicionada a cada poço, incubou-se a 37 ° C durante 2h. Os números de células foram estimadas usando a leitura fotométrica, como descrito anteriormente [18,19].

Estudo de apoptose por meio de análise de triagem de células activadas por fluorescência

in vitro

Em estudo anterior , encontramos as linhas celulares de cancro do pâncreas ASPC-1, MIA PACA-2 e PANC-1 eram resistentes a gemcitabina

in vitro

[19]. coloração com iodeto de propídio padrão de células de cancro do pâncreas, usando o método de lise hipotónica foi usada para estudos de apoptose com células activadas por fluorescência (FACS). AsPC-1, Mia PaCa-2 e PANC-1 de células transitoriamente transfectadas com siControl ou siTM4SF1 durante 24 horas foram semeadas em placas de seis poços. A apoptose foi induzida nas células por tratamento com gemcitabina (1, 5 ou 10 nmol /L) durante 48 ou 72 horas. As células foram então recolhidas através de tripsinização, fixadas com etanol frio a 70%, misturou-se com 500 mL de uma solução hipotónica (citrato de sódio 0,1%, 0,1% de Triton X-100, 20 ng /ml de RNase, e 50 ug /mL de iodeto de propídio) , incubou-se durante 30 minutos e foi analisada através de citometria de fluxo utilizando um sistema EPICS-XO (Beckman Coulter). Células em apoptose, devido à fragmentação do DNA foram detectados como a população de células com conteúdo de DNA sub-G1.

Animais e estudo do crescimento do tumor

in vivo

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as orientações para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O uso de camundongos foi aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da MD Anderson Cancer Center.

células MIA PaCa-2 foram modificadas para expressar de forma estável um gene luciferase de vaga-lume via lentiviral transfecção [20]. A capacidade tumorigénica de células TM4SF1 shRNA-silenciados foi comparada com a das células controle shRNA-transfectadas em tumores pancreáticos que ortotópicos formados em ratinhos nu /nu com 5 semanas de idade atímicos nus machos. 28 camundongos nu /nu nuas foram divididos em quatro grupos (grupo 1, shCtrl; grupo 2, shCtrl + GEM; grupo 3, shTM4SF1; grupo 4, shTM4SF1 + GEM). Todos os animais receberam comida esterilizada e água autoclavada numa luz /12 horas de ciclo escuro de 12 horas por dia. células MIA PaCa-2 foram estavelmente transfectadas com shTM4SF1 ou shRNA controle. Estas células cresceram a 80% de confluência e foram colhidas através de tripsinização, lavadas uma vez em PBS e ressuspensas a uma concentração final de 5 × 10

6 células /ml. As suspensões de células (50 uL cada) foram injectados no pâncreas de sete ratinhos por grupo de teste. Depois de uma semana, estes ratos foram tratados com ou sem gemcitabina (100 mg /kg de peso corporal). O crescimento do tumor foi avaliado usando imagiologia bioluminescente e a sobrevivência dos animais foi registada. Os ratinhos foram monitorizados a cada semana para todos os sintomas e sinais. Após 7 semanas, dois ratinhos tinham os sinais de dispneia e movimento anormal e um dos tumores foi excedeu 15% de massa corporal. Todos os ratinhos foram sacrificados em anestesia isoflurano seguido por deslocamento cervical e o pâncreas de cada rato foi removido. Além disso, os tumores foram pesados.

A imagiologia bioluminescente foi realizada utilizando um sistema de imagem criogenicamente arrefecida acoplado com um computador de aquisição de dados que executa o programa de software de imagem viva (Xenogen). Antes de imagem, os animais foram anestesiados numa câmara de acrílico com uma mistura de 1,5% de isoflurano /ar e injectados intraperitonealmente com o sal de potássio de 15 mg /mL em PBS luciferina a uma concentração de 150 mg /kg de peso corporal. As imagens animais graysclae Digital foram adquiridas, que foi seguido por aquisição e sobreposição de uma imagem pseudo representando a distribuição espacial dos fotões detectados emergentes da luciferase activa em cada animal. intensidade do sinal foi quantificado como a soma de todos os fotões detectados dentro da região de interesse por segundo.

Estudo de proliferação celular utilizando um ensaio de antígeno nuclear de proliferação celular

in vivo

Análise da proliferação de células do cancro do pâncreas em tecido de tumor foi realizada usando um kit disponível comercialmente antigénio nuclear de proliferação celular (PCNA) (Jackson ImmunoResearch), tal como descrito em detalhe previamente [21]. secções embebidas em parafina de tecido de tumor tratados com e sem gemcitabina foram analisados ​​para a proliferação. manchas imuno-histoquímica das secções foram analisadas utilizando um microscópio Olympus. Imagens dos cortes foram captadas com uma câmara refrigerada charge-coupled do dispositivo (fotométricos) e do programa de software Smart Capture (Scientific Digital). Para quantificar os eventos de proliferação, os resultados de coloração foram avaliadas por um cientista patológica (Dr. Henry Wang).

A análise estatística

Todo o

in vitro foram conduzidos experimentos

em triplicado e realizou três ou mais vezes. Os dados são apresentados como o meio de experimentos independentes (± erro padrão [se]). Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas usando Kruskal-Wallis ou bicaudal teste t de Student não pareado, Dunnett teste de comparação múltipla e teste de Mann-Whitney. níveis de P inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

TM4SF1 é altamente expresso em linhas celulares de cancro do pâncreas

Em estudos de perfis anteriores, a expressão do mRNA TM4SF1 foi elevada em pancreático tumores e linhas celulares de cancro [22]. E o estudo descobriu que quatro linhas celulares (BxPC-3, SU86.86, CFPAC-1, L3.6pl) foram sensíveis e cinco linhas de células (PANC-1, Hs766T, MIA PACA-2, ASPC-1, Mpanc96) foram resistente a gemcitabina com base na inibição do crescimento de 50% [19]. Nós investigado mais a expressão do mRNA TM4SF1 em sete linhas celulares de cancro do pâncreas e células HPDE. A análise por RT-PCR quantitativa indicaram que todas as linhas celulares de cancro do pâncreas expresso de TM4SF1 para uma maior extensão do que as células não transformadas de HPDE. A expressão de ARNm de TM4SF1 em quatro linhas de células sensíveis a gemcitabina (MIA PACA-2, PANC-1, Hs766T, AsPC-1) foi mais elevado do que em três linhas de células resistentes à gemcitabina (L3.6pl, BxPC-3, SU86. 86) (Figura 1).

a análise quantitativa por RT-PCR resultou em relação à expressão de ARNm em TM4SF1 lines.TM4SF1 ARNm de células de cancro pancreático humano foi mais altamente expresso em linhas celulares de cancro do que em células de HPDE. A expressão de ARNm de TM4SF1 foi inferior em três linhas de células sensíveis a gemcitabina (L3.6pl, BxPC-3, SU86.86) do que em quatro linhas celulares resistentes a gemcitabina (MIA PACA-2, PANC-1, Hs766T, AsPC- 1).

TM4SF1 silenciamento aumenta a sensibilidade de gemcitabina

Para investigar o papel funcional da TM4SF1 em células de câncer de pâncreas, que transitoriamente transfectadas AsPC-1, MIA PaCa-2 e PANC-1 e células com siControl siTM4SF1 e confirmou silenciamento de TM4SF1 nas células utilizando RT-PCR quantitativo, RT-PCR e western blot (Fig 2A e Fig S1) .Para avaliar os efeitos da TM4SF1 sobre a sobrevivência das células e resistência à quimioterapia, tratámos MIA PaCa-2, PANC-1 e AsPC-1 células, os quais expressam níveis elevados de TM4SF1 nativamente, com várias concentrações de gemcitabina na presença de qualquer um ou siControl siTM4SF1. MTS resultados do ensaio mostraram que a capacidade de proliferação foi mais baixa em células siTM4SF1 do que em células siControl após tratamento com gemcitabina (Figura 2B). Além disso, o silenciamento de TM4SF1 aumentou a resposta apoptótica a tratamento com gemcitabina com concentração anterior (1, 5 ou 10μmol /L) em todas as três linhas de células [19] (Figura 2C).

(A) RT-quantitativa PCR e transferência de western demonstrou a silenciamento de TM4SF1 em AsPC-1, linhas de células MIA PaCa-2 e PANC-1. As linhas de células foram transfectadas transientemente com siControl ou siTM4SF1, e o ARNm foi isolado a partir deles ao fim de 48 horas e a proteína foi isolada depois de 72 horas. (B) AsPC-1, PANC-1 e células MIA PaCa-2 foram incubadas com várias concentrações de gemcitabina, respectivamente. Os resultados do ensaio de MTS revelou que a capacidade de proliferação de células siTM4SF1 foi menor do que a de células siControl após tratamento com gemcitabina. (C) Após 72 horas, a percentagem de células com teor de ADN sub-G0 /G1 foi identificado por meio de FACS. TM4SF1 silenciamento resultou no aumento da sensibilidade das células para o tratamento com gemcitabina, resultando em aumento da taxa de apoptose. (Colunas, meios para três experiências;. Bares, desvio padrão * P . 0,05 versus controlo).

TM4SF1 regula a expressão de genes de resistência a múltiplas drogas em células de câncer de pâncreas

in vitro

a multirresistência (MDR) genes contribuem para gemcitabina sensibilidade em células de câncer de pâncreas. O ABCB1, ABCC1, ABCC3 e ABCC5 são genes MDR bem caracterizados. Em AsPC-1, Mia PaCa-2 e PANC-1 linhas celulares, as expressões de ARNm de ABCB1 e ABCC1 foram significativamente menores após o silenciamento TM4SF1 utilizando RT-PCR quantitativo (figura 3).

Dados

RT-PCR quantitativo mostrando dobre mudanças no nível de mRNA de genes ABCB1 e ABCC1 depois silenciando TM4SF1 em AsPC-1, MIA PaCa-2 e PANC-1 linhas celulares.

TM4SF1 silenciamento aumenta a sensibilidade das células do cancro do pâncreas o crescimento induzido por gemcitabina

in vivo

Para analisar melhor a influência de TM4SF1

in vivo

, nós transfectadas MIA PaCa-2 com níveis relativamente altos de expressão TM4SF1 endógena com shRNA constrói para reduzir de forma estável expressão TM4SF1. Verificamos shRNA silenciamento utilizando RT-PCR quantitativo e Western blotting e observou-se que a expressão de ARNm TM4SF1 diminuiu mais de 80% com shTM4SF1 # 1 (Figura 4A). Em seguida, analisamos os efeitos do silenciamento de forma estável TM4SF1 em tumores pancreáticos desenvolvidos em ratinhos imunodeficientes. tumores ortotópicos foram desenvolvidos com MIA células PaCa-2 expressando estavelmente shControl ou shTM4SF1 e foram monitorados utilizando a imagem de bioluminescência não invasiva. As células que carecem TM4SF1 desenvolvido tumores a um nível semelhante como controlos. No entanto, o tratamento com gemcitabina teve quase nenhum efeito sobre os grupos shControl-transfectadas destas células altamente resistente gemcitabina, mas depois de silenciamento TM4SF1 nestas células, à base de tratamento gemcitabina resultou em volumes tumorais significativamente inferiores (FIG 4B). Apoiando a sensibilização das células MIA PaCa-2 para o tratamento com gemcitabina por silenciamento de TM4SF1, análise PCNA (Figura 4C) indicou significativamente menor proliferação de tecidos com TM4SF1 silenciadas e tratados com gemcitabina do que a de todos os outros tecidos (Tabela 1).

quantitativa de RT-PCR e transferência de western mostrou que o silenciamento de TM4SF1 em MIA PaCa-2 estavelmente transfectada com shControl ou shTM4SF1. (B) tumores induzidos por células MIA PaCa-2 que expressam estavelmente shControl ou shTM4SF1 e expressando o gene da luciferase desenvolvidos em ratinhos nus. No final da experiência, os animais foram analisados ​​utilizando imagiologia bioluminescente. Os pesos dos tumores induzidos por células MIA PaCa-2 que expressam estavelmente shRNA com ou sem gemcitabina (100 mg /kg) de tratamento nos pesos tumorais mice.The nus (g) de shCtrl, shCtrl + GEM, shTM4SF1 e shTM4SF1 + GEM foram de 0,934 ± 0,132, 0,792 ± 0,101, 0,750 ± 0,149 e 0,398 ± 0,080. TM4SF1 silenciamento por gemcitabina resultou em marcadamente mais baixos do que os pesos dos tumores nos ratinhos de controlo (* p 0,05). (C)

In vivo

proliferação foi medida por ensaio PCNA em secções de parafina de shControl e shTM4SF1 animais tratados com gemcitabina. A imagem representativa com uma ampliação de × 200 indicando a proliferação celular é mostrado.

Discussão

Ambos metástase e chemoresistance foram associados à menor sobrevida dos pacientes com câncer. Pesquisas investigado que TM4SF1 como tetraspaninas atravessando a membrana pode ser associado com o microdomanin enriquecido-tetraspaninas (TERMO) na membrana plasmática, desempenhando um papel na organização da integridade da membrana dos receptores de integrinas, incluindo a afectar a adesão celular, a migração e a metástase. TM4SF1 também foi localizada em vesículas intracelulares e foi direccionada para organelos endocíticas final através de uma via biossintética de influenciar a motilidade celular [13, 23]. A imunoterapia com base em anticorpo L6 conseguido remissões parciais em doentes com cancro da mama metastático. Vários estudos mostraram que TM4SF1 foi sobre-expresso em células endoteliais vasculares de tumor humano e TM4SF1-anticorpo foi selectivamente direccionada para células endoteliais dos vasos sanguíneos do tumor e células de tumor com pouca toxicidade. TM4SF1 afectada maturação vascular e interagiu com as integrinas para induzir a migração de células endoteliais e as interacções célula-célula [24-27]. O grupo de Jaminet investigados novos métodos para anticorpos comuns tais como 8G4 com drogas citotóxicas pode ser esperado para tratar com tumoral e angiogénese de tumores [28]. A pesquisa anterior revelou que TM4SF1 foi envolvida no desenvolvimento de cancro e as células do pâncreas inibiu a migração e invasão [29, 30]. No entanto, era desconhecido se TM4SF1 contribuiu para chemoresistance de gemcitabina no PDAC.

Por isso, nós nos concentramos sobre o papel do TM4SF1 no adenocarcinoma do pâncreas, observando os efeitos de silenciamento deste gene no agente quimioterápico

in vitro Comprar e

in vivo

. Em nosso estudo, nós fornecemos a evidência de que TM4SF1 foi mais altamente expresso em linhas de células pancreáticas que no epitélio normal, pâncreas células (HPDE) e resistência gemcitabina em células de câncer de pâncreas poderia resultar da expressão de TM4SF1. Silenciamento TM4SF1 diminuiu a capacidade de proliferação de células, as células de apoptose aumentada e parcialmente revertida a quimiorresistência de gemcitabina em AsPC-1, Mia PaCa-2, PANC-1 e linhas de células. trabalhos anteriores investigados que chemoresistance em células de câncer de pâncreas foi através de regular a expressão de genes MDR incluindo ABCB1, ABCC1, ABCC3 e ABCC5 [9]. Então, nós avaliamos se TM4SF1 induzida as expressões de genes MDR para afetar a sensibilidade gemcitabina em células de câncer de pâncreas. Depois de silenciamento TM4SF1, as expressões de dois transportadores ABC (ABCB1, ABCC1) genes diminuiu significativamente em AsPC-1, Mia PaCa-2, e as células PANC-1, que apresentou provas de que TM4SF1 pode ser correlacionada com os genes MDR para regular a resistência gemcitabina.

In vivo

, tumores ortotópicos foram desenvolvidos com células MIA PaCa-2 expressando shControl ou shTM4SF1 nos ratinhos imunodeficientes, que foram monitorados utilizando a imagem de bioluminescência não invasiva. Descobrimos que o silenciamento TM4SF1 poderia aumentar a sensibilidade de células MIA PaCa-2 para o crescimento induzido por gemcitabina. Além disso, a análise mostrou que PCNA a proliferação de tecidos com TM4SF1 tanto silenciadas e tratados com gemcitabina foi menor do que a de todos os outros tecidos. Estes achados sugerem que TM4SF1 poderia ser um alvo potencial chemoresistance para câncer de pâncreas.

Aqui, nós fornecemos primeira evidência de que TM4SF1 mediada resistência gemcitabina via regulação MDR genes expressão. Estudos descobriram que os genes MDR induzida células cancerosas para adquirir quimiorresistência através afectar o efluxo de drogas anti-cancro a partir de células e concentrações decrescentes de drogas intracelulares [31]. Portanto, mais esforços devem ser feitos para superar MDR e investigar novas terapias moleculares como a terapia genética. No câncer de pâncreas, pesquisas mostraram que as proteínas de MDR foram frequentemente expressa e afetou a sensibilidade quimioterapia e benefício em pacientes com cancro do pâncreas avançado [32-34]. Outra pesquisa sugeriu que o gefitinib reverteu a expressão da MDR e restaurada a quimiossensibilidade de resistência em linhas celulares BxPC-3 através da via de sinalização /ERK RAF1 [35]. MUC1 foi uma glicoproteína ligada à membrana, que sobre-expresso em PDAC para aumentar quimiorresistência de gemcitabina e etoposido. No mecanismo, MUC-1 induziu a expressão de uma via de sinalização ABCC1 independente de AKT e particularmente que foi directamente relacionada com a região promotora do gene ABCC1, indicando que a MUC1 pode actuar como um regulador da transcrição [9] .Further mecanismo regulador de TM4SF1 e MDR poderia ser estudada sobre a resistência a drogas quimioterapêuticas em PDAC.

Além disso, TM4SF5, outro membro da família de quatro transmembranar-domínio, foi observada a ser altamente expresso em tecidos de cancro do fígado e células humanos. Estudos em que o câncer sugeriu que TM4SF5 poderia aumentar p27

expressão KIP1 e fosforilação e levar a transição epitelial-mesenquimal (EMT) para mediar tumorigênese, metástase e resistência gefitinib [36-39]. serão necessários mais estudos para entender as relações entre os diferentes membros da família de quatro transmembrana-domínio.

Em conclusão, nosso estudo descreveu que silenciamento de TM4SF1 sensibilizados células de câncer pancreático via downregulating ABCB1 e ABCC1 para matar por tratamento com gemcitabina pode ser de particular importância translacional. Estes dados sugerem que a infra-regulação da expressão TM4SF1 pode ser de benefício clínico no tratamento do cancro pancreático. Os futuros esforços devem ser dedicados a compreensão dos mecanismos e vias envolvidas nos efeitos da expressão TM4SF1 em chemoresistance de câncer pancreático.

Informações de Apoio

S1 Fig. RT-PCR, os resultados da análise que demonstram o silenciamento de TM4SF1 em AsPC-1, linhas de células MIA PaCa-2 e PANC-1. Of the linhas de células foram transfectadas transientemente com siControl ou siTM4SF1, e o ARNm foi isolado a partir deles ao fim de 48 horas.

doi: 10.1371 /journal.pone.0144969.s001

(PDF)