Abstract

Objectivo

O cancro do pulmão continua a ser principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. desregulação do ciclo celular desempenha um papel importante na patogênese da não-pequenas células Lung Cancer (NSCLC). Cdc25A representa um regulador do ciclo celular crítica que aumenta a progressão do ciclo celular. Neste estudo teve como objetivo investigar o papel de um romance Cdc25A variante da transcrição, Cdc25A

Q110del, sobre a regulação da proteína Cdc25A, e seu impacto no prognóstico de pacientes com NSCLC.

Metodologia /PRINCIPAIS CONCLUSÕES

Aqui nós relatamos uma variante Cdc25A transcrição romance com códon 110 (Glutamina) exclusão, que denominou Cdc25A

Q110del em células NSCLC. Em 9 (75%) das 12 linhas celulares de NSCLC, Cdc25A

expressão Q110del responsável por mais de 20% dos transcritos Cdc25A. Os efeitos biológicos de Cdc25A

Q110del foram investigados em células H1299 e HEK-293F utilizando radiação UV, citometria de fluxo, tratamento ciclohexamida, e microscopia confocal. Em comparação com Cdc25A

em peso, Cdc25A

proteína Q110del teve maior semi-vida; células que expressam Cdc25A

Q110del foram mais resistentes à radiação UV e mostraram mais atividade mitótico. TaqMan-PCR foi utilizada para quantificar Cdc25A

os níveis de expressão Q110del em 88 tumores NSCLC primária pares de tecido /normais. Em pacientes com NSCLC, as curvas de Kaplan-Meier mostrou tumores que expressam níveis mais elevados de Cdc25A

Q110del em relação aos tecidos pulmonares adjacentes têm sobrevida global significativamente inferior (

P

= 0,0018).

significado

Aqui nós identificamos Cdc25A

Q110del como uma nova variante da transcrição do Cdc25A em NSCLC. A natureza específica da sequência da anormalidade poderia ser um indicador de prognóstico em pacientes com NSCLC, bem como um alvo candidato para futuras estratégias terapêuticas

citação:. Yunis RH, Cao W, Lin R, R Xia, Liu Z, Edelman MJ, et ai. (2012) Cdc25A

Q110del: Um celular Novel Division Cycle 25A de isoformas expressão aberrante em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (10): e46464. doi: 10.1371 /journal.pone.0046464

editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de junho de 2012; Aceito: 30 de agosto de 2012; Publicação: 05 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Younis DDS, MDS, PhD, et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiado em parte pelo NIH concede R01 CA126818 e R01 CA136635. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro do pulmão continua a ser a principal causa de malignidade. mortes relacionados com todo o mundo apesar dos avanços em modalidades terapêuticas [1]. Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) é o tipo mais comum de câncer de pulmão e é o resultado de alterações moleculares acumulados levando a desregulamentação de vários processos celulares, incluindo controle do ciclo celular [2]. Em NSCLC, vários reguladores do ciclo celular que desempenham um papel fundamental no controlo do ponto de verificação do ciclo celular são alterados, o que permite que as células cancerosas ignorar diferentes pontos de verificação, especialmente em G1 /S e G2 /M e subsequente proliferação celular descontrolada [3] – [ ,,,0],7].

25A ciclo de divisão celular (Cdc25A) é um membro da família das fosfatases específicas CDC25 dupla e desempenha um papel fundamental na progressão do ciclo celular [8], [9]. funções Cdc25A para remover os fosfatos inibidores de resíduos de treonina e tirosina nos sítios de ligação a ATP de CDKs, promover a progressão do ciclo celular [10], [11]. Cdc25A é também um alvo a jusante da via de checkpoint de Chk1 mediada: activação de Chk1 por ADN alvos condições prejudiciais Cdc25A para a degradação de proteassoma, o que impede que as células com anormalidades cromossómicas de progredir através do ciclo celular [10], [12], [13]. Enquanto CDK1 desempenha um papel crítico para a estabilização Cdc25A durante a mitose [8], [10], [11]. Cdc25A é frequentemente sobre-expresso em cancros, incluindo NSCLC. Esta sobre-expressão está associado com um comportamento clínico mais agressivo e sobrevivência inferior [7], [8], [12] – [19]. Embora Cdc25A tem sido extensivamente estudado para o seu papel na progressão tumoral e como um alvo potencial para o tratamento do cancro, os mecanismos de Cdc25A sobre-expressão em cancro continua a ser investigado [12]. Alguns estudos têm mostrado que a sobre-expressão de Cdc25A em cancros poderia resultar de desregulações pós-transcricional [20], tais como a sobreexpressão de hidrolase DUB3 ubiquitina [21], a inactivação de glicogénio sintase quinase-3beta (GSK-3beta), que fosforila Cdc25A para promover a sua proteólise nas fases do ciclo celular precoce [22], a activação de LIN28A que regula a expressão Cdc25A inibindo a biogénese de deixá-7 miARN [23], e microARN-21, que regula negativamente a Cdc25A, de modo que as suas sub-expressão resulta em Cdc25A sobreexpressão no câncer de cólon [24].

Aqui nós relatamos a identificação de um romance, alternativamente, dividida isoforma Cdc25A que resultou na eliminação de códon 110 denominado Cdc25A

Q110del. Mostramos que Cdc25A

Q110del é expressa em níveis elevados em 75% das linhas celulares de NSCLC. Cdc25A

proteína Q110del apresentaram maior estabilidade e distribuição mais nuclear. As células que expressam elevado nível de Cdc25A

Q110del foram mais resistentes à radiação UV. Em pacientes com NSCLC, mais elevados níveis Cdc25A

Q110del nos tumores foram associadas com prognóstico clínico. Nossos dados indicam que a expressão Cdc25A

Q110del é comum em NSCLC e pode desempenhar um papel na tumorigênese pulmonar e progressão do câncer.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

HEK293 e células NSCLC foram obtidas de ATCC (Manassas, VA) e mantidas em DMEM – 5% de soro fetal de bovino. Imortalizadas linhas epiteliais brônquicas humanas celulares (HBEC), HBEC2, HBEC3, HBEC4 e HBEC5 (presente de Drs. John Minna e Jerry Shay, da Universidade do Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas) [25], foram mantidas em sérica de queratinócitos livres (KSF) meio com factor de crescimento epidérmico humano recombinante (RegF) e extracto de pituitária bovina (Invitrogen, Carlsbad, CA). transfecção de plasmídeo foi realizada utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen).

Western Blotting

As células foram colhidas em tampão RIPA com inibidor de protease (Roche Bioscience), e separadas por SDS-PAGE. Os anticorpos primários contra Cdc25A (clones 144 e F-6), p34 cdc2 (H-297), Chk1, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, CA), fosfo-Chk1 (Ser345) (Cell Signaling Biotecnologia, Danvers, MA), fosfo- CDK1 (Tyr15) (Calbiochem EMD Chemicals Inc, Gibbstown, NJ) foram usadas. NE-PER kit extração de proteínas (Pierce Biotech, Rockford, IL) foram utilizados para fracionar citosólica e proteínas nucleares. Ciclo-hexamida (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi reconstituída em DMSO.

extracção de ARN, transcrição reversa e PCR em tempo real

O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol, e convertido para ADNc utilizando o kit de SuperScript III Síntese da primeira cadeia (Invitrogen). ADNc Cdc25A comprimento completo foi amplificado utilizando iProof de alta-fidelidade de DNA polimerase (Bio-Rad, Hercules, CA), e clonado em pEF6 /V5 de His (Invitrogen, Carlsbad, CA) ou pEGFP-N1 (Laboratórios Clontech, CA) para a verdadeira normalização reacções de PCR em tempo, a radiação UV, tratamentos CHX, análise de sequências e de restrição de digestão de enzima, pEGFP-N1 fundido com EGFP ou m-cereja foi utilizado para a análise de imagens e de citometria de fluxo ou onde indicado Todas as manipulações de DNA foram realizadas em nível de segurança biológica 1 ou 2 laboratórios.

Para quantificar o total de Cdc25A transcrição, em tempo real ensaio de PCR foram montados utilizando o iniciador de sentido directo 5′-GCTCCTCCGAGTCAACAGAT -3 ‘, o iniciador inverso 5′-TGGACTACATCCCAACAGCTT-3’, e FAM ™ sonda marcada com corante 5 ‘-ATTCTCCTGGGCCATTGGACA-3’; para quantificar a transcrição de tipo selvagem Cdc25A, o ensaio foi montado utilizando o iniciador para a frente 5 ‘-GCTCCTCCGAGTCAACAGAT -3′, 5’-ACTACATCCCAACAGCTTCTG- iniciador 3 ‘e uma sonda marcada com corante FAM ™ 5′-ATTCTCCTGGGCCATTGGACA-3’ reverso. O ensaio foi realizado em triplicado com TaqMan Universal PCR rápida Master Mix (Applied Biosystem, Carlsbad, CA) no sistema real rápida Applied Biosystem 7900HT Time PCR. Em todas as reacções, ensaio TaqMan rápida GAPDH VIC sonda marcada com corante foi adicionado como controlo ARN de carregamento.

Quando a expressão total de Cdc25A é designado como o gene de referência endógena, a abundância de Cdc25A

Q110del pode ser calculado como ΔCt = Ct

wt-Ct

tot. Assim, a abundância relativa de CDC25

em peso no tumor emparelhado contra o tecido normal é calculado por 2

-ΔΔCt método, onde ΔΔCt = ΔctTumor- ΔctNormal (Boletim Usuário # 2 Biosystem Aplicada). Se os níveis de Cdc25A expressão

Q110del e CDC25

em peso são iguais no tumor correspondente e o tecido de pulmão normal adjacente, o valor abundância relativa calculada será 1. Um valor de 1 indica que o tumor expressa um nível mais elevado de Cdc25A

Q110del do que o tecido pulmonar normal emparelhado. Por outro lado, um valor de . 1 indica que o tecido pulmonar normal expressa um nível mais elevado de Cdc25A

Q110del do que o tumor emparelhado

A análise de sequências e com enzimas de restrição de digestão

clones de DNA foram sequenciadas em da Universidade de Maryland, Baltimore serviço de sequenciação ou Genewiz Inc., (South Plainfield, NJ). O alinhamento foi realizado contra referência Cdc25A NM_001789. Os clones de ADNc utilizadas para os ensaios funcionais foram amplificados a partir de linhas celulares de NSCLC (Tabela S1). Para a análise de digestão enzimática, um fragmento de 292 pb de ADNc Cdc25A foi amplificado utilizando os iniciadores: 5′-transmitir CACTGGAGGTGAAGAACAACAG-3 ‘e inverso 5′-CAGCCACGAGATACAGGTCTTA-3’, digerido com a endonuclease de restrição Bpu10I (New England Biolabs, Ipswich, MA) em seguida, separados em gel de agarose.

irradiação UV

Para o tratamento de UV de células de cultura, o meio foi removido, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato e em seguida irradiado no descoberto pratos de cultura de tecidos com 254 nm, luz UV (UVC) em Stratalinker UV Crosslinker (Stratagene, La Jolla, CA). meio de cultura fresco foi adicionado de volta, e as células foram incubadas durante mais nos pontos de tempo descritos.

análise do ciclo celular

As células foram colhidas, fixadas em etanol a 70%, suspensos em tampão de coloração de PI /RNase (BD Pharmingen ™, San José, CA) contendo 0,1% de citrato de sódio e 0,1% de Triton X-100. A análise dos dados foi feita em University of Maryland Baltimore Medical Center, citometria de fluxo Core e analisados ​​com software FlowJo.

análise de imagem

As células que expressam Cdc25A

em peso ou Cdc25A

Q110del- fundido com mCherry ou EGFP foram fixadas em 2% de paraformaldeído, permeabilizadas com 0,5% tritonX-100, corados com DAPI. As imagens foram capturadas usando uma Zeiss LSM 510 Meta Laser Scanning Confocal Microscópio com DAPI, FITC e ver principais Rodamina. O representante histograma da expressão FITC e rodamina foi produzido usando

imagem J

software.

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi medida usando o celular Proliferação Reagente WST-1 ( Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN).

pacientes e tecidos

os tumores primários de NSCLC e seus correspondentes tecidos pulmonares adjacentes não-malignas de 88 indivíduos com estágio patológico I a III NSCLC foram avaliados. Todos os pacientes foram tratados com cirurgia sozinha, exceto aqueles com estágio da doença IIIa que também pode ter recebido radioterapia pós-operatória e quimioterapia adjuvante, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center (MDACC) de 1995 a 2000. As amostras foram imediatamente congelados e armazenados a -80 ° C. A selecção dos pacientes baseou-se na disponibilidade de tumor fresco arquivado e tecidos pulmonares normais correspondentes para os investigadores. As informações clínicas e informações de acompanhamento para o estudo foram baseados em revisão de prontuários e formar os relatórios de serviço de registro tumor MDACC. O consentimento informado para a utilização de tecidos ressecados residuais para a pesquisa foi obtido de todos os pacientes incluídos no estudo.

declaração Ética

consentimento informado por escrito para usar tecido ressecado residual para a pesquisa foi obtido de todos pacientes incluídos no estudo. O processo de aprovação e o uso dessas informações materiais e clínico foi revisto e aprovado pela comissão de vigilância Universidade do Texas MDACC.

A análise estatística

Student

foi utilizado t

-test para análise estatística dos ensaios funcionais. análise de sobrevida curvas de Kaplan-Meier foram gerados com a análise de log rank utilizando Proc Lifetest no SAS 9.2. Todos os testes são dois lados e P valores 0,05 é considerado estatisticamente significativa

Resultados

Identificação de Cdc25A

Q110del em NSCLC

Para investigar possíveis alterações de. Cdc25A ao nível do mRNA, que sequenciados clones de ADNc Cdc25A derivados de um painel de 10 linhas celulares de NSCLC. Do total de 16 clones de ADNc a partir das linhas de células 10, observou-se uma deleção específica trinucleótido em 7 dos 16 clones a partir de cinco das linhas celulares de 10 (Fig. 1A) (Tabela S1). A supressão localiza nas posições 328-330 em referência a NM_001789.2, Cdc25A transcrição 1, no qual se prevê uma deleção glutamina no codão 110 (Fig. 1B). Este resíduo de aminoácido está situado dentro do domínio de regulação de Cdc25A, e é conservada entre várias vertebrados (Fig. 1C e D). Denominamos o romance isoforma Cdc25A com códon 110 exclusão como Cdc25A

Q110del. Esta eliminação é provavelmente um resultado de splicing de RNA alternativo, uma vez que qualquer alteração da sequência de ADN genómico foram encontrados nas linhas celulares de NSCLC (dados não apresentados) (Fig. 1E) Para confirmar a presença de Cdc25A

Q110del em linhas de células NSCLC e tecidos de tumores NSCLC primária, examinámos ADNc a partir de 4 linhas de células NSCLC e NSCLC 5 tecidos tumorais primários usando a digestão com endonucleases de restrição por Bpu10I, que podem clivar a sequência 5′-CCTNAGC, um local único na Cdc25A

sequência Q110del, para produzir um menor banda de DNA clivada. Todas as amostras apresentaram a banda DNA clivada mais curto, com diversas densidades (Fig. S1).

A. sequência de ácido nucleico de eliminação triplicado Cdc25A-CAG (328-30) em linhas celulares de NSCLC. B. Cdc25A-CAG (328-30) se traduz em Q110 deleção (Cdc25A

Q110del). C. aminoácidos Q110 de Cdc25A é evolutiva conservada em outros organismos. D. Q110 reside no domínio de regulação, mais próximo ao local CDK1 estabilização mitótico fosforilação (S116) e o site degradação fosforilação Chk1 (S124). Vermelho: CAG (328-30) eliminação de ácidos nucleicos e Q110 aminoácido correspondente, sombra: sítios de fosforilação de serina (S116 e S124). E. Ilustração esquemática do local de splicing alternativo sugerido. local dador alternativa: um 5 ‘junção de processamento (local dador), mudando a 3’ fronteira do exão a montante, deve produzir a Cdc25A

em peso transcrito, enquanto que um local aceitador de alternativa: um 3 ‘junção de processamento (local aceitador), mudando limite a 5 ‘do exão jusante, produziria o Cdc25A

Q110del transcrição.

a seguir, concebeu um real-time PCR (Fig. 2A) para avaliar a quantidade de Cdc25A

Q110del entre o total de transcritos Cdc25A em linhas de células NSCLC e amostras de tecido, para demonstrar que o ensaio pode medir quantitativamente a abundância relativa das isoformas de Cdc25A, construiu-se uma curva de Ct utilizando ADN de plasmídeo purificado contendo quer Cdc25A

em peso ou Cdc25A

cDNA Q110del inserir. O resultado mostrou uma relação quase linear com diferente tipo selvagem e proporção Q110del (Fig. 2B) .Este método foi então usado para avaliar Cdc25A

Q110del expressão em linhas celulares e tecidos. Em 4 linhas celulares HBEC, Cdc25A

expressão Q110del era detectável mas em geral, menos do que 20% do total das transcrições Cdc25A (Fig. 2C). Deve notar-se que estas linhas celulares foram derivadas de células bronquiais epiteliais humanas imortalizadas de pacientes com cancro do pulmão. Em comparação, 9 (75%) das 12 linhas de células NSCLC expressa Cdc25A

Q110del maior do que 20% do total das transcrições Cdc25A incluindo três (20%) das linhas celulares expressavam Cdc25A

Q110del a nível quase 50% (Fig. 2C). A diferença de Cdc25A

Q110del níveis de expressão entre as linhas celulares HBEC e as linhas celulares de NSCLC foi estatisticamente significativo (

P

= 0,003). Curiosamente, o H596 e H549 as linhas celulares que mostram Cdc25A

Q110del em 50% do total de Cdc25A, tem um número cromossómico modal alta numa elevada percentagem, NCI-H596 número modal = 71; range = 65 a 75.This é uma linha celular humana triploid próximo. Enquanto A549 é uma linha celular humana hypotriploid com o número modal de cromossomas de 66, que ocorre em 24% de células (de acordo com a “American Type Culture Collection”). Isto sugere Cdc25A

Q110del a desempenhar um papel na instabilidade genômica e alterações malignas cumulativas [26]. A correlação entre Cdc25A acumulação

Q110deland de células hiperplóides é descrito abaixo na distribuição do ciclo celular.

A. ensaio de PCR em tempo real para avaliar a quantidade de Cdc25A

Q110del em relação ao total de transcritos Cdc25A em linhas de células NSCLC e amostras de tecido, o “total” ensaio de PCR em tempo real, determina molde Cdc25A total na reacção (Ct

tot ), enquanto o ensaio de “peso” real time-PCR determina o gene alvo que é o Cdc25A

wt modelo (Ct

em peso), em seguida, calcular o Cdc25A

Q110del = ΔCt = (Ct

em peso Ct

tot). curva B. Padrão ilustrando valores Ct correspondentes a diferentes proporções de Cdc25A

peso: Cdc25A

Q110del, pEF6-V5-His-Cdc25A

em peso e pEF6-V5-His-Cdc25A

Q110del foram incorporados juntos em vários índices como modelo em cada tempo real reação de PCR Uniplex, feitas em triplicado, então a Q110del Cdc25A

calculada (Cdc25A

Q110del = ΔCt = Ct

wt-Ct

tot). C. 50% de NSCLC a mostrar Cdc25A

Q110del valores que correspondem a 30-50% do total de modelos Cdc25A em referência à curva padrão (B), enquanto que as linhas celulares expressam HBEC ~ 20% do total de modelos Cdc25A (

P

= 0,003).

Cdc25A

estabilidade da proteína e célula de sobrevivência Q110del

Cdc25A é uma proteína lábil, fortemente regulada através de vários eventos de fosforilação na sua domínio regulador [8]. Para investigar o efeito da eliminação Q110 sobre o destino da regulação da proteína Cdc25A, testamos a taxa de degradação da Cdc25A

Q110del usando tratamento ciclohexamida (CHX). Em células H1299 tratadas com CHX, observou-se que Cdc25A

Q110del tem uma meia-vida mais longa em comparação com Cdc25A

em peso (Fig. 3A). Além disso, quando Cdc25A

em peso e Cdc25A

Q110del foram co-transfectadas, mais Cdc25A

Q110del foi acumulados que Cdc25A

em peso a 72 h após a transfecção (fig. S2) em ambos H1299 e 293F células.

A. Tempo ciclohexamida curso (50 ug /ml) tratamento de células H1299 transfectadas com pEGFPN1-Cdc25A

em peso ou pEGFPN1-Cdc25A

QDEL em condições não perturbados mostraram aumento da meia-vida de Cdc25A

Q110 (-15 minutos) versus Cdc25A

em peso. radiação UV B. seguido de 30 minutos de incubação de 293F células em 37 ° C, Cdc25A

Q110del mostrou maior estabilidade em comparação com Cdc25A

em peso. células C. 293F plaqueadas a densidade de células igual e transfectadas com igual quantidade de EGFP rotulados Cdc25A

Q110del ou Cdc25A

em peso. Após 72 horas de transfecção, citometria de fluxo análise gating número igual de EGFP células para cada isoforma expressar. Histograma mostra a intensidade de expressão de Cdc25A

Q110del-EGFP (média de 59,2) versus Cdc25A

wt-EGFP (média de 40,5) (t-test

P

= 0,05). D. A mesma população de células fechadas para expressão EGFP-Cdc25A foi estudada para a distribuição do ciclo celular. O Cdc25A

wt-EGFP mostrou a prender na fase pós G2 ( G2 /M) em relação ao controle (p = 0,055). Os EGFP-Cdc25A

Q110del células que expressam apresentaram menor acúmulo de população de células hiperplóides no fase G2 /M e acelerou as células mais através de mitose em comparação com o EGFP-Cdc25A

wt células que expressam (p = 0,0047). E. ensaio de viabilidade celular de H1299 expressar Cdc25A

em peso contra Cdc25A

Q110del após 24 h de várias doses de radiação UV. Cdc25A

Q110del expressão resgatado sensibilidade H1299 à radiação UV em relação ao grupo controle.

Em 293F células transfectadas com qualquer Cdc25A

em peso ou Cdc25A

Q110del e tratadas com 10 e 20 J /m

2 radiação UV, as células transfectadas com Cdc25A

Q110del mostrou uma estabilidade aumentada da proteína de 30 min depois da irradiação UV, mas não as células transfectadas com Cdc25A

em peso (Fig. 3B).

Para obter uma medição mais quantitativa de Cdc25A

Q110del e Cdc25A

em peso níveis, medimos a intensidade de fluorescência de proteínas de fusão Cdc25A-EGFP gating igual número de células 293F expressar Cdc25A

wt-EGFP ou Cdc25A

Q110del-EGFP e observou um nível significativamente mais elevado de intensidade de fluorescência na Cdc25A

células Q110del-EGFP transfectadas (Fig. 3C). A análise do ciclo celular da mesma população fechado de células, mostraram aumento da população pós G2 (células hiperplóides) do Cdc25A

wt-EGFP expressando células em comparação com o Cdc25A

Q110del-EGFP, enquanto o Cdc25A

Q110del -EGFP acelerou as células mais durante a fase de pós G2 (mitose) em comparação com o Cdc25A

em peso (p = 0,0047) (Fig. 3D). Isto sugere que o Cdc25A

Q110del pode revogar a ponto de controlo G2 /M em comparação com o Cdc25A

em peso, dirigir as células mais através de mitose [26], [27].

Para investigar se o Cdc25A

Q110del pode afectar a sobrevivência de células NSCLC em condições perturbadas, as células H1299 transf ectadas com Cdc25A

Q110del foram tratados com radiação de UV a diferentes doses, H1299 expressa Cdc25A

Q110del foram mais resistentes à morte celular induzida por UV em comparação para as células transfectadas com o vector de controlo ou Cdc25A

em peso, particularmente em doses elevadas UV (Fig. 3E).

localização celular e atividade mitótica de Cdc25A

Q110del

células H1299, Cdc25A

Q110del mostrou aumento considerável na localização nuclear do que Cdc25A

peso (Fig. 4A). 24 horas após a irradiação UV, as células transfectadas com Cdc25A

Q110del apresentaram maior estabilidade da proteína ainda que o aumento da fosforilação da resposta a danos no ADN a montante (DDR) marcador pChk1-ser345 (Fig. 4B). À medida que novas evidências apontam Cdc25A como um membro da família CDC25 necessária para a ativação completa de CDK1 nuclear [11], [28], [29], e desde Q110del está mais próximo S116 – o site CDK1 fosforilação crítica para estabilizar Cdc25A em um loop de feedback durante mitose – [11], além de nossos resultados que mostraram a Cdc25A

Q110del para dirigir as células mais através de mitose em comparação com o Cdc25A

peso (Fig. 3D), nós lidos para investigar o efeito de Cdc25A

Q110del na actividade mitótica e na activação CDK1. Após transfecção 293F células com Cdc25A

Q110del-EGFP, observou-se um aumento na proporção de células em fase mitótico, um fenômeno que não foi visto nas células transfectadas com Cdc25A

wt-EGFP (Fig. 4C). Em comparação com as células transfectadas com Cdc25A

wt-EGFP, as células transfectadas com Cdc25A

Q110del-EGFP mostrou um nível mais baixo de fosforilação no CDK1- Tyr15, 24 horas após a transfecção (fig. 4D), o que é consistente com a presença de mais activo CDK1 para promover G2 /M de transição de fase (Fig. 3D). A diminuição do total de CDK1 na Cdc25A

em peso e Cdc25A

Q110del células-comparado transfectadas com o controle- é esperado, desde a prisão, no G2 do ciclo celular /fase M (Fig. 3D), pode causar repressão da expressão CDK1 no nível da transcrição em um tempo e forma dependente tipo de célula [30].

a. Immunoblot de H1299 células mostraram Cdc25A

Q110del para localizar mais no núcleo em comparação com o Cdc25A

em peso. B. 24 horas após a irradiação UV, Cdc25A

Q110del mostrou mais estabilidade no H1299 e se correspondeu com mais fosforilação de DDR marcador Chk1-ser345. C. microscopia confocal de células 293F após 24 horas de transfecção: Cdc25A

Q110del expressão mostrou figuras de mitose frequentes (metafásicas “setas finas”). Co-expressão de Cdc25A

em peso e Cdc25A

Q110del em (01:01) ratio, atividade mitótica ainda foi notado (citocinese, “setas corajosas”). O histograma é representativa do número de pixels para a FITC por condição e a rodamina. D. pCDK1-Tyr15 desfosforilação como leitor de jusante para o aumento da atividade da fosfatase relativa de Cdc25A

Q110del comparação com Cdc25A

peso após 24 horas de transfecção em 293F células.

Cdc25A

Q110delexpression em NSCLC e sua associação com parâmetros clínicos

para determinar se existe um potencial impacto de Cdc25A

expressão Q110del em tumores de pacientes com NSCLC, quantificamos Cdc25A

expressão Q110del nos tumores primários e os seus tecidos pulmonares pares adjacentes de 88 pacientes com NSCLC. Cdc25A

expressão Q110del variou de indetectável para fechar a 100% do total das transcrições Cdc25A nos tumores, com 50% dos tumores que expressam Cdc25A

Q110del em excesso de 20% entre os transcritos totais Cdc25A. Curiosamente, muitos dos tecidos pulmonares normais adjacentes dos mesmos pacientes de câncer de pulmão também expressou Cdc25A

Q110del, sugerindo que este é um evento precoce na carcinogênese de pulmão.

Em seguida, analisamos a associação entre os níveis de expressão Cdc25A

Q110del no tecido tumoral e parâmetros patológicos clínicos. Exceto por uma associação marginal com histologia de adenocarcinoma (

P

= 0,068), nenhuma outra associação foi observada (Tabela S2 e S3). Especificamente, não houve associação com o estádio, sexo ou história de tabagismo. No entanto, os pacientes cujos tumores tinham maiores Cdc25A

níveis de expressão Q110del demonstrou uma tendência não significativa para a sobrevida global mais pobre (

P

= 0,074 pelo teste Log-rank) (Fig 5A;. Tabela S2). Curiosamente, quando se toma em consideração Cdc25A

Q110del expressão nos tecidos pulmonares normais adjacentes, observamos que os pacientes cujos tumores expressaram consideravelmente maior Cdc25A

Q110del do que os seus tecidos pulmonares normais adjacentes emparelhados apresentaram uma sobrevida global significativamente pior (

P

= 0,0018 pelo teste Log-rank) (Fig 5B;. Tabela S4 e S5)

A.. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier mostrou Cdc25A

Q110del no tecido tumoral correlacionar-se com pior sobrevida global dos pacientes com NSCLC (classificação

P

= 0,074 log). curvas B. Kaplan Meier de sobrevida mostrou que, quando Cdc25A

peso é maior no tumor contra o par de tecido normal, que correlacionada com melhor sobrevida global (log rank

P

= 0,0018). A quantificação relativa do gene alvo “Cdc25A

em peso” em NSCLC tecido tumoral relativamente ao tecido normal par de doentes com NSCLC de acordo com a fórmula: 2

-ΔΔct. template Cdc25A de tumor ou normal foi executado em triplicado de reacção Uniplex para cada um dos sub

ensaios tot

WT e Ct Ct, ea média foi calculada para cada ensaio.

Discussão

nível Cdc25A é rigidamente regulada de modo que a progressão do ciclo celular e de transição checkpoint é mantida em condições fisiológicas [20], [26], [31] – [35]. Anteriormente, relatou que Cdc25A é muitas vezes mais expressos em NSCLC ao nível da transcrição [7]. Neste estudo, relatamos a identificação de uma nova isoforma Cdc25A, Cdc25A

Q110del, resultante de um splicing de RNA alternativo. Descobrimos que Cdc25A

Q110del foi expresso na maioria das linhas celulares de NSCLC, bem como tumores primários. Além disso, a encontrar tecidos que histologicamente normais adjacentes ao câncer expressa com frequência Cdc25A

Q110del implica que este é um evento precoce e pode desempenhar uma função biológica importante na tumorigênese pulmonar.

Cdc25A

Q110del carece de um glutamina na posição 110, que é adjacente a 2 locais de fosforilação de serina conservadas nas posições 116 e 124 (Fig. 1). S116 pode ser fosforilada por Cdk1 para estabilizar Cdc25A na mitose através de um circuito fechado de realimentação positiva, enquanto S124 pode ser fosforilada por Chk1, Chk2, e MAPKAPK-2 para acelerar rotatividade Cdc25A [11], [14], [27], [36] . irradiação ionizante pode induzir a fosforilação de S124 através de Chk1 e Chk2 cinases [37], [38]. Em um modelo animal transgénico com S124 substituída por uma alanina, foi encontrado Cdc25A localizado em centrossomas e que os níveis de Cdc25A não foram reduzidos após irradiação [39] ionizante. Neste estudo, observou-se que Cdc25A

Q110del tem uma meia-vida de proteína prolongado do que Cdc25A

em peso, especialmente após a irradiação UV, o que sugere que Cdc25A

expressão Q110del pode impactar resposta celular ao dano induzido pela radiação ionizante . Consistente com esta noção, verificou-se que as células transfectadas com Cdc25A

Q110del são resistentes ao induzido por UV a morte de células do que as células transfectadas com o controlo do vector ou Cdc25A

em peso (Fig. 3E), consistente com uma activação mais profundo de Cdk1 (Fig. 4D).

Cdc25A fosfatase é regulada principalmente através de degradação de proteínas [8], [21], [31]. A fosforilação de serina ou treonina específicas por proteínas quinases, principalmente de Chk1, p38 e GSK-3β, são necessárias para a sua proteólise mediada por ubiquitina [22], [37], [40], ao passo que a fosforilação em S18 e S116 por CDK1 pode estabilizar Cdc25A [11]. Fosforilação também regula a apreensão de Cdc25A por proteína 14-3-3 [41]. Em nosso estudo, observou-se que a proteína Cdc25A

Q110del tem uma taxa de volume de negócios inferior, mesmo após a irradiação UV (Fig. 3B e 4B), e acumulação de mais nuclear. Duas possibilidades podem explicar estas observações. Em primeiro lugar, a eliminação Q110 no polipeptídeo pode produzir mudanças significativas conformacionais nas imediações e /ou região vizinha, alterando a afinidade de ligação com as suas quinases, levando a uma taxa de volume de negócios inferior Cdc25A

Q110del. Em segundo lugar, Cdc25A

proteína Q110del pode ter uma capacidade diferente para transporte entre compartimentos citoplasmáticos e nucleares através de proteínas 14-3-3 [42]. A sequência de amino ácido imediatamente precedente Q110, RRIHSLP, constituem um local de ligação consenso 14-3-3, (R) RxxSxP [43]. Dado que a ligação do 14-3-3 para o seu alvo é dependente da fosforilação e é influenciado pelo contexto de sequência, este levanta a possibilidade interessante de que uma proteína-quinase desconhecido pode fosforilar neste site e influenciar o tráfico de Cdc25A. Estes achados têm importância potencial no contexto da resistência a danos no ADN em células que expressam ectopicamente com Cdc25A

Q110del (Fig. 3E). Investigações adicionais serão necessários para determinar se os tumores com maior Cdc25A

Q110del são mais resistentes a agentes que danificam o DNA ou terapia de radiação e se alvo Cdc25A

Q110del vai sensibilizar estes tumores a estes tratamentos [44].

uma observação interessante é a expressão de Cdc25A

Q110del nos tecidos pulmonares normais adjacentes que aparecem para NSCLC, por vezes, com elevada abundância, sugerindo a anormalidade é um evento precoce durante a carcinogénese pulmonar [44].