Abstract

Fundo

receptores Toll-like (TLRs) são fatores-chave no sistema imunológico inato e iniciar a resposta inflamatória a patógenos estrangeiros, tais como bactérias, fungos e vírus. No microambiente de tumorigénese, TLR podem promover a inflamação e a sobrevivência das células. receptor de tipo Toll 2/6 (TLR2 /6) de sinalização em células tumorais é considerado como um dos mecanismos de inflamação crónica, mas pode também mediar a fuga imunitária de células tumorais e a progressão do tumor. No entanto, a expressão de TLR2 e a sua função biológica no desenvolvimento e progressão do carcinoma hepatocelular não foram investigadas. Este estudo teve como objetivo determinar a expressão de TLRs 1-10 no estabelecida linha de células de carcinoma hepatocelular humano BLE-7402, para investigar o efeito biológico de TLR2 no crescimento e sobrevivência celular.

Métodos

expressão em células de TLR BLE-7402 foi analisada por RT-PCR, PCR em tempo real e citometria de fluxo (FCM). Para investigar ainda mais a função de TLR2 em crescimento hepatocarcinoma, células BLE-7402 foram transfectadas com plasmídeos recombinantes que expressam um dos três formas de TLR2 siRNA (SH-TLR2 RNAi (A, B e C)). TLR2 knockdown foi confirmada por RT-PCR, PCR em tempo real e microscopia de fluorescência. proliferação de células de tumor foi monitorizado pelo ensaio de MTT e citoquinas no sobrenadante de células transfectadas secretado foram medidos por FCM baseadas em esferas, a função de TLR2 siARN foi também investigada in vivo.

Resultados

A linha de células BLE-7402 expressas TLRs 2 a 10 em ambos os níveis de proteína mRNA e. TLR2 foi o TLR mais altamente expresso. Enquanto todos os três siRNAs inibida mRNA TLR2 e expressão da proteína, sh-TLR2 RNAi (B) teve o efeito mais forte knockdown. TLR2 knockdown com sh-TLR2 RNAi (B) reduziu a proliferação celular. Além disso, a secreção de IL-6 e IL-8 foi também reduzida. O resultado mostrou uma redução drástica do volume do tumor em ratinhos tratados com sh-TLR2 RNAi (B).

Discussão

Estes resultados sugerem que a proliferação TLR2 knockdown inibição de células de hepatocarcinoma cultivadas e diminuir a secreção de citocinas. Sugere-se que TLR2 silenciamento pode no valor de mais investigações para a terapia genética baseada siRNA no tratamento de hepatocarcinoma

Citation:. Huang Y, Cai B, Xu M, Qiu Z, Tao Y, Zhang Y, et al. (2012) silenciamento de genes de Receptor Toll-Like 2 inibe a proliferação de células cancerosas humanas Fígado e secreção de citocinas inflamatórias. PLoS ONE 7 (7): e38890. doi: 10.1371 /journal.pone.0038890

Edição: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Recebido: 04 de janeiro de 2012; Aceito: 14 de maio de 2012; Publicação: 16 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do Jiangsu Provincial Natural Science Foundation (BK2011175). YZH é suportado por Jiangsu Provincial Natural Science Foundation (BK2011164), Programa de Pesquisa em Saúde da província de Jiangsu (X200736, X201110). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O carcinoma hepatocelular ou cancro do fígado é considerado para ser um cancro primário proveniente de células do fígado; é uma das formas mais devastadora do cancro, sobretudo na China. Atualmente, a falta de chumbo tratamento eficaz para a busca nova estratégia de tratamento, como terapias genéticas. ARN de interferência, siRNA pode ser oferecido como uma nova terapia uma vez um bom alvo é encontrado. É sugerido recentemente TLRs são expressos em muitos tumores humanos [1],

receptores semelhantes a Toll (TLRs) são uma família altamente conservadas de transmembranar de tipo I receptores que reconhecem padrões moleculares associados a agentes patogénicos específicos (PAMPs), por exemplo lipopolissacárido, ácido lipotechoic e outros componentes da parede bacteriana [1], [2], e pode também mediar a fuga imunitária de células tumorais e a progressão do tumor. TLR humanos têm um domínio citoplasmático que é homóloga ao domínio citoplasmático da interleucina humana (IL) -1 receptor [3]. Até à data, 11 TLR de mamíferos foram identificados e caracterizados.

Recentemente, uma nova pesquisa revelou que TLRs são expressos por muitos tumores humanos [2], [3], [4], [5], [6 ], incluindo o câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de mama e carcinoma hepatocelular. Embora os TLRs têm diferentes funções em diferentes células de tumor, alguns resultados indicaram que a sinalização dos TLR pode desempenhar um papel no crescimento e progressão do tumor. Por exemplo, a sinalização de TLR2 pode promover o crescimento de células de cancro do pulmão e resistência à apoptose [7], [8]; sinalização dependente de TLR3 pode levar directamente à apoptose no cancro da mama humano [6]; através de suas ações sobre metaloproteases e integrinas, TLR2 e TLR9 pode levar ao aumento da capacidade de invasão e metástase [8], [9]; TLR4 pode mediar metástase que avança activamente a invasão de células de tumor, proliferação e sobrevivência de células de cancro da próstata [10].

Toll-like receptor 2/6 (TLR2 /6) de sinalização em células tumorais é de particular interesse como é considerado como um dos mecanismos de inflamação crónica, mas pode também mediar a fuga imunitária de células tumorais e a progressão do tumor. Além disso, o TLR2 actuam como um mecanismo potencial anti-viral em linhas de células de hepatócitos infectados com hepatite-B [11].

TLRs são expressos numa ampla variedade de células tumorais e são suspeitos de desempenhar papéis importantes na iniciação e progressão de câncer, no entanto a expressão de TLR por células de hepatocarcinoma não foi examinada de forma sistemática e pouco se sabe sobre a interação TLR com a progressão da doença. Neste estudo, o objetivo foi determinar a expressão de TLRs 1-10 no estabelecida linha de células de carcinoma hepatocelular humano BLE-7402. Nós, adicionalmente, teve como objetivo investigar o efeito biológico de TLR2 no crescimento e sobrevivência celular, e para avaliar o seu potencial no campo da terapia do cancro.

Materiais e Métodos

Todos os experimentos cumpridas as leis atuais da China.

linha celular

a linha de células de carcinoma hepatocelular humano BEL-7402 foi adquirida a partir do banco de células da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). BEL-7402 foi cultivado sem antibióticos em 5% de CO

2 a 37 ° C em meio RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo 10% de FBS.

Construção de plasmídeos que expressam ARNsi

Três oligonucleótidos pequenos interferentes (a: 5′-aactatccactggtgaaacaa-3 ‘, B: 5′-aaacttgtcagtggccagaaa-3′, C: 5’-aaagtcttgattgattggcca-3 ‘) foram concebidos com base nas sequências de TLR humano 1 -10 (Tabela 1) e sintetizado. Os vectores plasmídicos de ARNi (Figura S1) que expressam os siRNAs para RST2 sob o controlo de um promotor de CMV humano, foram gerados através da inserção de pares de oligonucleótidos de ADN hibridados específicos para RST2 nos sítios de HindIII e BamHI sequencialmente no plasmídeo pGenesil-1 (shTLR2, Tabela 2). Um vector pGenesil-1-mexidos foi utilizada como um controlo.

qualitativa de RT-PCR

reagente TRIzol (Invitrogen) foi utilizado para isolar o ARN total de acordo com as instruções do fabricante. Uma alíquota de 4 ug do ARN total foi misturado com um iniciador oligo-dT e da mieloblastose vírus (MLV) de transcriptase reversa (Promega, Madison, WI). Os iniciadores de PCR para TLR 1-10, juntamente com GAPDH como controlo, foram concebidos como apresentado na Tabela 1. As condições de PCR foram como se segue: 95 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 95 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 1 min, e 72 ° C durante 1 min. O prolongamento final foi a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR foram analisados ​​em 1,5% (peso /vol) de géis de agarose contendo 0, 5 ug /mL de brometo de etídio e foram visualizados sob luz UV. densidade banda foi analisada e quantificada utilizando o software ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

-PCR em tempo real

A mistura da reacção continha 45 ul de DEPC-H

2O, 1,0 uL ADNc a uma diluição 1:100, 2,0 mL (10 uM) de cada iniciador e pó liofilizado de acordo com as instruções do manfacturer da pré-mistura AccuPower Greenstar® qPCR. O procedimento de PCR foi como se segue: 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg. A fluorescência foi medida depois de cada passo de extensão de 72 ° C durante 30 seg (Eppendorf, Alemanha). No final da reacção, analisou-se a curva de fusão de cada uma das amostras. software de análise Bioneer Exicycler ™ (Bioneer Corp., Daejeon, Coreia) foi usado para obter o C

valores de t. A expressão relativa dos genes-alvo foi determinada pelo

-ΔΔ método 2 CT [12].

Fluxo de Detecção de Citometria de TLR Protein Expression

Uma suspensão de 2 × 10

6 células BEL-7402 cultivados foi preparado e permeabilizadas para detectar a expressão de proteínas TLR. As células foram recolhidas e lavadas duas vezes com 1 x PBS, depois coradas com 5 uL de anticorpo purificadas TLR2 anti-humano (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a 4 ° C durante 1 h, protegida da luz. Depois de lavar duas vezes com 1 x PBS, as células foram recolhidas por centrifugação a baixa velocidade (1500 g, 10 min) e incubadas com 2 de cabra uL PE-conjugado anti-IgG de coelho mAb (Santa Cruz Biotechnology) a 4 ° C durante 30 min em no escuro, seguida de duas lavagens com 1 x PBS. Finalmente, as células coradas foram suspensas em 500 uL de 1 x PBS, e analisadas por citometria de fluxo (FACScalibur; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) utilizando o software CellQuest BD. O controlo negativo foi processado da mesma maneira, mas sem o anticorpo anti-RST2.

ARN interferência no ensaio

As células foram transfectadas com o plasmídeo que expressa GFP pGsil-1 (Genesil, Wuhan, China ) contendo siARN dirigido contra o TLR2, como mostrado na Tabela 2. As células transfectadas foram semeadas a 2 x 10

5 células /poço em placas de 6 poços e cultivadas durante a noite até atingirem 70% de confluência. As transfecções foram efectuadas utilizando Lipofectamina 2000 ™ reagente (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. Quatro ug de ADN de plasmídeo (SH-TLR2 RNAi (A), SH-TLR2 RNAi (B), SH-TLR2 RNAi (C), vector pGenesil-1 e mexidos siARN) foram usadas para transfecção em células, respectivamente (SunShineclean ™ sem- endotoxina plasmídeo Mini Extraction Kit, SunShineBio, China). As células transfectadas foram incubadas durante 72 h, em seguida, a fluorescência foi observada utilizando um microscópio de fluorescência. Neste momento células também foram coletadas para o ensaio FCM e imunofluorescência.

Análise de imunofluorescência

células BEL-7402 foram transfectadas com vários plasmídeos siRNA e cultivadas durante a noite, em seguida, fixos com álcool para 30 min e bloqueadas em 1 × PBS (pH 7,4) com solução de BSA a 3%. O anticorpo anti-TLR2 (sc-166900, Santa Cruz Biotechnology) foi adicionado a uma diluição 1:200 e incubadas durante a noite a 4 ° C numa caixa humidificada. Após lavagem, adicionou-se o anticorpo secundário fluorescente (SC-22766, Santa Cruz Biotechnology) numa diluição 1:100 e incubou-se durante 2 h. As células foram então lavadas três vezes com 1 x PBS, e contra-coradas com DAPI. A microscopia confocal foi realizada e a fluorescência foi analisada utilizando um microscópio de fluorescência (Leica DMI4000B, Buffalo Grove, IL).

Ensaio de Proliferação Celular

O ensaio de MTT (Sigma, St. Louis, MO) foi usada para avaliar a proliferação de células após a transfecção. As células foram cultivadas em placas de células de 96 poços (1 × 10

4 /poço, 5 poços por condição) durante a noite, e transfecções de células foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante. Após 48 h, uma amostra das células transfectadas foi colhido como amostra 0 h, enquanto que as outras células em cultura continuou durante 24 h, 48 h e 72 h. No final de cada período de tratamento, adicionou-se MTT ao meio de cultura em cada poço a uma concentração de 5 mg /mL (Sigma Chemical Co., St Louis, MO), e, em seguida, incubadas durante 4 h a 37 ° C. O sobrenadante foi então removido e as células foram misturadas com 100 ul /poço sulfóxido de dimetilo. A absorção foi medida utilizando um espectrofotômetro de microplacas (340st; Anthos Zenyth, Salzburg, Áustria) a 490 nm

Inflammatory Human Cytokine Ensaio

O sobrenadante foi coletado a partir de células transfectadas.. IL-6 e IL-8 níveis foram detectadas utilizando o kit de citocina inflamatória humano (BD ™ Citometria grânulo Array) de acordo com as instruções do fabricante.

Experiência de Rato Modelo in vivo

macho nu atímicos Os ratinhos (Balb /c -nu /nu; 5-7 semanas de idade) foram divididos em cinco grupos de tratamento, com dez ratinhos por grupo de tratamento. manejo dos animais e os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité de Experimentação Animal da Universidade Médica de Nanjing. Uma suspensão de células BEL-7402 (1 × 10

7) em 500 ul de PBS foi injectada por via subcutânea de abodomen. Esta concentração de células era necessário para alcançar o crescimento tumor local consistente dentro de 10 dias de implantação. Nos dias 10 e 15 pós-implantação, os tumores foram injectados, respectivamente com ADN de plasmídeo (SH-TLR2 RNAi (A), SH-TLR2 RNAi (B), SH-TLR2 RNAi (C), vector pGenesil-1 e mexidos siARN) , com 150 ug de cada vez. A escala do tumor foi determinado por inspecção visual e medido por compasso de calibre de Vernier 15 d após a segunda injecção.

Análise estatística

Os dados apresentados são a partir de pelo menos três experiências separadas e estão representados como médias ± desvio padrão (SD). Estudante de

t

-teste e ANOVA foram usados ​​para determinar a significância, e as diferenças foram consideradas significativas para a

valor P

inferior a 0,05.

Resultados

Expressão de TLR na BEL-7402 Linha celular

análise semi-quantitativa por RT-PCR revelou que o ARNm para TLR (TLR 2-10) é expresso em células BEL-7402 (Figura 1A), enquanto TLR1, 7 expressão de ARNm era praticamente indetectável. Uma análise adicional por PCR em tempo real mostraram que TLR7 é expressa ao mais baixo nível. Por isso, escolheu para referir todos os outros níveis de mRNA de TLR em relação ao nível de ARNm de TLR7. TLR2 e TLR4 apresentaram os maiores níveis de expressão, o que pode indicar que eles têm alguma função na BEL-7402 o crescimento celular e progressão (Figura 1B).

Semi-quantitativa resultado RT-PCR de TLRs em BEL-7402. GAPDH mRNA foi utilizado como controlo (A). Em tempo real de RT-PCR de TLRs em BEL-7402. A expressão de TLR7 foi normalizada para 1,0 como o seu nível mais baixo era entre todos os TLR (B). TLR níveis de expressão de proteína em BEL-7402 por citometria de fluxo (C). Todos os resultados são representativos de três experiências separadas.

TLR níveis de expressão de proteína foram determinadas por citometria de fluxo (FCM). TLR2 foi expresso em níveis mais elevados de TLR1-10, os outros TLRs foram todas expressas em níveis moderados ou fracamente expressos (Figura 1C). Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstram que as células BEL-7402 em cultura expressam TLR2-TLR10, com RST2 sendo o mais altamente expresso. Este resultado nos incentivou a investigar mais a função de TLR2 no crescimento e progressão de células BEL-7402.

Knockdown eficiente de TLR2 expressão na linha celular BEL-7402 por três siRNAs

Para investigar a função potencial de TLR2 em hepatocarcinoma, usamos pequenos RNAs hairpin para knockdown expressão do gene endógeno TLR2 [gene ID: 10333]. Os vectores plasmídicos foram construídos para expressar três diferentes ARNsi, SH-TLR2 RNAi (A), SH-TLR2 RNAi (B), SH-TLR2 RNAi (C). Todos os três vectores siRNA experimentais foram transfectados em células BEL-7402, respectivamente, com o vector siARN mexidos e o vector vazio como controlo. Após 48 h, a eficiência média da transfecção foi de cerca de 70%, tal como estimada por células positivas para fluorescência verde ao microscópio de fluorescência. Todos os três siRNAs experimentais eficazmente reduzida a expressão de ARNm de TLR2 em células transfectadas (Figura 2I). níveis de mRNA TLR2 foram 29,85% ± 9,2%, 50,75 ± 6,7% e 31,34 ± 8,3% do controle vazio vector com sh-TLR2 RNAi (A), sh-TLR2 RNAi (B) e sh-TLR2 RNAi (C), respectivamente, uma redução estatisticamente significativa da expressão em comparação com as células de controlo de vector vazio (

P

0,05) (Figura 2II). Não houve diminuição significativa na expressão foi observado em células transfectadas com o siARN mexidos (

P 0,05

). a expressão da proteína de TLR2 foi reduzida em todos os três níveis com ARNsi de 33,0% ± 3,0% (SH-TLR2 RNAi (A)), 57,9% ± 4,7% (SH-TLR2 RNAi (B)) e 43,7% ± 4,5% (SH- TLR2 RNAi (C)) do controle do vetor vazio (Figura 2III). Não houve diferença significativa na expressão da proteína de TLR2 foi observado no controlo scrambled siRNA (

P 0,05

). Estes dados indicam que a RNAi SH-TLR2 (B) é o plasmídeo recombinante mais eficiente em silenciamento de TLR2. Por conseguinte, seleccionado para utilizar apenas SH-TLR2 RNAi (B) em experimentação adicional.

I, por RT-PCR a partir de TLR2-pGenesil um vector, ScrambledsiRNA, SH-TLR2 RNAi (A, B, C) transfectadas BEL-7402. II, expressão de TLR2 ao nível do ARNm em pGenesil-1 vetor, ScrambledsiRNA, e SH-TLR2 RNAi (A, B, C) transfectadas BEL-7402 com PCR em tempo real. III, citometria de fluxo análise da expressão TLR2, do estudante

t

-teste e ANOVA foram usados ​​para determinar a significância.

expressão da proteína TLR2 em células BEL-7402 foi ainda testado por imunocoloração com um anticorpo anti-RST2 e visualizados sob um microscópio de fluorescência. A coloração positiva foi dramaticamente reduzida em SH-TLR2 RNAi (B) em comparação com o controlo de vector vazio (Fig. 3iV). Nenhuma diferença significativa foi observada nos níveis de coloração de controle siRNA mexidos em comparação com o controlo de vector vazio (Fig. 3iV).

I, Análise MTT da taxa proliferativa das pGenesil-1 vetor, ScrambledsiRNA e sh-TLR2 ARNi (B) células transfectadas. células II e III, IL-6 e IL-8 no sobrenadante presença segregada por pGenesil-1 vetor, mexidos siRNA e SH-TLR2 RNAi (B) transfectadas. sobrenadante de células foram recolhidos e analisados ​​utilizando citometria de fluxo. Todos os resultados são representativos de três experiências separadas, estudante do

t

-teste e ANOVA foram usados ​​para determinar a significância. IV, análise de imunofluorescência de siRNA específico para o gene na expressão de proteínas de TLR2 em pGenesil 1-vector (i), mexidos siRNA (II) e SH-TLR2 de ARNi (B) (iii) células transfectadas. coloração nuclear realizado utilizando DAPI (azul) (200 ×). TLR2 silenciamento suprime o crescimento de tumores em um modelo de mouse. Comparação do volume dos tumores de cada grupo de tratamento foi mostrado. O tratamento com BEL-7402 celular (VI_i), sh-TLR2 RNAi (B) DNA construtiva foi injetado no grupo tumor (VI_ii), diferenças significativas em comparação com grupos de controlo (V.▪, VI_iii) foram representados por asteriscos (

P

. 0,05)

Assim, demonstrámos knockdown específico dirigido siRNA do gene TLR2 na linha celular de carcinoma hepatocelular humano BEL-7402, e mostraram que RNAi SH-TLR2 (B ) foi o plasmídeo recombinante mais eficiente em silenciar TLR2.

proliferação da linha celular transfectada BEL-7402 Seguindo Gene TLR2 knock Down

foi utilizado o ensaio de MTT para determinar os efeitos do sh-TLR2 ARNi (B) mediada por TLR2 silenciamento sobre a proliferação celular. As células foram cultivadas durante 0 h, 24 h, 48 h, 72 h e 48 h depois da transfecção. A percentagem de células viáveis ​​foi reduzida na presença de TLR2 por siARN ~ 50% em média em comparação com células, sem qualquer tratamento. A capacidade proliferativa de células BEL-7402 foi reduzida pela transfecção SH-TLR2 RNAi (B) (Figura 3I). Não foi observada diferença significativa nas células transfectadas com o controle siRNA (

P

0,05).

Down-regulação do TLR2 por siRNA bloqueia a sua sinalização a jusante em células BEL-7402

As alterações biológicas causadas por TLR2 sub-regulação pode ser devido à alteração de sinalização a jusante mediada por TLR2 conduzindo a alterações nas funções subsequentes.

TLR2 pode desempenhar um papel na sinalização de TLR2 /MyD88 e funções subsequentes a jusante [17], e nós presumimos que a secreção de citocinas é um resultado da sinalização de TLR2. Por isso, foi elaborado um protocolo para examinar o nível de citocinas inflamatórias em células BEL-7402 seguintes silenciamento de genes TLR2. células BEL-7402 foram transfectadas com TLR2-SH RNAi (B). Após 72 h, o sobrenadante foi removido e os níveis de IL-6 e IL-8 determinada por citometria de ensaio de esferas. IL-6 e os niveis de IL-8 foram encontradas para ser marcadamente deprimido. IL-6 foi reduzida em 50,2 ± 2,6% e IL-8 de 49,7 ± 3,5% quando comparado com o controle de vetores vazios (

P Art 0,05); nenhuma diferença significativa foi observada nos controles transfectadas com siRNA (Figura 3ii e Figura 3III).

Gene TLR2 por siRNA Inibe Tumorigênese em ratinhos nus

Por ter estabelecido os efeitos significativos de TLR2 knockdown por RNAi em BEL-7402 células

in vitro

, nos perguntamos se TLR2 RNAi também suprimir a tumorigenicidade de tumores BEL-7402 em ratinhos nus. Nos dias 7 e 14 pós-implantação, os tumores foram injectados com ADN de plasmídeo que expressa o TLR2 siARN. Foram examinadas a morfologia dos tumores primários. Os tumores foram medidos e observou-se uma redução drástica do volume do tumor em ratinhos tratados com sh-TLR2 RNAi (B) (Figura 3 V-VI ii).

Discussão

receptores Toll-like (TLR ) são uma família conservada de receptores que detectam a presença de patógenos por PAMPs reconhecendo [13], [14]. Além disso, eles também estão envolvidos na regulação da inflamação [15], um papel que tem sido sugerido para ser pelo menos parcialmente dependente da capacidade de TLR a reconhecer vários ligandos de TLR endógenas conhecidas como padrões moleculares associados a danos (amortece). Recentemente, foram relatados muitos estudos sobre TLRs e seu papel potencial na pesquisa e terapia do cancro. Yang et al [16] investigaram os possíveis papéis de TLR2 sinalização nas metástases de tumor num modelo de rato de injectados intravenosamente células B16 de melanoma. O resultado demonstra que o TLR2 é um alvo atractivo contra metástases, o anticorpo anti-RST2 poderia ser utilizada para combater as a metastasis.Thompson et al [11] mostrou que as linhas celulares de hepatoma expressam receptores TLR2 funcionais, os quais, quando estimulados, iniciam um risco de vida cascata de sinalização que inibe o vírus da hepatite B. Xu et al [17] detectaram células mononucleares do sangue periférico de doentes infectados pelo VHB mostrou diminuição dos níveis de expressão TLR7 e TLR9 mRNA, mas um aumento na expressão TLR9 ao nível da proteína.

A partir desses estudos, sabemos que TLR2 , TLR7 e TLR9 desempenham papéis fundamentais em doenças do fígado e TLR2 tem uma função potencial na regulação da tolerância tumor, progressão do câncer e metástase [13]. Orihara et al [18] revelaram que RST2 e /ou TLR4 em monócitos circulantes estão significativamente sobre-regulada na infecção bacteriana. níveis de expressão de TLR2 em monócitos foi mostrado para fornecer informações críticas ao planear tratamento contra doenças infecciosas bacterianas [18] e doenças filariais [19], do cancro do ovário [20], doenças do fígado [21], e doença infecciosa bacteriana [22], [ ,,,0],23], [24], [25]. No entanto, o crescimento, a proliferação e a metástase de carcinoma hepatocelular são processos complicados e dinâmicos. Cada processo é susceptível de ser associada com as acções (e) interacção de vários TLRs [26]. À luz disto, nós decidimos explorar a expressão de outros TLRs no carcinoma hepatocelular e investigar se estas poderiam afetar o crescimento, progressão e sobrevivência de câncer de fígado. As nossas experiências demonstram que TLR 2-10 são expressas em células BEL-7402 em ambos os níveis de mRNA e proteína. Temos mostrado, por análise de PCR em tempo real e citometria de fluxo, que o TLR2 é a mais altamente expresso dos TLRs

.

Há uma evidência emergente de que muitos tipos de células diferentes no fígado expressam TLR2 [27]. tais como as células de Kupffer e hepatócitos, células epiteliais biliares. sinais mediada pelos TLR resultar em hepatite B, hepatite C, doença alcoólica do fígado, as doenças do fígado não-alcoólica, a cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, fibrose hepática, isquémica e reperfusão lesão hepática e rejeição de aloenxertos [27]. Huang et ai. mostrou que

Listeria monocytogenes

activados proteínas quinases activadas por mitogénio e factor nuclear-kB em células tumorais através da sinalização de TLR2, resultando no aumento da produção de óxido nítrico e a interleucina-6 e aumento da proliferação de células de tumor [7]. Kim et al. mostrou que o carcinoma de pulmão de Lewis (LLC) foi o mais potente activador de macrófagos levando à produção de interleucina-6 e tumor-fator de necrose α através da activação do receptor de tipo Toll (TLR) membros da família TLR2 e TLR6 [9] e os seus resultados explicou como células cancerosas avançadas mudar o sistema imune inato de acolhimento e, assim, gerar um microambiente inflamatório. Huang et ai. mostraram que o microambiente de tumores grandes favorece a sobrevivência das bactérias, que por sua vez acelera o crescimento de tumores directamente através da activação do receptor de tipo Toll 2 célula tumoral [7].

factores pró-inflamatórias, tais como o óxido nítrico, IL-6 e IL- 12 foram mostradas para ser lançado a partir de células tumorais em estudos anteriores [10]. Tanto a IL-6 e IL-12 são conhecidos para ajudar as células tumorais resistir linfócitos T citotóxicos e de células assassinas naturais, que conduz à evasão da vigilância imune [10]. No nosso estudo, RST2 foi seleccionado para explorar a função dos TLRs no crescimento de células BEL-7402. O nosso estudo confirma a importância da proliferação do tumor mediada por TLR2, análise de citocinas inflamatórias demonstraram produção deprimido de expressão TLR2 após TLR2 knockdown, e mostrou que a capacidade das células BEL-7402 para resistir ao ataque de células imunitárias e facilitar a evasão da vigilância imunológica pode ser diminuída . Isto sugere que todas as alterações fenotípicas observadas nestas células foram mediados por suprimir a acção de TLR2.

O modo de rato de cancro, foi também investigada, e o volume do tumor de tratamento siARN foi mostrado. Por ter estabelecido os efeitos significativos de TLR2 knockdown por RNAi em células BEL-7402 in vitro, nos perguntamos se TLR2 RNAi também suprimir a tumorigenicidade de tumores BEL-7402 em ratinhos nus. Nos dias 10 e 15 de pós-implantação, os tumores foram injetados com expressando DNA plasmídeo sh-TLR2 RNAi. Foram examinadas a morfologia dos tumores primários. Observou-se uma redução drástica do volume do tumor em ratinhos tratados com sh-TLR2 RNAi (B).

Os resultados apresentados neste trabalho fornecem evidências de que TLR2 knockdown não apenas in vitro, mas in vivo poderia inibir o crescimento de fígado tumores. mediada por TLR2 o crescimento do cancro parece ser um factor importante na progressão do tumor. O uso de TLR2 entregue sistemicamente siARN pode assim proporcionar um novo tratamento para a prevenção da progressão do cancro que conduz a melhores perspectivas de sobrevivência.

Informações de Apoio

Figura S1.

ARNi vectores plasmídicos (pGenesil-1) de plasmídeo.

doi: 10.1371 /journal.pone.0038890.s001

(JPG)

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Dongxu Liu (Escola de Ciências da Vida, Universidade de Hubei, Hubei, PR China) para a prestação de apoio técnico.