Abstract

Fundo

ET-743 (trabectedina, Yondelis®) e PM00104 (Zalypsis®) são compostos derivados marinhos que possuem actividade antitumoral. ET-743 e PM00104 exposição ao longo de períodos prolongados de tratamento irá resultar no desenvolvimento de resistência aos medicamentos, mas os mecanismos que conduzem à resistência ainda não são compreendidos.

Metodologia /Principais Achados

condrossarcoma humano As linhas celulares resistentes a ET-743 (CS-1 /ER) ou PM00104 (CS-1 /PR), foram determinadas neste estudo. O CS-1 /ER e CS-1 /PR exibiram resistência cruzada a cisplatina e metotrexato, mas não à doxorrubicina. matrizes Affymetrix Human Gene Chip foram usadas para examinar a expressão do gene em relação nestas linhas celulares. Verificou-se que um grande número de genes têm níveis alterados de expressão de CS-1 /ER e CS-1 /PR, quando comparado com a linha celular parental. 595 /ER e 498 CS-1 /PR genes-1 CS foram identificados como superexpressão; 856 CS-1 /ER e 874 transcritos de CS-1 /PR foram identificados como underexpressing. Três proteína dedo de zinco (ZnF) genes estavam na lista top 10 genes sobre-expressos. Estes genes não foram anteriormente associado com resistência a drogas em células de tumor. expressão diferencial de genes ZNF43 ZNF93 e foram confirmados em ambas as /ER e CS-1 /PR linhas celulares resistentes a CS-1, em tempo real de RT-PCR. ZNF93 foi sobre-expressa em duas linhas celulares de sarcoma de ET-743 resistentes Ewing, bem como numa linha celular de cancro do ovário resistentes a cisplatina, mas não foi sobre-expresso em linhas celulares resistentes a paclitaxel. ZNF93 knockdown por siRNA em CS-1 /ER e CS-1 /PR causou aumento da sensibilidade para a ET-743, PM00104, e cisplatina. Além disso, ZNF93 células transfectadas CS-1 são relativamente resistentes à ET-743, PM00104 e cisplatina.

Conclusões /Significado

Este estudo sugere que as proteínas de dedos de zinco, e ZNF93 em particular, estão envolvidos na resistência a eT-743 e PM00104

Citation:. Duan Z, Choy e, Harmon D, Yang C, Ryu K, Schwab J, et al. (2009) ZNF93 aumenta a resistência à ET-743 (trabectedina; Yondelis®) e PM00104 (Zalypsis®) em linhas celulares de cancro humano. PLoS ONE 4 (9): e6967. doi: 10.1371 /journal.pone.0006967

editor: Nils Cordes, da Universidade de Tecnologia de Dresden, Alemanha |

Recebido: 02 de abril de 2009; Aceito: 10 de agosto de 2009; Publicação: 09 de setembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Duan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado, em parte, por uma concessão do PharmaMar. Dr. Duan é suportado, em parte, através de uma subvenção pela Fundação Ovarian Cancer Research (OCRF), e um subsídio do Instituto Nacional do Câncer, NIH (Nanotechnology Parceria Platform), R01-CA119617. Dr. Choy é suportado pela fundação Yates Jennifer Hunter. Apoio também foi fornecido pelos financiadores funds.The Gattegno e Wechsler não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nós também reconhecemos que os 2 a várias drogas quimioterápicas utilizadas neste estudo, ET-743 e PM00104, foram fabricados e fornecidos pela empresa, PharmaMar que também em parte financiado o trabalho

Conflito de interesses:. Confirmo que PharmaMar EUA, Inc não tem qualquer influência sobre os resultados e conclusões deste estudo. Declaro também que os resultados e as conclusões não foram afetados por uma concessão do PharmaMar EUA, Inc. Embora este estudo foi apoiado, em parte, por uma concessão do PharmaMar, isso não altera a nossa adesão a todas as PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais com outros investigadores. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nós também reconhecemos que os 2 a várias drogas quimioterápicas utilizadas neste estudo, ET-743 e PM00104, foram fabricados e fornecidos pela empresa, PharmaMar que também em parte financiou o trabalho.

Introdução

ET-743 (Yondelis®; trabectedina) é derivado de alcalóide marinho isolado da ascídia Caribbean

Ecteinascidia corneto

[1], [2]. ET-743 tem um largo espectro de actividade em linhas de células de tumor em pm e baixas concentrações nM, e também tem actividade clínica em direcção do cancro do ovário, cancro da mama, sarcomas e [2], [3]. ET-743 foi aprovado pela EMEA /UE para pacientes com sarcomas avançados que têm ou progredido após o tratamento com uma antraciclina ou não são clinicamente adequada para receber agentes convencionais [4]. ET-743 é composto por três subunidades de tetrahidroisoquinolina contendo uma porção central de carbinolamina que lhe permita ligar-se covalentemente ao DNA. ET-743 se liga ao sulco menor do ADN de hélice com a preferência de ligação específico da sequência de tripletos ricas em GC e subsequentemente forma adutos covalentes com o N2 de guanina-posição. Como resultado, o sulco menor é exposta e voltou-se para o sulco maior. Quando ocorre tal ligação, cadeias de DNA tornam-se reticulados e não pode ser replicada, resultando em morte de células [5], [6]. A direção do giro DNA é uma nova característica entre os agentes do sulco interativo de DNA menor, tornando-ET-743 única.

PM00104 (Zalypsis®), derivado de moluscos, é um romance entidade química relacionada com Jorumicina, um compostos naturais marinhos que pertencem à família de

renieramicinas

, obtido a partir de esponjas [7], [8]. PM00104 possui

in vitro

na actividade anti-tumoral vivo

para uma ampla variedade de tumores sólidos e hematológicos Comprar e. Tal como acontece com ET-743, PM00104 também se liga ao ADN e é citotóxica; No entanto, ao contrário de ET-743, PM00104 não activam a resposta “DNA danos checkpoint”. Assim, os efeitos citotóxicos da PM00104, embora dependente de ADN de ligação, não são desencadeadas por mecanismos de resposta a danos no ADN [8].

Tal como com outros fármacos quimioterapêuticos, ET-743 e PM00104 exposição ao longo de períodos prolongados de tratamento irá resultam no desenvolvimento de resistência à droga, mas os mecanismos não são bem compreendidos. Diferentes estudos têm relatado descrições conflitantes sobre a relação entre a expressão ABCB1 e resistência ET-743 em linhas celulares de cancro humanos [9], [10]. Na linha de células do ovário humano IGROV-1, que é seleccionado para resistência a ET-743, ABCB1 é sobre-expressa [11]. A sensibilidade pode ser restaurada através da adição do inibidor Pgp1 PSC-833, sugerindo que a ET-743 pode ser um substrato Pgp1. Outro estudo no entanto, observou-se que duas linhas celulares de cancro que sobre-expressam Pgp humano epidermóide (KB-8-5 e KB-C-2) não foram resistentes a ET-743 [9]. Notavelmente, as concentrações sub-letais de ET-743 poderia reverter a resistência à doxorubicina e vincristina nestas linhas celulares. Não há relatos que descrevem o mecanismo de resistência PM00104 nas células tumorais.

Os condrossarcomas são um grupo heterogêneo de tumores de origem mesenquimal que se desenvolvem em osso ou cartilagem e mostrar características condrocítico [12]. Estes tumores respondem mal aos tratamentos convencionais como a quimioterapia e radiação, e prognóstico está relacionado com o grau do tumor e do estado de diferenciação. A sensibilidade de células de sarcoma de ET-743 e PM00104 nos e outros levados a considerar estes compostos como candidatos interessantes para o futuro tratamento de condrossarcoma [13], [14], [15]. No entanto, tal como com outros agentes quimioterapêuticos, a propensão das células tumorais desenvolvem resistência a ET-743 ou PM00104 representa um desafio significativo para a utilização deste fármaco durante um período de tempo prolongado. O objetivo deste estudo é explorar os mecanismos de ET-743 ou PM00104 resistência no condrossarcoma

Material e Métodos

As drogas quimioterápicas

ET-743 (Yondelis®.; trabectedina) e PM00104 (Zalypsis®) foram fornecidos por PharmaMar (Espanha). Paclitaxel (Taxol), doxorrubicina (Adriamicina RDF®, EC No. 2.468.183), metotrexato (Trexall) e cisplatina (cisplatina; CDDP) foram obtidos através de material clínico residual não utilizado fornecido pela farmácia do Hospital Geral de Massachusetts. A solução estoque de medicamentos foram preparados de acordo com as especificações de drogas e armazenadas a -20 ° C.

linha de células de condrossarcoma CS-1 |

A linha de células chonodrosarcoma humana, propagada desde 1999 e designado CS -1, foram estabelecidos a partir de um alto grau chonodrosarcoma humano cirurgicamente ressecado que não foi previamente exposto à quimioterapia ou terapia de radiação, e cultivadas em monocamada. Resumidamente, o tecido foi assepticamente obtida imediatamente a seguir à ressecção, colocados em meio de cultura de tecidos RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino a 10%, e o tecido cultivado a 37 ° C incubadora contendo 5% de CO2 [13], [14]. A análise detalhada de CS-1 tem sido relatada anteriormente [13], [14], [15], [16], [17]. O ARN total foi extraído após CS-1 foi passada quatro vezes.

Criação de ET-743 ou linha celular resistente PM00104

CS-1 /ER e CS-1 /PR células resistentes a ET -743 ou PM00104 foram estabelecidos a partir da linha de células progenitoras CS-1 por exposição a ET-743 ou com PM00104 passo a passo de concentração aumento de ET-743 ou PM00104 durante um ano usando um método semelhante como descrito anteriormente [18], [19 ], [20]. Em resumo, as células cultivadas CS-1 foram expostas a 0,00001 uM quer de ET-743 ou PM00104 durante 7 dias e, em seguida, lavadas e cultivadas em meio contendo 0,00003 uM, durante 7 dias. Se as células CS-1 demonstrou citotoxicidades após a exposição a uma dada concentração da ET-743 ou PM00104, elas foram lavadas e cultivadas em meio isento de fármaco, durante 7 dias. Por exemplo, observou-se 90% de CS-1 As células foram mortas quando as células foram expostas a 0,001 uM de ET-743 ou 0.003 uM de PM00104 durante 7 dias. Quando as células viáveis ​​tinha recuperado, que foram semeadas em meio contendo a concentração mais recentemente exposto da droga novamente durante 3 dias. Depois de vários ciclos repetidos e quando as células cresceram até 70% de confluência em meio de cultura contendo fármacos, a concentração de droga será aumentada para o nível seguinte. Após um ano, a ET-743 linha celular resistente à CS-1 /ER e PM00104 linha celular resistente à CS-1 /PR foram estabelecidos como determinado pelo ensaio de MTT. Estas células representam populações de células resistentes aos medicamentos, em vez de uma população clonada seleccionado. CS-1 /ER podem crescer em concentrações de 0,005 fiM de ET-743 e CS-1 /PR pode crescer na concentração de 0,01 | iM PM00104.

Outra linha de células resistentes aos medicamentos utilizados neste estudo

linhas de células humanas de cancro do ovário SKOV-3 e A2780 e uma linha celular de cancro da mama humano MCF-7 foram adquiridos da American Type Recolha de Tecidos (Rockville, MD). O paclitaxel foram estabelecidas resistentes SKOV-3

TR, MCF-7

TR e resistente a cisplatina A2780cp linhas celulares como relatado anteriormente [19], [20]. Dr. Katia. Scotlandi (Instituto Ortopedia Rizzoli, Itália) fornecida sarcoma de Ewing ET-743 linha celular resistente TC-TE [21].

de cultura de tecidos

Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen). As células foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2-95% de ar e passadas quando perto monocamadas confluentes foram obtidos utilizando uma solução de tripsina-EDTA. As linhas celulares resistentes a drogas foram periodicamente cultivadas na respectiva droga para confirmar as suas características de resistência a drogas. As células foram livre na contaminação por micoplasma, como testado por MycoAlert Mycoplasma Kit de Detecção (R) da Cambrex (Rockland, ME).

Ensaio de citotoxicidade

citotoxicidade da droga foi avaliada in vitro utilizando o ensaio MTT como anteriormente descrito [22]. Resumidamente, 2 × 10

3 células por poço foram plaqueadas em placas de 96 poços em meio de cultura (RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% e penicilina /estreptomicina) contendo concentrações crescentes de droga. Após 7 dias de cultura, 10 ul de MTT (5 mg /ml em PBS, obtidas a partir de Sigma) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas durante 4 h. O produto de formazano resultante foi dissolvido com ácido-isopropanol e a absorvância a um comprimento de onda de 490 nm (A

490) foi lida num espectrofotómetro de microplaca SPECTRAmax® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Os valores de absorvância foram normalizadas, atribuindo o valor da linha de controlo no meio sem fármaco para 1,0 e o valor do controlo sem células para 0. As experiências foram realizadas em triplicado.

ARN extracção

RNA total foi coletado de CS-1 (linha celular parental com passadas 4 vezes), CS-1 /ER e CS-1 /PR (linhas de células resistentes a filha com cultivadas por um ano) usando TRIzol ® Reagente (GIBCO, Grand Island , NY) de acordo com as instruções do fabricante. Para ter em conta e eliminar o ruído biológica, o ARN foi isolado a partir de três frascos distintos de cada linha de células. Estas réplicas biológicas foram reunidas. qualidade RNA foi determinada

via

brometo de etídio coloração seguinte eletroforese em gel de agarose /formaldeído.

Gene transcricional profiling

O RNA total foi processado e hibridizado com Gene Affymetrix Chip U133 mais 2,0 matrizes (Santa Clara, CA) pelo Centro de Tecnologia Gene matriz na Harvard Medical School (https://genome.med.harvard.edu). Affymetrix Gene Chip U133 mais 2,0 na primeira e mais abrangente leque de expressão do genoma humano inteiro. Esta matriz completa cobertura de todo o genoma humano, com mais de 47.000 cópias. Cada sonda consiste de 20 oligonucleotídeos 23 mer separadas. O nível de expressão de ARNm de cada é quantificada por medição da sua hibridização com estas 23-meros em comparação com a sua hibridação com um oligonucleótido incompatibilidade de uma base.

Dados de análise

GeneSifter foi usada para analisar a dados de microarray (https://www.genesifter.net/web/). GeneSifter fornece poderosos algoritmos analíticos (RMA, PAM, ANOVA, Clara, Benjamini-Hochberg, etc.) através de uma interface web intuitiva. GeneSifter pode identificar genes diferencialmente expressos e análise de cluster para identificar padrões de expressão genética e segregação de genes baseados nesses padrões. mudança vezes na expressão entre linhas de células sensíveis e resistentes foi avaliada utilizando o teste de Mann-Whitney. Um dez vezes ou maior alteração na intensidade combinada com um valor de Mann-Whitney P associada inferior a 0,05 foi utilizado como o critério para inclusão no nosso conjunto de dados filtrada. informação de intensidade foi exportada para o Microsoft Excel, conforme necessário.

TaqMan transcrição reversa-PCR, para quantificação de

gene expresso diferencialmente

em tempo real de RT-PCR foram realizadas para validar os genes expressos diferencialmente. Para a detecção de expressão do gene, cDNA de transcrição reversa foi realizada a partir de amostras de ARN total utilizando iniciadores específicos oligo dT a partir do ARN de Taq Man ensaios e reagentes do kit TaqMan de ARN de transcrição inversa (Applied Biosystems). O ADNc resultante foi amplificado por PCR utilizando proteína de dedo de Taq Man zinco 93 (ZNF93), ZNF43 e THADA iniciadores ensaio de gene com a Universal Master Mix de PCR Taq Man e analisadas com um sistema de PCR StepOnePlus em tempo real de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems) . GAPDH e actina foram usadas como controlo. Os níveis relativos de expressão do gene foi calculada a partir dos sinais relevantes por normalização com o sinal de GAPDH ou expressão de actina. As misturas de reacção de PCR continha Taq Man ZNF93 humana, ou ZNF43 e THADA e Universal PCR Master Mix em um volume total de 20 AL. variáveis ​​de amplificação foram como se segue: 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos a 95 ° C (15 s) e emparelhamento /extensão a 60 ° C (1 min). Todas as reacções foram realizadas em triplicata

ZNF93 siRNA ensaio

Para ZNF93 (número de acesso GenBank: NM_031218). Interferências, sentir ZNF93 oligo (5′-CCUCUACCCUUAGUUCACAtt-3 ‘) e oligo antisense ZNF93 ( 5’-UGUGAACUAAGGGUAGAGGag-3 ‘) foram adquiridos da Applied Biosystems e foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Para a validação de especificidade ZNF93 RNAi, os siGenome SmartPool Humanos ZNF93 ARNsi foram adquiridos da Dharmacon (Chicago, IL) com os seguintes quatro sequências alvo de ZNF93 gene. sequência alvo 1: 5’-GGACUUAACCAGUGUAGUA-3 ‘; sequência alvo 2: 5’-AACCAAUCCUCGACACUUA-3 ‘; sequência alvo 3: 5′-GCCCUACGUUUGUGAAGAA-3′ e sequência alvo 4: 5’-CCUUAUAGAUGUAGAGAAU-3 ‘. Para a transfecção, as células foram plaqueadas em qualquer placas de 96 poços para ensaios MTT ou plaqueadas em pratos de extracção de ARN. As transfecções foram realizadas com siPORT ™

NeoFX

™ reagentes de transfecção siRNA (Ambion. Inc., Austin, TX) como indicado pelo fabricante. O silenciador ™ EGFP siRNA (Ambion) e reagente de siRNA Control® (Dharmacon) foram utilizados como controlos positivos e negativos em todas as experiências. Para ZNF93 inibição, a concentração final de ARNip foi quer a 25 nM ou 100 nM. O meio foi substituído com RPMI1640 suplementado com FBS a 10% 24 horas após a transfecção. RNA total foi isolado após 72 horas de ZNF93 siRNA transfecção para a confirmação em tempo real RT-PCR.

pIRES

construção ZNF93 expressão vector e transfecção

Um fragmento de cDNA par 1,907 base que contém ORF completa de ZNF93 humana foi amplificado por RT-PCR a partir do ARN de CS-1 linha celular /PR que ZNF93 altamente sobre-expressa. RT-PCR foi realizada utilizando os iniciadores de sentido e anti-humano para ZNF93 iniciador com sentido: 5′-ATAAGAATGCGGCCCGGAAGCCTAGAAATGGGACCATTG-3 ‘para introduzir um sítio Not I, tal como sublinhado, e iniciador anti-sentido: 5′-GGTGGATCCTCACACTTCTAGGGTTTCT-3’ (GenBank NM_031218) a # introduzir um sítio BamH I tal como é sublinhado. Os locais das enzimas de restrição introduzida foram projetados para seguir estudos de transfecção. de Clontech (Palo ATLO, CA) de mamíferos vetor de expressão pIRESneo foi utilizado para o estudo expressão funcional. O produto ZNF93 RT-PCR resultante foi clonado no vector original pCR®2.1 utilizando TA Cloning Kit da Invitrogen. Após confirmação da sequência, ZNF93 foi cortada a partir do vector pCR®2.1, purificado, subclonado no vector de expressão de MCS pIRESneo, e, subsequentemente, sequenciado para confirmar o ORF correcto. Expressão do ADNc de ZNF93 estava sob o controlo do pCMV. As transfecções foram realizadas utilizando reagentes LipofectAmine Plus (Invitrogen) como se segue: cerca de 5 × 10

5 células CS-1 foram plaqueadas em 90 placas de cultura de tecido milímetros e cultivadas durante a noite. Antes da transfecção, o meio de crescimento foi substituído com meio isento de soro RPMI 1640 e cultivadas durante três horas. reagente LipofectAmine contendo 5 ug de pIRES

vazio, pIRES

ZNF93 foi combinado com o Plus reagente e aplicado às células. Depois de cultura durante quatro horas, o meio foi substituído com meio RPMI 1640 contendo soro bovino fetal a 10%. sulfato de G418 (Invitrogen) selecção (300 ug /mL) foi iniciado 24 horas após a transfecção. O meio de selecção foi mudado a cada 2 dias. Efeitos de ZNF93 superexpressão de ET-743 e PM00104 foram determinadas por ensaio de citotoxicidade de MTT.

Resultados

CS-1 /ER, CS-1 linhas celulares /PR são resistentes a diversos agentes quimioterapêuticos

CS-1 /ER e CS-1 /PR foram seleccionados a partir da linha celular parental, CS-1, por exposição a aumentos graduais nas concentrações PM00104 ET-743 ou por um período de um ano. O fenótipo de resistência a droga foi encontrada para ser estável após 14 meses de cultura contínua em drogas ou pelo menos 6 meses, sob condições isentas de droga. Não foi observada diferença significativa entre o CS-1 e CS-1 /ER ou células CS-1 /PR

in vitro

crescimento celular (tempo de duplicação similar) e morfologia microscópica. A análise de citotoxicidade de MTT que mostra CS-1 /ER, CS-1 /PR são 10- 20 vezes mais resistentes a ET-743 e PM00104, em comparação com a linha celular parental sensível. A IC

50-valor de ET-743 em células de CS-1 foi de 0. 0008 uM em comparação com 0. 01 uM em células /ER CS-1 (resistência de 12,5 vezes). A IC

50-valor de PM00104 em células de CS-1 era 0. 002 uM em comparação com 0. 04 uM em células /PR CS-1 (resistência de 20 vezes). Além disso, CS-1 /ER e CS-1 /PR exibe resistência à cisplatina e metotrexato, mas não à doxorrubicina (Fig. 1).

CS-1 /ER, CS-1 /PR e CS- 1 células foram expostas a diferentes concentrações de drogas, durante 6 dias. A inibição do crescimento foi determinada por incubação com o corante de tetrazólio MTT e por medição da absorvância a 490 nm. Dados refletem três repetições para cada concentração.

Um grande número de genes estão associados com ET-743 e PM00104 resistência

Human Affymetrix Gene Chip U133 mais 2,0 matrizes foram utilizados para examinar relativa Os níveis de expressão de ARN entre o CS-1, CS-1 /ER, e CS-1 /PR. Os perfis destas três linhas celulares de condrossarcoma de expressão foram avaliados através de Genesifter. Além disso, nós submetemos nossos dados de microarranjos de Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) e esses dados de matriz ter sido atribuído um número de acesso GEO como GSE16748. Nós achamos um grande número de genes tinham significativamente diferentes níveis de expressão de CS-1 /ER e CS-1 /PR, em comparação com CS-1. Para concentrar em genes com apenas alterações significativas nos níveis de expressão, foram identificados genes com uma mudança de dez vezes ou maior em níveis de expressão. Usando este critério, 595 (CS-1 /ER), 498 (CS-1 /PR) genes exibiram sobre-expressão de mais de dez vezes nas linhas resistentes a ET-743 e PM00104 em relação à sua expressão nas linhas parentais sensíveis (Fig. 2A). Além disso, 856 (CS-1 /ER), 874 (CS-1 /PR) transcrições foram mais de dez vezes reduzida em linhas de células resistentes, como comparado com os controlos (Fig. 2B). Alterações nos níveis de expressão variaram de 10 a 536- vezes. Os genes identificados foram largamente não-sobreposição entre as linhas de células e codificado para proteínas com uma ampla variedade de funções bioquímicas. Os genes codificam para proteínas identificadas que se ligam a ADN possuem actividades catalíticas, actividades transdutor moleculares, regular a transcrição, moléculas e proteínas de transporte, regular enzimas e há muitos outros genes que tenham a caracterização limitada. Os 20 genes mais altamente sobre-expressos e underexpressed em cada uma das linhas de células resistentes são resumidos na Tabela 1. Havia sete genes sobre-expressos em ambos CS-1 /ER e CS-1 /PR e um gene que underexpressed em ambas as linhas celulares. Nessas duas linhas de células resistentes, existem mais sobreposições gene no topo 20 ao longo lista de genes expressos em comparação com a lista de genes expressos sob. Notamos também o grau de alteração na expressão de genes foi mais dramático no conjunto de genes expressos sob (Tabela 1).

genes sobre-expressa /sob expresso em mais do que uma linha de células são indicados nas regiões de sobreposição os círculos.

genes diferencialmente expressos em ambas as linhas celulares resistentes

Fig. 2 diagrama de Venn mostra que 185 genes foram sobre-expressos, 174 genes foram underexpressed nas ambos CS-1 /er, e as linhas celulares resistentes a CS-1 /PR em comparação com CS-1 (Fig. 2A e Fig. 2B). Os 20 genes mais altamente overexpresssed em ambas as linhas de células resistentes são resumidos na Tabela 2. Como 3 a parte superior 20 genes overecpressing em ambos CS-1 /ER, e linhas de células resistentes a CS-1 /PR são genes da proteína de dedo de zinco (ZNF93, ZNF43 e ZNF568), decidimos validar ainda mais esses genes por real-time RT-PCR.

TaqMan em tempo real, análise de RT-PCR de genes diferencialmente expressos

para validar o dados de matriz, é realizada em tempo real de RT-PCR de três genes que foram diferencialmente expressos nas duas linhas de células resistentes. ZNF93, ZNF43, e a expressão de ARN THADA foram medidos pelo kit de ensaio de TaqMan de ARN. A expressão diferencial de ZNF93 e ZNF43 foram confirmados em ambas as /ER e CS-1 /PR linhas celulares resistentes a CS-1 (Fig. 3A, a Fig. 3B e fig. 3C). THADA superexpressão não foi confirmado na linha de células resistentes CS-1 /ER

A

(Fig 3D.):. Trama de amplificação para o gene β-actina.

B

: Lote de amplificação para ZNF93 gene.

C

: níveis de expressão relativa de mRNA ZNF93.

D

: Resumo dos níveis de expressão relativa de ZNF93, ZNF43 e mRNA THADA

A expressão de ZNF93 em linhas de células resistentes a múltiplas drogas outra

gene ZNF93 sobre-expressos em ambos. CS-1 /ER e linhas celulares de CS-1 /PR e a função de ZNF93 não é clara, embora a proteína tem sido implicado na regulação da transcrição celular. Como gene ZNF93 anteriormente não tem sido associada a resistência a drogas e foi seleccionado para posterior estudo. Foram avaliados ainda mais a expressão de ZNF93 em outras linhas de células resistentes a múltiplas drogas por em tempo real de RT-PCR. Os resultados demonstraram que ZNF93 é sobre-expresso em dois 743 ET-linha celular de sarcoma resistente Ewing, TC-TE, bem como numa linha celular de cancro do ovário resistentes à cisplatina, A2780cp, em comparação com as suas linhas de células de ET-743 ou cisplatina sensíveis parentais, mas ZNF93 não foi sobre-expresso em linhas celulares resistentes ao paclitaxel SKOV-3

TR e MCF-7

TR (Fig. 4).

Todos os dados em tempo real de RT-PCR foram normalizados a p actina.

Efeitos da inibição da expressão ZNF93 por siRNA em sensibilidades de drogas

Para determinar se ZNF93 desempenha um papel em ET-743 e sensibilidade PM00104, que inibiu a sua expressão no CS células -1 /PR usando siRNA knockdown. As sensibilidades relativas drogas foram avaliadas por comparação do IC

50 valores determinados por MTT em, linhas celulares tratadas com siRNA não específicos tratadas com ARNsi de controlo e múltiplas drogas não-tratadas resistentes. Em primeiro lugar, a citotoxicidade de ET-743 e PM00104 foi medida 4 dias após a transfecção de células resistentes com oligos ZNF93 siRNA de Applied Biosystems. Observamos que ZNF93 infra-regulação se recuperou parcialmente a sensibilidade à PM00104 (Fig. 5A) na linha de células de CS-1 /PR. em tempo real de RT-PCR revelou ZNF93 expressão foi significativamente reduzida após as células tratadas com ARNsi (Fig. 5B). Resultados semelhantes foram observados em células resistentes à droga de CS-1 /ER (dados não mostrados). Além disso, para a validação de especificidade ZNF93 RNAi, os siGenome SmartPool Humanos ZNF93 ARNsi foram adquiridos da Dharmacon com as quatro sequências alvo de ZNF93 gene resistente e testada em linha celular cisplantin A2780cp. O ZNF93 expressão em células transfectadas siARN A2780cp foi significativamente diminuída, tal como avaliado por Real-Time RT-PCR (Fig. 5D). ensaio MTT mostrou o IC

50 valores do siARN tratados A2780cp células foram menores em comparação com as linhas resistentes não tratados (Fig. 5C), sugerindo que ZNF93 siARN inibe a expressão ZNF93 e parcialmente restaura a sensibilidade da linha de células resistentes à cisplatina .

Um

: CS-1 /PR foi transfectadas com ARNsi ZNF93 * (Applied Biosystems), bem como siARN não específica.

C

: A2780cp foi transfectadas com ARNsi ZNF93

† (Dharmacon), bem como siARN não específica. A sensibilidade relativa de cada tratamento para PM00104 ou cisplatina foi determinada por análise de MTT de 72 horas pós-transfecção.

B e D

: Confirmação da ZNF93 knockdown por em tempo real de RT-PCR. O ARN total foi isolado de 72 horas pós-transfecção e expressão foi analisada por ZNF93 em tempo real de RT-PCR.

Efeitos de sobre-expressão de ZNF93 em ET-743, e cisplatina PM00104 sensibilidades

Nossas análises de expressão ZNF93 endógena demonstrou que ZNF93 é frequentemente regulada em ET-743, PM00104 e múltiplas linhas celulares de cancro resistentes aos medicamentos cisplatina, ZNF93 down-regulação por siRNA poderia recuperar parcialmente sensibilidade a ET-743, PM00104 e cispatin. Estes resultados sugerem que a proteína pode ser ZNF93 criticamente envolvido no desenvolvimento de resistência a esses fármacos. Para determinar adicionalmente se ZNF93 participa directamente no estabelecimento do fenótipo resistente, que transfectada a linha celular sensível a ET-743 e CS-1 PM00104, com um vector de expressão gerado ZNF93 e linha de células estáveis ​​que sobreexpressam ZNF93 (Figura 6D). Em seguida, perguntou se a sobre-expressão exógena de ZNF93 foi suficiente para conferir um aumento de ET-743 e PM00104 resistência. Os resultados do ensaio de MTT nas linhas de células transfectadas são mostrados na Fig. 6. ZNF93 células CS-1 transfectadas são relativamente resistentes a ET-743, PM00104 e cisplatina, ao passo que não foi observada alteração significativa na resistência em células de CS-1 transfectadas com o vector vazio (Figura 6A a C). expressão ZNF93 elevada nas células transfectadas foi confirmada por real-time RT-PCR (Fig. 6D).

A

,

B Comprar e

C

: citotoxicidade relativa de ET-743, PM00104 e cisplatina no CS-1 linhas celulares derivadas (CS-1 /pIRES

ZNF93) estavelmente transfectadas com um

vetor de expressão ZNF93 pires e no parental (CS-1) e vector vazio (CS-1 /pIRES) controles foram avaliados utilizando o ensaio MTT. Todas as amostras foram analisadas em triplicado.

D

:. A confirmação da ZNF93 superexpressão em pIRES

ZNF93 transfectadas CS-1 células por real-time RT-PCR como descrito em Materiais e Métodos

Discussão

Os resultados de vários ensaios clínicos sugerem que a ET-743 tem actividade antitumor contra vários tipos de cancro, incluindo sarcomas dos tecidos moles, cancro da mama, cancro do ovário e [2], [3]. Pacientes com ovário avançado e cancro da mama, bem como osso ou sarcomas de tecidos moles tipicamente passam por várias linhas de regimes anti-câncer antes de finalmente sucumbir à sua doença. resistência a múltiplas drogas é pensada para desempenhar um papel importante na insuficiência inevitável de tumores para responder a cada sucessiva linha de quimioterapia. Portanto, compreender os padrões e mecanismos de resistência cruzada e encontrar formas de superá-lo é uma meta importante. Vários estudos têm estudado os mecanismos de resistência a drogas de ET-743 com diferentes abordagens. No entanto, resultados contraditórios têm sido publicadas a partir de vários grupos tentando correlacionar resistência a diferentes níveis de expressão do ARN e das proteínas em células resistentes a [9], [10], [13], [14], [21]. Outra resolução das diferenças entre estes resultados podem ser melhor facilitada pela análise de arranjo de genoma-wide da transcrição.

Neste estudo, relatamos criação bem-sucedida de duas linhas de células de condrossarcoma resistentes a ET-743 ou PM00104. Em seguida, perguntou como os níveis de expressão de genes relacionados a diferenças na resistência aos medicamentos nestas duas linhas celulares. Usamos Affymetrix Gene Chip U133 Plus 2 para examinar a expressão do genoma de transcrições de RNA. Em comparação com vários estudos usando conjunto de genes de menor escala, essa matriz abrange completamente todo o genoma humano com mais de 47000 transcritos. Nós validou os resultados de matriz gene para os genes com as mudanças mais significativas com real-time RT-PCR. Como esperado, existe um grande número de alterações transcricionais associadas com

In vitro

resistência a ET-743 e PM00104 adquirida. Com efeito, cerca de 5% a 10% (com corte fora valor de 2 vezes) de transcrições são sobre-expressos ou sub-expresso nas linhas celulares resistentes a CS-1 /ER e CS-1 /PR, em comparação com a célula parental sensível line.

na lista de top 20 mais de expressar genes tanto para CS-1 /ER e CS-1 /PR, os mesmos genes de proteínas dedo de zinco três, ZNF93, ZNF43 e ZNF568 (Tabela 2) foram todos identificado. Estes genes não foram anteriormente associada com resistência à droga. PCR em tempo real confirmou ZNF93 e ZNF43 são consistentemente mais expressa nestas linhas de células resistentes (Fig. 3). A avaliação preliminar de ZNF93 confirma que a sua expressão está associada com o fenótipo resistente a múltiplas drogas em linhas de células adicionais.