Humana

Abstract

aberrante acetilação das histonas desempenha um papel essencial no processo neoplásico através do silenciamento epigenético de tumor genes supressores (ETG); Portanto, a inibição de histona desacetilases (HDAC) tornou-se um alvo promissor na terapêutica do cancro. Para investigar a correlação de acetilação das histonas com características clínicas e expressão TSG, examinamos a expressão de H3 acetilada (AcH3), RARβ2, E-caderina e β-catenina por imuno-histoquímica em 65 pacientes com carcinoma de células escamosas do colo do útero. Os resultados revelaram que a ausência de AcH3 estava diretamente associado com a má diferenciação histológica e metástase ganglionar, bem como a expressão reduzida /negativo de RARβ2, E-caderina e β-catenina em amostras de tumor clínicos. Demonstramos ainda que a HDAC clinicamente disponíveis inibidores do ácido valpróico (VPA), e ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA), em combinação com o ácido all-trans retinóico (ATRA), pode superar as barreiras epigenética a transcrição de RARβ2 em células de cancro cervical humano. análise de imunoprecipitação mostraram que a cromatina tratamento combinado aumentou o enriquecimento de histona acetilada na região promotora RARβ2-raras. Em vista destes resultados, foram avaliados os efeitos anti-tumorais induzidas pelo tratamento VPA e ATRA combinados em um modelo de xenotransplante implantados com carcinoma humano pouco diferenciado de células escamosas. Notavelmente, o VPA restaurado expressão RARβ2 através da modulação epigenética. efeitos antitumorais aditivos foram produzidos em xenoenxertos de tumores através da combinação de VPA com o tratamento com ATRA. Mecanicamente, o tratamento combinado reativou a expressão de ETG RARβ2, E-caderina, P21

CIP1

e P53 e reduziu o nível de p-Stat3. Sequencialmente, regulação positiva de involucrina e loricrina, que indicam diferenciação terminal, contribuiu fortemente para a inibição do crescimento do tumor, juntamente com a apoptose parcial. Em conclusão, terapia-alvo com inibidores de HDAC e agonistas RARβ2 pode representar uma nova abordagem terapêutica para pacientes com carcinoma de células escamosas do colo do útero

Citation:. Feng D, Wu J, Tian Y, Zhou H, Zhou Y, Hu W , et ai. (2013) Segmentação de histona Desacetilases reativar genes supressores de tumor e seu potencial terapêutico em um xenoenxerto Modelo do cancro do colo Humano. PLoS ONE 8 (11): e80657. doi: 10.1371 /journal.pone.0080657

editor: Joseph Najbauer, Universidade de Pécs Medical School, Hungria

Recebido: 25 Abril 2013; Aceito: 06 de outubro de 2013; Publicação: 19 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Feng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (30901606, 81001168,81072127, 81.372.779 e 81.372.777) ea Anhui Provincial Natural Science Foundation (110406M176 e 110406M178). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

estudos recentes sugeriram que a alteração na estrutura da cromatina resultante da acetilação de histona pode ser importante para o processo neoplásico [1] – [3]. O estado de acetilação de histonas é determinada por desacetilase de histona (HDAC) e histona acetil-transferase (HAT). desenvolvimento do cancro é impulsionado por alterações genéticas e epigenética ao nível celular que activam e desactivam os oncogenes e os genes supressores de tumor (ETG), respectivamente [4]. O silenciamento transcricional pela desacetilação da histona é um dos mecanismos bem estabelecidos de ETG inactivação [1], [5] – [7]. Alguns estudos têm mostrado que histonas desacetiladas em regiões promotoras suprimir a expressão de ETG, tal como o

retinoblastoma

[8], β do receptor do ácido retinóico (

RARp

) [9],

p21

[10],

p53

[6],

p16

[11],

e-caderina

[5], e muitos outros. Assim, a inibição de enzimas HDAC tem sido largamente aceite como uma estratégia para a modulação da expressão do gene através da indução da hiperacet histona e a re-expressão de ETG silenciados.

De todos os ETG, RARβ2, e E-caderina desempenham um papel essencial na modulação do crescimento e diferenciação celular em ambas as células saudáveis ​​e malignos [9]. A capacidade do ácido retinóico para actuar como um agente quimiopreventivo é facilitado primariamente pela sua interacção com RARβ2 [9], [12]. E-caderina é uma molécula de adesão intercelular de células epiteliais, que se liga a p-catenina, para formar um complexo que desempenha um papel importante na manutenção da integridade morfológica do epitélio normal [13], [14]. Os estudos de tumores epiteliais mostraram consistentemente que a regulação negativa da RARβ2 é um acontecimento fundamental na malignidade e que a expressão aberrante subsequente de complexos de E-caderina /p-catenina se correlaciona com a conversão de tumores numa fase inicial em doenças malignas invasivas [15], [ ,,,0],16]. A perda de expressão RARβ2 em células tumorais tem sido atribuída ao silenciamento da região promotora do gene através de desacetilação da histona e hipermetilação. Portanto, a utilização de inibidores de HDAC, quer isoladamente ou em combinação com ADN metiltransferase (DNMT) inibidores, tem sido demonstrado para restaurar a transcrição e efeitos reguladores de crescimento de RARβ2 [9], [17], [18]. O nosso trabalho anterior também revelou que a combinação de ácido valpróico (VPA), um inibidor de HDAC clinicamente disponível, e o ácido trans-retinóico (ATRA) promove efeitos sinérgicos de reactivação RARβ2 dormente e fortemente inibir o crescimento celular do cancro do colo do útero

in vitro Comprar e

in vivo

, promovendo a diferenciação através da via PI3K /Akt [19]. No entanto, a nosso conhecimento, a correlação entre a acetilação das histonas e expressão TSG em amostras de tecido de cancro do colo do útero humanos ea exploração potencial da acetilação das histonas na terapia do cancro alvejado não foram totalmente avaliados. Neste estudo, nós investigamos acetilação das histonas H3 e expressão TSG no cancro do colo do útero e sua associação com os parâmetros clínico. Além disso, avaliou-se o potencial terapêutico do inibidor de HDAC VPA combinada com ATRA no tratamento de um modelo de xenoenxerto de tumor derivada de carcinoma cervical humano.

Materiais e Métodos

Ética declaração

este protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de Anhui Medical University Ética. As amostras de tecido do doente e embebidas em parafina utilizados neste estudo foram obtidos como descrito no nosso relatório anterior [20]. Os tecidos cancerosos para implantação em ratinhos foram obtidos a partir de pacientes com cancro do colo do útero. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente. Aprovação para

in vivo

experimentos envolvendo animais foi concedida pela Comissão do uso e cuidados de animais de Anhui Medical University.

Pacientes e amostras

incluídas em parafina fixado em formalina amostras de embutidos derivados de lesões cervicais em 65 pacientes diagnosticados com carcinoma de células escamosas do colo do útero foram extraídas dos arquivos do Departamento de Patologia da Anhui Hospital Provincial filiados à Universidade de Medicina de Anhui durante o período de 2002 a 2008. os estágios clínicos foram determinados por dois certificados ginecologistas de acordo com a Federação modificado Internacional de Ginecologia Obstetrícia (FIGO) sistema para o cancro do colo do útero publicada em 2000. os tumores foram classificados como bem – moderadamente ou pouco diferenciados – pelo menos por dois patologistas de acordo com os critérios propostos pela Organização Mundial de Saúde. informação detalhada clínico-patológico é mostrado na Tabela 1. Todos os pacientes foram tratados com histerectomia radical. Nenhum dos pacientes tinha recebido qualquer terapia específica do tumor antes da excisão cirúrgica.

Cultura celular e tratamento

linhas celulares de cancro cervical humano HeLa, SiHa, CaSki, e C33A foram adquiridos a partir de American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em DMEM (Gibco, EUA) com soro fetal bovino a 10% (Gibco). VPA (Sigma-Aldrich, EUA) foi dissolvido em PBS e utilizada a uma concentração final de 3 mmol /L. SAHA e ATRA foram adquiridos da Sigma-Aldrich, dissolvido em DMSO, e utilizado em concentrações finais de 10 umol /L e 1 nmol /L, respectivamente. As células foram tratadas com VPA ou SAHA sozinho ou em combinação com ATRA durante 48 h. As células de controlo foram tratados apenas com o veículo.

coloração imuno-histoquímica e imuno avaliação

Os blocos de parafina dos tumores foram cortados em 5

μ

m fatias e depois processados ​​usando o padrão técnicas deparaffinisation e reidratação. peroxidases endógenas foram bloqueadas com 3% de peróxido de hidrogénio. Para a recuperação de antigénio, os slides foram tratados por aquecimento por microondas em citrato de sódio 0,01 M (pH 6,0). As lâminas foram pré-incubadas em soro de cabra a 5% em TBS (pH 7,6) foram adicionados antes de anticorpos primários. Foram utilizadas as seguintes diluições de anticorpos primários: 1:100 de histona H3 acetilada (Santa Cruz, EUA), para 1:100 RARβ2 (Santa Cruz), 1:50 para E-caderina (Abcam, Reino Unido), para 1:100 β -catenina (Abcam), 1:100 para involucrina (Santa Cruz), 1:500 para loricrina (Abcam), e 1:200 para Ki67 (Boster, China). A ligação dos anticorpos primários foi visualizada utilizando o Kit de Detecção de ChemMate (Boster). As lâminas foram ligeiramente contrastadas com hematoxilina de Mayer durante 30 segundos

imunorreactividade foi avaliada semi-quantitativamente em função da intensidade da coloração e distribuição por avaliação imuno-reactividade do seguinte modo:. Pontuação intensidade × pontuação proporção [16], [21]. A pontuação intensidade foi definida como 0, negativa; 1, fraco; 2, moderada; ou 3, forte, ea pontuação proporção foi definida como 0, negativa; 1, 10%; 2, 11-50%; 3, 51-80%; ou 4, 80% de células positivas. A pontuação total variou de 0 a 12. A imunorreactividade foi dividido em três níveis na base do resultado final: a imunorreactividade negativo foi definida como uma pontuação total de 0; imunorreactividade baixa foi definida como uma pontuação total de 1 a 4; e alta imunorreatividade foi definida como uma pontuação total superior a 4. Os tecidos tumorais coradas foram marcados por dois pesquisadores que estavam cegos aos dados clínicos.

isolamento do RNA e PCR em tempo real quantificação

um micrograma de RNA total, o qual foi extraído dos tecidos, foi convertido em cDNA usando Superscript III transcriptase reversa (Takara, Japão). Quantitativa em tempo real Os ensaios de PCR (qRT-PCR) foram realizadas utilizando 50 ng de ADNc, os iniciadores específicos (Tabela 2), o SYBR®

Premix Ex Taq

Kit ™ (Takara), e uma real Opticon® 2 PCR em tempo instrumento (MJ Research, EUA). Os níveis de expressão de genes foram determinadas usando o método da curva padrão e expressos em relação à expressão GAPDH.

Os anticorpos e immunoblotting

A histona H3 acetilada (AcH3, 1:500), RARβ2 (1 :500), e involucrina (1:500) anticorpos foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology. O Stat3 (1:1000), p-Stat3 (1:2000), P21 (1:1000), e GAPDH (1:2000) anticorpos foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology. A E-caderina (1:500), β-catenina (1:5000), e loricrina (1:2000) anticorpos foram adquiridos a Abcam. A P53 (1:500), caspase-3 (1:1000), e Bcl-2 (1:200) anticorpos foram obtidos a partir de Boster Tecnologia. A proteína foi preparada a partir de tecidos de acordo com o kit (# 89900, Thermo, EUA) Manual, excepto a adição de um passo de extracção de ácido para histonas [19]. Após a electroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF), e sondados com os anticorpos primários indicados. A incubação com os anticorpos secundários específicos de espécie (Cell Signaling) foi realizada à temperatura ambiente durante 1 hora. As manchas foram reveladas com substrato quimioluminescente (Thermo), e auto-radiografia foi realizada com filme X-Omat (Kodak, Rochester, NY).

Cromatina ensaio de imunoprecipitação

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) foi realizada usando o kit EZ-chip Assay (Millipore, EUA) com um anticorpo chIP-grade para histona H3 acetilada (H3K9ac, Abcam). Resumidamente, as células de cancro cervical foram cultivadas em placas de cultura de 150 mm. As células foram então tratadas com VPA (3 mmol /L) ou SAHA (10 umol /L) sozinhos ou em combinação com ATRA (1 pmol /L) durante 48 h. As células foram, então, reticulado com 1% de formaldeído, durante 10 min à temperatura ambiente, e a reacção foi extinta com 0,125 M de glicina. As células foram raspadas, novamente suspensas em tampão de lise (1% de SDS, EDTA a 10 mM e Tris-HCl a 50, pH 8,1) suplementado com um cocktail inibidor de protease em gelo, e sonicadas para se obter fragmentos de ADN de 200-1000 pb de comprimento , tal como foi confirmado por electroforese em géis de agarose a 1%. O DNA cortado foi centrifugada a 12000 ×

g

a 4 ° C durante 10 min, e o sobrenadante foi recolhido. Dez por cento do sobrenadante foi reservado para utilização como ADN de entrada e processados ​​para ser posteriormente utilizada como um controlo positivo. cromatina solúvel foi imunoprecipitada durante a noite com um anticorpo anti-H3K9ac. O complexo cromatina imunoprecipitada foi recolhido utilizando esferas de agarose a G-proteína, e a reticulação foi revertido pela adição de NaCl até uma concentração final de 200 mM a 65 ° C durante 5 h. O ADN foi purificado utilizando colunas de rotação fornecidos com o kit. As amostras de DNA, bem como o material de entrada e as amostras de imunoprecipitação simulada, foram utilizados como moldes para semi-quantitativa e em tempo real de PCR para determinar o enriquecimento relativo do promotor RARβ2-raras. Os iniciadores para o promotor RARβ2-raras são apresentados na Tabela 2.

Implantação de xenoenxertos de tumores humanos originais em ratinhos e terapia com drogas

fêmea BALB /c foram obtidos quatro semanas de idade, ratinhos nus no Centro de animais de Laboratório da academia chinesa de Ciências (Xangai, China) e mantidos em um biotério livre de patógenos por 1 semana antes do uso. Um espécime de câncer cervical de carcinoma de células escamosas pouco diferenciado, o que foi confirmado pela histologia, foi obtida com o consentimento informado do paciente submetido a cirurgia dentro de 1 hora após a histerectomia. O espécime foi lavado com solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) contendo 10000 U /ml de penicilina e de estreptomicina e depois seccionado em pequenos pedaços de aproximadamente 2-4 mm

3 para implantação. Estes pequenos blocos de tecido foram implantadas no tecido subcutâneo dos três ratinhos nus no dorso utilizando um trocarte.

Após 6-8 semanas, uma porção dos nódulos de tumor que se desenvolveu foi excisada sob condições estéreis. Este espécime foi imediatamente subdividida em pequenos fragmentos e injectado em outros ratinhos nus. Uma vez que tumores palpáveis ​​foram estabelecidos, 20 ratos foram colocados aleatoriamente em quatro grupos: controle, VPA, ATRA, e de combinação. VPA foi diluída em cloreto de sódio a 0,9%, enquanto que o ATRA foi dissolvido em óleo de sésamo purificado. Os ratinhos foram administrados VPA (300 mg /kg /d) e /ou ATRA (15 mg /kg /d) diariamente por injecção intraperitoneal (i.p.) e a agulha de gavagem intragástrica (i.g.), respectivamente. O grupo controle recebeu apenas o veículo seguindo o mesmo cronograma. o volume do tumor foi medido com um calibrador duas vezes por semana e calculada de acordo com a seguinte fórmula: (comprimento x largura

2) /2. Os animais foram tratados durante 4 semanas e em seguida sacrificados. Os tumores foram colhidos e fixados com paraformaldeído a 4% para a avaliação patológica ou congelados em nitrogênio líquido por PCR, Chip, e immunoblotting análise assim como os tumores de massa foram registrados. inibição do crescimento do tumor (TGI) foi calculado subtraindo-se a partir de 100% da média tratada massa tumoral /média massa tumoral controle × 100%.

TUNEL ensaio

Após a recepção de cada amostra de tumor, uma pequena porção do tumor foi fixada em paraformaldeído a 4% e embebidos em parafina. Após desparafinização, as secções foram lavadas e permeabilizadas durante 5 min em gelo com 0,1% de Triton X-100 e em seguida incubadas com proteinase K (Sigma-Aldrich) durante 10 min à temperatura ambiente. TUNEL foi realizada utilizando um

in situ

kit de detecção de apoptose (Keygene Tecnologia, China), de acordo com as instruções do fabricante. As secções foram cobertas com TUNEL mistura reacção de marcação (tampão de equilíbrio, biotina-11-dUTP, enzima TdT) e incubou-se a 37 ° C durante 1 h numa câmara de humidade. As secções foram depois marcadas com estreptavidina-FITC no escuro durante 30 min. Após contracoloração com DAPI (2 mg /ml), as células TUNEL positivas foram contadas a partir de imagens de fluorescência tomadas a partir de 10 campos aleatórios em 200 × ampliação.

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote SPSS software (versão 13; SPSS Inc., EUA). A correlação entre os parâmetros clínico e dados de imuno-histoquímica foi avaliada usando o teste qui-quadrado ou teste exato de Fisher. A associação entre a expressão de AcH3, RARβ2, E-caderina e β-catenina foi analisada utilizando o teste do qui-quadrado para tendência linear. A concordância inter-observador na pontuação imunorreatividade entre dois pesquisadores foram avaliadas por k-estatísticas. De acordo com Fleskens [22], os valores de kappa 0.20 indicam concordância ruim; 0,21-,40 acordo justo; 0,41-0,60 concordância moderada; 0,61-0,80 boa concordância; e 0,81-1,00 excelente concordância. ANOVA foi utilizado para analisar a significância estatística para o enriquecimento relativo do promotor RARβ2 no ensaio chip e os modelos de xenotransplante

in vivo

. A

P

-valor de . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

características clínicopatológicos

Um total de 65 casos de célula escamosa cervical primária carcinoma foram analisados. Suas características clínico-patológicas, incluindo a diferenciação do tumor, estadiamento informações e metástase nodal, foram revisados ​​e estão resumidos na Tabela 1.

Associação das variáveis ​​clínico-patológicas com os níveis de AcH3, RARβ2, E-caderina, e β- expressão catenina

os resultados representativos da nossa análise imuno-histoquímica para AcH3, RARβ2, e-caderina, e β-catenina são mostrados na Figura 1. no epitélio cervical normal, todos os quatro parâmetros foram coradas positivamente nas células do suprabasal para a camada basal, com a expressão distinta de AcH3 nos núcleos, RARβ2 no citoplasma e núcleos, e e-caderina e β-catenina principalmente na membrana (Figura 1). No tecido canceroso, a intensidade imunorreactividade destas quatro parâmetros era forte em tumores bem diferenciados e reduzida no carcinoma moderadamente diferenciado, com rotulagem fraca ou negativa em carcinomas pouco diferenciadas (Figura 1A).

(A) O painéis da esquerda mostram as secções de tecido cervical normal. AcH3 coloração era forte nas células tumorais no carcinoma bem diferenciado. expressão AcH3 foi reduzido ou ausente em carcinomas moderadamente e pouco diferenciados, respectivamente. padrões de expressão semelhantes foram observados para a coloração de RARβ2, E-caderina, e β-catenina. (B) Não houve diferenças significativas nas pontuações imunorreatividade para AcH3, RARβ2, E-caderina e β-catenina entre bem, moderadamente, e carcinomas de células escamosas pouco diferenciados.

coloração imuno-histoquímica foi marcado por dois pesquisadores. A Tabela 3 mostra a concordância entre os dois pesquisadores para os três níveis de imunorreatividade para AcH3, RARβ2, E-caderina e β-catenina. A comparação dos resultados usando k-estatística mostrou excelente concordância para RARβ2 e E-caderina pontuação (κ = 0,840, 0,876) e um bom acordo para AcH3 e pontuação β-catenina (κ = 0,710, 0,657). O κ valor global foi de 0,778 (boa concordância), indicando concordância entre os escores imunorreatividade fornecidos pelos dois pesquisadores.

As relações entre as características clínicas e as pontuações imunorreatividade para AcH3, RARβ2, E- caderina e β-catenina são mostrados na Tabela 1. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas no que diz respeito à idade ou a fase clínica entre estes quatro parâmetros. No entanto, a expressão destes quatro parâmetros mostrou uma correlação significativa com a diferenciação histológica (

P Art 0,01) e com metástase nodal (

P Art 0,01) (Tabela 1). As distribuições de células de tumor coradas positivamente representada graficamente contra as suas pontuações de imunorreactividade nas amostras dos pacientes são mostradas na Figura 1B. AcH3, RARβ2, E-caderina e β-catenina expressão correlacionada positivamente com diferenciação histológica (r = 0,737, 0,531, 0,574 e 0,549, respectivamente,

P Art 0,01) (Tabela 1). Para acetilação H3, 94,4% (17/18) dos casos bem diferenciados mostraram níveis de expressão elevados, enquanto 37% (10/27) dos casos moderadamente diferenciadas mostraram níveis de expressão elevados. forte expressão não foi observada nos casos de pouco diferenciados (0/20). A proporção de tumores com elevada imunorreactividade para E-caderina e β-catenina foi mais de 72% em pacientes com tumores bem diferenciados. No entanto, para a expressão RARβ2, apenas 39% (7/18) dos pacientes tiveram uma pontuação total 4, enquanto que 61% (11/18) dos pacientes apresentaram menor imunorreactividade. Da mesma forma, houve uma correlação estatisticamente significativa entre H3 acetilação ea expressão de RARβ2, E-caderina e β-catenina (r = 0,560, r = 0,731, e r = 0,733, respectivamente,

P Art 0,01) (Figura 1B).

inibidores de HDAC em combinação com ATRA restaurar a expressão RARβ2 através

RARβ2-raras

Como se mostra na Figura 2A, o inibidor de HDAC SAHA (consistente com o nosso trabalho anterior sobre o VPA [19]), isoladamente ou em combinação com ATRA hiperacetila�o induziram fortemente da histona H3 e restaurado RARβ2 expressão em linhas celulares de cancro do colo do útero. Para melhor compreender o mecanismo de histona induzida por acetilação de re-expressão de RARβ2, foi realizado um ensaio de chip, utilizando um anticorpo anti-H3K9ac para determinar a ligação de histona H3 acetilada para a região do promotor RARβ2 (-168 /+ 22), que inclui região do núcleo dos raros (-55 /-35) e a caixa TATÁ (Figura 2B). O hiperacetilação de lisina 9 na histona H3 (H3K9ac) é geralmente associada a genes ativos [23]. Em comparação com o grupo de controlo, as células SiHa tratadas com inibidores de HDAC (10 umol /L SAHA ou 3 mmol /L de VPA) sozinho durante 48 horas mostraram um aumento significativo no enriquecimento de RARβ2-raras com base em semi-quantitativo (Figura 2C) e PCR em tempo real (Figura 2D). O efeito foi maior quando as células foram tratadas com ambos os inibidores de HDAC e ATRA (1 pmol /L). Este tratamento combinado foi mais eficaz na indução da acetilação das histonas na região RARβ2-RARA do que qualquer droga. Estes resultados indicam que o raro no promotor RARβ2 é funcional e que acetilação das histonas na região RARβ2-RARE está intimamente correlacionado com RARβ2 re-expressão em células de câncer cervical.

(A) SAHA (10 mmol /L ) tratamento durante 48 h, quer isoladamente ou em combinação com ATRA (1 pmol /L), induziram fortemente a hiperacetila�o da histona H3 e restaurado RARβ2 expressão em células HeLa, SiHa, CaSki, e células C33A. (B) Esquema de região de promotor-RARβ2. Os exões de RARβ2 são representados por caixas pretas. A seta indica o sítio de iniciação de transcrição-. A região por PCR (-168 a +22) para o ensaio de ChIP incluiu a região de núcleo do RARA, a caixa TATA e 22 pb do exão 1. (C) dados do chip-PCR representativos. Os produtos de PCR foram visualizados por meio de um gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio. Amostras (D) de ADN a partir do anti-H3K9ac IP, bem como o material de entrada e as amostras de imunoprecipitação simulados foram quantificados por PCR em tempo real. O tratamento com 10 nmol /L SAHA ou 3 mmol /L de VPA conduziu a um aumento significativo no processo de enriquecimento RARβ2-raras. O maior aumento no enriquecimento RARβ2-RARE foi observado com o tratamento combinado. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01

tratamento combinado de VPA e ATRA inibe a progressão de xenoenxertos de tumores derivados de doadores humanos

Quatro semanas após a implantação inicial do carcinoma cervical derivado de um dador humano, o tumor tornou-se reconhecível no local de transplante e continuou a crescer lentamente. Observou-se uma taxa de crescimento rápido na segunda geração; levou apenas 2 semanas para um xenoenxerto perceptível a se formar. O exame histológico revelou características que eram muito semelhantes aos de carcinoma cervical do paciente original (Figura 3D)

Após os tumores eram palpáveis, os ratinhos foram aleatoriamente divididos em quatro grupos:. de controlo (veículo), VPA (300 mg /kg VPA), ATRA (ATRA 15 mg /kg), e combinação. Os diferentes tratamentos foram administrados diariamente durante 28 dias. Os volumes de tumor e pesos de rato foram calculadas a cada dois dias. A combinação de VPA e visivelmente ATRA inibiu o crescimento de xenoenxertos de tumores em comparação com o mesmo fármaco único ou do tratamento com veículo (

P

0,05) (A). No dia 28, os ratinhos foram sacrificados, e xenoenxertos de tumor foram colhidas (B). dados massa tumoral foram consistentes com os volumes dos tumores. Mais regressão no crescimento do tumor foi observada para o tratamento combinado do que para as administrações de fármaco único (

P

0,05) (C). VPA e o tratamento de combinação notavelmente melhorado o grau de diferenciação histológica. células cancerosas individuais tinham abundante citoplasma queratinizado eosinofílica (cabeças de seta), e figuras mitóticas estavam ausentes. Os xenoenxertos de tumores tratados com o veículo ou ATRA permaneceu pouco diferenciado, semelhante aos tumores humanos originais. As figuras de mitose (setas) é comum nestas amostras e o citoplasma é eosinofílica para amphophilic, com queratinização mínimo ou ausente (D). *

P

. 0,05 versus o grupo tratado com o fármaco único

Para determinar o efeito da ATRA VPA e sobre o crescimento de xenoenxertos de tumor, os animais receberam veículo como controlo, o VPA (300 mg /kg /d ip), ATRA (15 mg /kg /d Ig), ou a combinação de tratamento durante 28 dias, como os tumores foram estabelecidos. O tratamento não tem toxicidade evidente nos ratos. Após 28 dias, o volume médio do tumor para o grupo de tratamento combinação foi 66,84 ± 19,10 milímetros

3, enquanto que os volumes de tumor para os ratinhos tratados com veículo, o VPA e o ATRA foram 316.65 ± 94.58 mm

3, 119,83 ± 7,74 mm

3, e 208.64 ± 76,61 milímetros

3, respectivamente (Figura 3A e B). Consistente com os dados do volume do tumor, o peso médio do tumor do grupo de controlo foi de 0,99 ± 0,09 g, ao passo que os pesos de tumor para o VPA, ATRA, e os grupos de tratamento com combinação foram 0,402 ± 0,02 g, 0,618 ± 0,16 g, e 0,264 ± 0,09 g, respectivamente (Figura 3C). Estes dados indicam que os xenoenxertos foram suprimidos por 59,39%, 37,58% e 73,33% (percentagem de inibição de tumor para o crescimento, TGI%) para o VPA, ATRA, e tratamentos, respectivamente (Figura 3A) combinado. Os dados mostram que o tratamento de combinação resultou em maior inibição do crescimento de xenoenxertos de tumor do que o tratamento quer de um único medicamento.

Importante, a aparência histológica demonstrou que o VPA e o tratamento de combinação melhorou o grau de diferenciação histológica nos xenoenxertos tumorais . Tal como mostrado na Figura 3D, a partir de xenoenxertos de células de cancro tratados com VPA isoladamente ou em combinação com ATRA tem abundante eosinofílica citoplasma queratinizado, enquanto as figuras mitóticas estão ausentes ou só ocasionalmente observado. No entanto, as células cancerosas nos tecidos de ambos os grupos controle e tratados com ATRA foram pouco diferenciado. figuras mitóticas eram comuns (campo de alta potência 2-4 por no grupo controle, mas ≤2 por campo de alta potência no grupo tratado com ATRA), e o citoplasma foi eosinofílica para amphophilic, enquanto queratinização foi mínima ou ausente, semelhante ao o carcinoma de origem. Estas observações foram adicionalmente verificadas por coloração imuno-histoquímica para a involucrina e loricrina (marcadores de diferenciação terminal de epitélio) em tecidos de xenoenxertos de tumores (Figura 4). A expressão de involucrina e loricrina foi induzida de forma significativa em tumores de ratos tratados apenas com o VPA, em comparação com os tumores de ratinhos de controlo e murganhos tratados com ATRA. Os maiores níveis de expressão de involucrina e loricrina foram encontrados nos tumores dos ratinhos tratados com a combinação de drogas. A proliferação celular foi avaliada por coloração de Ki67. O tratamento com VPA, em combinação com ATRA levou a uma redução significativa em células Ki67-positivas em comparação com o VPA, ATRA, ou do tratamento com veículo (13,0%

vs 39,4, 71,2, e 78,6, respectivamente;.

P

0,05) (Figura 5B). Além disso a indução da diferenciação, o VPA também promove a apoptose [24]. Para explorar este efeito, foi realizada a coloração TUNEL de avaliar a apoptose em xenoenxertos de tumor (Figura 5A). Em tumores de ratinhos de controlo, o número de células apoptóticas foi mínimo (3,6 ± 1,14). O número de células apoptóticas em tumores a partir de ratinhos tratados com ATRA não foi significativamente diferente daqueles em ratinhos tratados com VPA isoladamente ou o veículo. Houve um aumento significativo em células apoptóticas (20,60 ± 4,16) nos tumores tratados com combinação.

O tratamento com VPA sozinho aumentou significativamente o nível de acetilação da histona H3, restaurado expressão RARβ2, e induzida a expressão do terminal marcadores de diferenciação involucrina e loricrina, enquanto o tratamento com a combinação de VPA e ATRA levou a maior efeito na reativação expressão destes genes em comparação com qualquer tratamento medicamentoso único. células positivas pequenas foram observadas nos tecidos do grupo tratado com ATRA.

(A) celular apoptose foi avaliada utilizando o ensaio TUNEL. As células apoptóticas (verde) foram contadas a partir de imagens de fluorescência tomadas a partir de 10 campos aleatórios a 200 × ampliação. O tratamento com a combinação de VPA e ATRA aumentou significativamente a apoptose em comparação com o veículo ou o tratamento de um único medicamento. proliferação (B) celular foi avaliada por meio da coloração Ki67. A distribuição das células Ki67-positivas foi marcado por dois pesquisadores. Uma diminuição significativa no número de células Ki67-positivas foi observado em tumores tratados com a combinação de drogas, em comparação com tratamento com VPA isoladamente. Não só foi diminuir ligeiramente no número de células Ki67-positivas no grupo tratado com ATRA em comparação com o grupo de controlo. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, em relação ao grupo controle

VPA e ATRA restaurar a expressão RARβ2 via modificação epigenética e sequencialmente. inibir o crescimento tumoral, reativando expressão ETG

A histona H3 status de acetilação das xenotransplantes tumorais foi determinada utilizando imuno-histoquímica e análise de Western blot. Como mostrado nas Figuras 4 e 6, o tratamento com VPA aumentou significativamente o nível de H3 acetilada em comparação com o controlo e o grupo de ATRA. Quando combinado com ATRA, VPA exibiu um efeito aditivo na alteração evidente epigenética histona. Para investigar o efeito destes reagentes sobre o nível de acetilação da histona na região RARβ2-promotor, foi realizado um ensaio de chip.