Abstract

Fundo

deubiquitinating (Dubs) são proteases que processam correntes em proteínas-alvo ubiquitina (Ub) ou produtos de genes de ubiquitina-like, poliubiquitina remodelação (-como), e contrariar ubiquitinação de proteínas exercida pela ubiquitina-ligases E3. A riqueza de estudos estabeleceu a relevância do Dubs para o controle de processos fisiológicos cuja subversão é conhecido por causar transformação celular, incluindo a progressão do ciclo celular, reparo do DNA, endocitose e transdução de sinal. expressão alterada de Dubs pode, portanto, subverter tanto a funções de sinalização do sistema Ub proteolítica e.

Metodologia /Principais Achados

Neste estudo, relatamos a primeira exibição abrangente de DUB desregulação em cancros humanos por hibridação in situ em Tissue microarrays (ISH-TMA). ISH-TMA provou ser uma metodologia confiável para conduzir este tipo de estudo, especialmente porque permite a identificação precisa da origem celular dos sinais. Assim, os sinais associados com o componente de tumor podem ser distinguidas das que são associados com o microambiente do tumor. As amostras derivadas a partir de vários tecidos normais e tumorais malignas foram analisados, e as amostras “normais” foram derivados, sempre que possível, a partir dos mesmos pacientes de quem foram obtidos tumores. Dos -90 dobragens codificadas pelo genoma humano, 33 foram encontrados para ser expresso em pelo menos um dos tecidos analisados, dos quais 22 foram alterados em cancros. Dubs selecionados foram submetidos a uma validação adicional, através da análise de sua expressão em grandes grupos de amostras de tumores. Esta análise revelou correlações significativas entre a expressão DUB e parâmetros clínicos e patológicos relevantes, que eram, em alguns casos indicativo de doença agressiva.

Conclusões /Significado

Os resultados aqui apresentados demonstram que DUB desregulação é um evento frequente no cancro, e têm implicações para abordagens terapêuticas baseadas na inibição DUB

Citation:. Luise C, Capra M, Donzelli M, Mazzarol G, Jodice MG, Nuciforo P, et al. (2011) Um Atlas de expressão alterada de deubiquitinating Enzimas em Câncer Humano. PLoS ONE 6 (1): e15891. doi: 10.1371 /journal.pone.0015891

editor: Maria Masucci, Karolinska Institutet, na Suécia

Recebido: 02 de outubro de 2010; Aceito: 29 de novembro de 2010; Publicação: 25 de janeiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Luise et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiado por subsídios da Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, a Comunidade Europeia (FP6 e FP7), o Conselho Europeu de Investigação, os Ministérios da Educação italiano-University-Investigação (MIUR) e da Saúde, a Fundação Ferrari, o Monzino Foundation e da Fundação CARIPLO para PPDF. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a modificação pós-tradução de proteínas com mono- ou poli-ubiquitinação é crítico para a regulação de proteína estabilidade, actividade e interacções. Através da modulação de estas propriedades da proteína alvo, ubiquitinação controla vários programas celulares, incluindo a transdução de sinal, transporte vesicular, a transcrição, a apoptose, a remodelação da cromatina e de reparação do ADN [1] – [7]. Semelhante a outras modificações covalentes, tais como fosforilação ou metilação, ubiquitinação é reversível. Aproximadamente 100 deubiquitinating (dobragens) são codificados pelo genoma humano, dos quais 90 parecem ser expressa [8]. Estas enzimas clivar a ligação isopeptídica entre o substrato de proteína e resíduos da ubiquitina (Ub), terminando assim a sinalização Ub-dependente. Dobragens pertencem à super família de peptidases, especificamente para as famílias de cisteína e metalo-peptidase. Com base no seu domínio Ub-protease, as dobragens cisteína-peptidase pode ser ainda organizada em quatro subclasses: Ub hidrolases do terminal carboxilo, família 1 (UCH) e 2 (USP) [9], do tumor semelhante dos ovários (OTU ou ) proteases OTUBIAN [10], [11], e a proteases doença de Machado-Joseph (DMJ ou MACHADO) [12]. Além disso, uma classe de DUB metalo-enzimas tem sido descrito:. A JAB1 /NMP /Mov34 (JAMM) da família [13]

Dubs participar na regulação de várias funções biológicas. Alguns chama de ter sido encontrada em complexo com o proteassoma, onde é necessária a sua função para a degradação de proteínas e reciclagem Ub [14], [15]. Em outros casos, dobragens estão envolvidas na remodelação do conteúdo Ub de proteínas alvo, um mecanismo referido como Ub-edição. Este processo pode ser envolvido no salvamento de proteínas erroneamente ubiquitinadas de degradação proteossómica, ou na fina modulação da quantidade e do tipo de cadeias Ub ligados a substratos particulares [16]. Finalmente, e não é surpreendente dada a grande envolvimento do sistema Ub na sinalização intracelular, praticamente todos os aspectos da regulação celular é cortada por Dubs, incluindo regulação da transcrição, a remodelação da cromatina, o tráfico vesicular intracelular, reparo do DNA, progressão do ciclo celular, apoptose e cascatas de transdução de sinal quinase (para revisões recentes ver [17], [18]).

Subversion de Dubs pode, portanto, alterar tanto as funções de sinalização do sistema Ub proteolítica e. Isto prevê-se que afectam a homeostase celular e, em certas circunstâncias, para promover a transformação celular. Na verdade, ambos os papéis supressores oncogénicos e de tumores têm sido propostos para uma série de dobragens [18], [19], levando ao conceito de que eles podem representar alvos atraentes para novas terapias de cancro ([20], [21] e referências aí contidas) . Assim, uma melhor compreensão dos papéis funcionais de dobragens em cancro pode ter consequências importantes para o tratamento do cancro, especialmente à luz dos recentes avanços no desenvolvimento de inibidores de moléculas pequenas específica-DUB [22]. No entanto, compreender o papel exacto do Dubs em cancros “reais” é complicada pelo fato de que Dubs ter vários substratos. Assim, um atlas de alterações DUB no câncer humano pode fornecer uma ferramenta importante para direcionar desenvolvimentos farmacológicos futuros. Ao nível genético, mutações ou rearranjos /translocações de Dubs parecem raros (com a ressalva importante que a questão não tem sido extensivamente investigado). Por outro lado, alterações nos níveis de expressão parecem ser mais frequentes (para revisões recentes do Dubs relacionadas com o cancro, veja [18], [19]). Aqui, nós relatamos a primeira exibição abrangente de alterações na expressão DUB em nove cancros humanos. Este estudo representa o primeiro passo para a elaboração de um catálogo sistemático de DUB desregulação no câncer.

Resultados

Desenho do estudo

Um esquema do desenho do estudo é mostrada na Figura 1A. Um total de 89 genes que codificam DUB foram analisados ​​por

In situ

hibridação (ISH) em microarrays de tecido multi-tumorais (TMA). Utilizou-ISH /TMA como a plataforma de triagem porque, entre tecnologias de ARN baseado, ISH /TMA acopla as vantagens de uma metodologia médio /alto rendimento (centenas de genes podem ser rastreados em centenas de tumores) com os de uma tecnologia de alta resolução (cada núcleo pode ser analisada por exame visual, permitindo assim a identificação da origem celular do sinal num tecido heterogéneo). Temos anteriormente extensivamente validado a especificidade e a gama dinâmica de detecção deste método (por exemplo, em comparação com os obtidos com métodos altamente quantitativos, tais como Q-PCR), em um certo número de grandes projectos de rastreio [23] – [26 ]. A ISH /TMA rastreio conduziu à identificação de dobragens 22 que foram desregulados em cancros humanos, para um total de 34 ocorrências de desregulação (Figura 1A). Dubs selecionados foram submetidos a mais uma validação através da análise de sua expressão em grandes grupos de amostras de tumor (Figura 1A).

A. Um esquema do desenho do estudo é mostrado. À esquerda (em caixa em preto), estratégia e resultados da ISH /triagem TMA; direito (caixa em vermelho), a estratégia das análises prolongadas (detalhes estão no texto principal). Todas as dobragens expressas em tecidos humanos (90, de acordo com [8]) foram analisados; no entanto, a sequência do membro da família JAMM ENSG00000198817 foi retirado do banco de dados ENSEMBL; Além disso, o contexto genómico para que esta transcrição putativo foi designado (CHR2: 58,390,463-58,391,299) (ver Tabela S1 em [8]) corresponde agora ao gene FANCL que é uma ligase E3. B. A desregulação dos dubs em cancros humanos. Os níveis médios de expressão em diversos tumores humanos (T) e tecidos normais correspondentes (N) estão representados por um código de cor semi-quantitativo, que reflecte as pontuações médias ISH. Os valores reais (e

valores P

) estão listadas na Tabela S3. marca asteriscos estatisticamente significativa (

P

≤.05) diferenças (asteriscos preto, regulação positiva; asteriscos vermelhos, downregulation). ** Nevos benignos foram usados ​​como contrapartes normais de tecidos para melanomas. *** Para linfomas não-Hodgkin (NHL), foram utilizados tecidos de nódulos linfáticos reactivos como a contrapartida normal.

Análise das alterações na expressão DUB em cancros humanos por ISH /TMA

Foram triados por ISH tumores /TMA -300, incluindo carcinomas da mama, do cólon-recto, da laringe, do pulmão (carcinoma de pulmão de células não-pequenas, NSCLCs), do estômago, do rim e da próstata, linfomas não-Hodgkin (NHL) e melanomas (a composição da TMA é descrito na Tabela S1). Além disso, nós analisamos ~260 amostras normais a partir dos mesmos tecidos (com freqüência, e sempre que possível, do mesmo paciente, consulte a Tabela S1, pois NHL, usamos tecido de linfonodo reativo como a contrapartida normal, enquanto para melanoma usamos nevos benignos ). Os 89 Dubs selecionados incluiu 55 PSU, 4 UCHs, 5 MJDs, 13 OTUs e 12 JAMMs (listados e descritos na Tabela S2).

Dos 89 transcrições analisados, 33 (37%) poderiam ser detectados ( pontuação ISH 1) em, pelo menos, um dos tecidos analisados ​​(Tabela S3). Os genes restantes eram ou indetectável (40 genes) ou mal (16 genes) detectável nos tecidos analisados, provavelmente devido à baixa abundância mRNA. É de notar que em todos os casos em que as sondas anti-sentido produziram sinais positivos, a sonda de sentido correspondente, utilizado como controlo negativo, não deu qualquer sinal apreciável (dados não apresentados). O conjunto completo dos resultados é mostrado na Tabela S2 e S3 Tabela.

Vinte e duas dobragens foram desregulado (67% de todos os genes detectáveis ​​e ~ 25% de todos os genes filtrada) de um modo estatisticamente significativo (Figura 1B , e Tabelas S2 e S3) em pelo menos um tipo de tumor (ver Figura 2 para os exemplos representativos). Onze outros mRNAs DUB (CYLD, USP2, USP4, USP7, USP15, USP18, USP21, USP25, USP49, PRPF8, OTUB1) foram expressos em vários tecidos ou tumores, mas não foram significativamente desregulado (ver Tabela S3). Em geral, houve 34 casos em que um DUB específica foi significativamente desregulados num dado tipo de tumor, no que diz respeito ao homólogo normal; Destas, 22 (65%) foram upregulations, enquanto que 12 (35%) foram downregulations (Figura 1B). Surpreendentemente, 9 upregulations ocorreu em carcinomas de laringe, enquanto 6 downregulations ocorreu em LNH. O carcinoma da mama foi o único tipo de tumor em que observamos tanto para cima e para baixo-regulação. Sem dobragens foram significativamente desregulado em carcinomas da próstata, e somente uma foi encontrada no rim (UCHL1, regulada negativamente), o que sugere que os diferentes tipos de tumores exibem diferentes níveis de alteração da máquina desubiquitinação. Finalmente, enquanto 15 Dubs foram encontrados para ser significativamente desregulada em apenas um tipo de câncer, 7 (UCHL1, USP9X, USP11, USP10, USP22, COPS5 e COPS6) exibido múltiplas alterações em dois ou mais tipos de tumor (Figura 1B).

Exemplos dos dados resumidos na Figura 1B são mostrados para os tecidos normais e tumorais. Em cada par, o painel superior é um campo luminoso (para avaliação morfológica) eo painel inferior é um campo escuro (transcrições aparecem como pontos brilhantes). Ampliações de áreas selecionadas também são mostrados abaixo de cada núcleo individual.

Com implicações terapêuticas em mente, os dubs mais interessantes foram os expressos em níveis baixos ou indetectáveis ​​na maioria dos tecidos normais, enquanto está a ser regulada em pelo menos um tipo de tumor. Nestes casos, as dobragens frequentemente desreguladas exibido sobre-expressão apenas em uma fracção de amostras de tumores, sugerindo que os seus níveis pode também ser útil para a estratificação de pacientes para a elegibilidade para terapia anti-DUB. Por exemplo, UCHL1 em ​​carcinomas do pulmão (de igual modo, em carcinomas da laringe) foi fortemente expresso em 7 de 25 amostras de tumores (28%), enquanto que foi completamente indetectável no homólogo normal. Além disso, USP31 foi altamente expressa em 8 dos 27 carcinomas da laringe (30%), e apenas em 2 de 31 tecidos normais, onde a sua expressão foi restringida à camada basal proliferativa (dados não mostrados).

análise estendida de Dubs selecionados em grandes grupos de pacientes com tumor

Para investigar mais as alterações de dubs em cancros humanos, foi analisada a expressão de Dubs selecionados em grandes grupos de tumores humanos. Estamos concentrados no CPNPC e melanomas como exemplos de tumores abrigando upregulation frequente de dubs, e carcinomas gástricos como exemplos de tumores que exibem regulação baixa de Dubs

Em CPNPC, quatro Dubs foram significativamente sobre-expresso:. JOSD1, COPS5 UCHL1 e USP9X ( A Figura 1B). JOSD1 ainda está totalmente descaracterizados no nível funcional, e foi, portanto, não investigado. COPS5, por outro lado, tem sido extensivamente caracterizado em tumores, incluindo CPNPC (ver discussão), tornando a sua caracterização adicional necessário menos. Estamos concentrados, portanto, na análise de UCHL1 e USP9X por ISH /TMA em um caso coleção de 420 amostras de NSCLC consecutivos (descrito na Tabela S4). Observou-se que a expressão UCHL1 diretamente correlacionado (P 0,001) com o grau do tumor, sexo e expressão Ki67, enquanto que a expressão USP9X diretamente correlacionada com a expressão Ki67 (P 0,001; Tabela 1). Além disso, ambos os dubs foram mais frequentemente expressa em carcinomas de células escamosas do pulmão (SSC), em comparação com adenocarcinomas (AC).

Na primeira triagem de amostras de melanoma, cinco genes (USP10, USP11, USP22, USP48 e COPS5) foram significativamente sobre-expressa, em comparação com nevos benignos. Foi realizada uma análise em profundidade sobre quatro deles (COPS5 não foi analisada pelas razões mencionadas no parágrafo anterior) em uma grande coleção de casos de melanoma (descrito na Tabela S5). A expressão de três dos quatro genes analisados ​​(USP10, USP11, USP22) foi significativamente superior no melanoma metastático, quando comparada com nevos benignos e tumores primitivos (Tabela 2), sugerindo que a sua expressão está associada a um fenótipo mais agressivo e invasivo. Esta conclusão é corroborada pela correlação significativa observada entre a expressão DUB e os parâmetros clínico-patológicos indicativos de doença avançada (Tabela 2), incluindo o índice de Breslow (para USP10 e USP22), o índice de Clark (para USP22, USP11 exibido uma correlação limítrofe) , a presença de ulceração (por USP10 e USP22), e o número de células mitóticas (por USP10 e USP22, USP11 exibida uma correlação limite). expressão USP48 não se correlacionou com nenhum parâmetro clínico-patológicos uma vez que os baixos níveis de transcrição foram detectados em quase todas as amostras de tumores ( 95%, dados não mostrados). Assim, num número significativo de casos de melanoma, expressão DUB correlacionada com alguns dos fatores prognósticos mais forte conhecido, projetando sua utilidade em modelos prognósticos.

Finalmente, medimos a expressão de USP1 em um câncer gástrico “progressão” TMA contendo epitélio normal, gástrica, metaplasia intestinal, displasia, carcinomas primários e metástases (Tabela S6). Observou-se que a expressão de USP1 foi perdido na transição do estado normal para o estado metaplásico (Tabela 3, ver também a Figura 1B e Figura S1). Todos os tecidos gástricos anormais e neoplásicas foram negativos para a expressão USP1, possivelmente indicando que este evento se correlaciona com os passos iniciais da transformação da mucosa gástrica.

Discussão

Aqui, nós fornecemos o primeiro atlas de alterações da expressão DUB em cancros humanos. O repertório completo do Dubs codificada pelo genoma humano foi analisado em nove tipos de câncer, que incluiu os quatro cancros mais frequentes (pulmão, próstata, mama, cólon-recto), e que representam terços ~two de todos os casos de câncer e câncer mortes no mundo ocidental.

Vinte e dois dubs foram encontrados para ser significativamente desregulada em pelo menos um tipo de câncer. Em sete casos (UCHL1, USP9X, USP11, USP10, USP22, COPS5 e COPS6), desregulação foi observada em mais do que um tipo de tumor. Considerando que apenas 33 dos 89 Dubs selecionados exibido sinais ISH quantificáveis, parece que estas enzimas são frequentemente alterados em cancros humanos. Obviamente, desregulação em tumores não constitui

per

provas se para uma participação causal no câncer. Em nossas análises prolongadas, no entanto, observou-se uma associação entre a expressão de Dubs selecionados e parâmetros clínico-pathalogical relevantes, em alguns casos indicativos de doença agressiva. Estes dados apoiam a ideia de que, pelo menos, algumas das desregulações detectados podem ter um papel na tumorigénese. Além disso, algumas das dobragens caracterizadas pode fornecer marcadores úteis para avaliação de diagnóstico /prognóstico (por exemplo, USP10, USP11 e USP22 em melanoma), ou podem representar alvos terapêuticos (por exemplo, dobragens que são altamente expressas em tumores, mas ausente em tecidos normais ), independentemente do seu papel exato na tumorigênese.

Vários dos Dubs desregulados identificadas aqui já foram mostrado para ser envolvido no cancro (por comentários recentes ver [18], [19]). Por exemplo, COPS5 é sobre-expresso em vários tipos de tumor [27], [28], e sua sobre-expressão está associada a curto livre de doença e sobrevida global de câncer de pulmão [29], [30]. Com efeito, COPS5 tem sido proposto como um alvo para o desenvolvimento de drogas anti-cancro [31].

expressão USP9X foi mostrado para promover a auto-renovação de células progenitoras neurais derivadas de células estaminais embrionárias, agindo como um stemness neural gene [32]; que promove a sobrevivência celular através da estabilização MCL1, que é essencial para a sobrevivência de células estaminais e progenitoras de linhagens múltiplas [33]. Encontramos USP9X overexpressed no cancro do pulmão, o que sugere que este evento pode ser ligado à expansão do compartimento de células estaminais do câncer nesta tumor:. Uma possibilidade que merece uma investigação mais aprofundada

A sobre-regulação da expressão UCHL1 foi observada em biópsias brônquicas de fumantes em comparação com não-fumantes [34], e sua expressão tem sido associada à evolução da doença no câncer de pulmão [35], [36]. Além disso expressão UCHL1 em ​​fibroblastos associados ao câncer de câncer colorretal foi encontrado para ser um fator prognóstico independente para sobrevida global e livre de recidiva [37]. Finalmente, a sua sobre-expressão fortemente acelerada lymphomagenesis em ratinhos transgénicos Eμ-myc através do reforço da AKT sinalização [38].

Outro exemplo é representado por USP22, que é parte de um pequeno conjunto de genes marcadores capazes de predizer metastático resultado potencial e terapêutico no cancro humano [39], [40]. USP22 é overexpressed em câncer colorretal e sua ativação é associada com a progressão do tumor e falha terapêutica [41]. USP22 pode exercer o seu potencial oncogénico através da assinatura via impulsionado-oncogene BMI-1, ativando genes c-Myc-alvo, tais como ciclina D2 [41]. Notavelmente o tratamento com siRNA específico-USP22 e aiRNA (assimétrica ARN interferente) inibe o crescimento de tumores da bexiga implantados in vivo [42], possivelmente através da regulação negativa das proteínas MDM2 e ciclina E, resultando na estabilização de p53 e p21 e consequente paragem do ciclo celular [42].

em todos estes casos, os nossos resultados suportam a noção de que estas dobragens desempenham um papel importante no cancro humano, e representam ainda mais a questão de que os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela sua desregulação. Além disso, será de interesse para testar se alterações genéticas que afectam directamente os genes para as enzimas teses pode ser evidenciado no câncer.

Por outro lado, para muitos outros Dubs (USP31, USP39, USP48, PSMD14, USP1, PSMD7 , STAMBP, USP16, USP24, COPS6, EIF3S5 e JOSD1) nossos resultados representam, para o melhor de nosso conhecimento, o primeiro relatório de alterações no câncer. Dois destes dobragens, PSMD7 e PSDM14, são componentes do proteassoma, e pode, por conseguinte, ser de relevância directa para terapia, incluindo estratificação paciente, tendo em conta o facto de o inibidor da proteasoma bortezomib já foi aprovada para o tratamento de mieloma múltiplo e linfoma de culas do manto [43], e que os ensaios clínicos adicionais para o tratamento dos tumores sólidos e outros tumores malignos hematológicos estão em curso [44]. Em particular, PSMD14 foi identificado como um importante DUB do complexo tampa 19S do proteassoma [45]. A sua actividade é essencial para a degradação do substrato durante desubiquitinação proteossómica [46], e podem também desempenhar um papel na edição de substratos polyubiquitinated como um meio para controlar a degradação, possivelmente de um modo independente de proteossoma [47], [48]. Além disso PSMD14 tem sido demonstrado que o factor de transcrição deubiquitinate Jun; sua sobre-expressão contribui para a estabilização Jun e activação dos seus genes alvo a jusante [49], conferindo assim resistência moderada a fármacos quimioterapêuticos [50]. Será, portanto, de interesse para avaliar se a possível contribuição de PSMD14 ao câncer humano ocorre através de funções independentes de proteossomal-dependente ou.

A possível relevância de DUB desregulação de cânceres humanos é melhor apreciada no âmbito da disponíveis conhecimento sobre o seu papel na circuitos bioquímicos envolvidos na regulação celular. Embora uma discussão abrangente das funções conhecidas de todos os dubs desregulados identificados neste estudo será impossível aqui (ver, no entanto Tabela S2 e [8], [18], [19] para ser avaliado recentes das funções bioquímicas do Dubs implicados no câncer ), gostaríamos de destacar brevemente algumas das características funcionais dos dubs que foram extensamente validadas no presente estudo (USP9X, UCHL1, USP1, USP10, USP11, e USP22). Estes Dubs estão envolvidos na regulação de funções celulares relevantes para o cancro, incluindo vias de transdução de sinal, apoptose, transcrição, regulação da cromatina, e processos de reparação do ADN.

USP9X, UCHL1 e USP11 têm sido implicados na regulação da vias de transdução de sinal. USP9X interage com β-catenina

in vitro

e

in vivo

[51], [52] e, provavelmente, medeia a sua desubiquitinação, aumentando assim a sua meia-vida [51]. UCHL1 pode estar envolvido na mesma via, uma vez que forma complexos endógenos com β-catenina, estabiliza, e regula positivamente a transcrição β-catenina /TCF-dependente [53]. Além disso, UCHL1 e β-catenina pode positivamente regular os outros [53]. Os efeitos de USP9X, e possivelmente de UCHL1, pode a activação, portanto, mímica da via de sinalização Wnt, que é conhecido por causar a estabilização β-catenina e a translocação para o núcleo, e tem sido implicada numa variedade de cancros humanos (para revisões ver [ ,,,0],54] – [57]). USP9X também pode actuar como um regulador da via de TGF-β, um outro circuito de sinalização de grande relevância para o cancro (revisto em [58]), como demonstrado pelo facto de que a perda de USP9X suprime respostas múltiplas do gene de TGF-β [59]. Mecanisticamente, isso pode depender da capacidade de USP9X para activar SMAD4 pela remoção da monoubiquitination, que por sua vez impede a formação do efector Smad2 /SMAD4 complexo [59]. Finalmente, USP11 está envolvido na regulação da via de sinalização de NF-kB [60], [61].

Há evidências de que USP9X USP10 e pode estar envolvido em percursos de sobrevivência celular. deubiquitinates USP9X e estabiliza MCL-1, um membro da família de sobrevivência pro-BCL2 [33], cuja sobre-expressão está associada a várias condições neoplásicas [62] – [64]. USP10, por outro lado, tem sido mostrado para ser responsável pela desubiquitinação de p53 no citoplasma, permitindo a sua estabilização e re-entrada no núcleo. Com efeito, a regulação negativa de USP10 diminui a estabilidade de p53 e aumenta a proliferação de células de cancro [65], que se projecta, assim, um papel como supressor de tumor. É interessante notar, no entanto, USP10 pode também agir como um oncogene, através da promoção da proliferação de células de cancro em células que albergam mutante p53 [65], um evento possivelmente relacionados com o facto de que alguns mutantes de p53 exibir actividade aberrante de ganho-de-função, que é estabilizada por meio de desubiquitinação por USP10.

Há também evidências de um envolvimento de USP22 e USP1 em uma série de eventos nucleares, incluindo a organização da cromatina e telômeros, e reparo do DNA, a subversão do que poderá conduzir a transformação celular. USP22 é necessário para a progressão apropriado através do ciclo celular, e é um componente do complexo Saga humano, um complexo transcricional de co-activador. Dentro de saga, USP22 catalisa a desubiquitinação de histonas 2A e 2B, desse modo, contrariar heterocromatina silenciamento [66]. Além disso, deubiquitinates TRF1, um componente do complexo de nucleoproteína do telómero que funciona como um inibidor de telomerase, [67], o que afecta a estabilidade TRF1 e alongamento dos telómeros [68]. Finalmente, deubiquitinates USP1 inactiva e dois componentes de mecanismos de reparação do ADN: FANCD2 (um componente da via da Anemia de Fanconi) [4], [69] e PCNA [70]. Ubiquitination de FANCD2 e PCNA é importante para seus papéis na reparação do ADN [71], [72], sugerindo que a subversão do USP1 em cancros humanos pode colidir com eventos de transformação através de alterações de vias de reparação de DNA.

Finalmente, o interactome de Dubs humanos tem sido relatado recentemente [73], que liga Dubs para diversos processos celulares, incluindo retorno da proteína, transcrição, processamento de RNA, DNA danos e degradação associada ao retículo endoplasmático. O interactome DUB fornece as fundações, no qual camadas adicionais de complexidade pode agora ser adicionados, tais como o atlas de alterações DUB no cancro aqui relatados, para construir um mapa de referência para o envolvimento pleiotropic de Dubs na homeostase celular.

Materiais e Métodos

Ética declaração

consentimento informado por escrito para o uso de amostras biológicas pesquisa foi obtido de todos os pacientes, e o projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional. Actuais membros da Comissão de Ética IEO: Luciano Martini (Presidente), Director do Instituto de Endocrinologia, Milan; Apolone Giovanni (Vice-Presidente), Chefe do Translational e Outcome Research Laboratory e “Mario Negri” Institute, Milan; Bonardi Maria Santina, Chefe do Serviço de Enfermagem – Instituto Europeu de Oncologia, Milão; Cascinelli Natale, Diretora Científica – Instituto Nacional do Câncer, Milan; Gallus Giuseppe, Diretor – Instituto de Estatística Médica – Milan; Gastaldi Stefano, Psicólogo e Psicoterapeuta, Diretor Científico da Attivecomeprima; Goldhirsch Aron, Diretor do Departamento de Medicina – Instituto Europeu de Oncologia, Milão; La Pietra Leonardo, Chief Medical Officer – Instituto Europeu de Oncologia, Milão; Loi Umberto, Exportação em procedimentos legais, Monza; Martini Luciano (Presidente), Diretor – Instituto de Endocrinologia, Milan; Merzagora Francesca, Presidente do Fórum Italiano da Europa Donna, Milan; Omodeo Venda ‘Emanuela, Director de Serviço Farmacêutico, Instituto Europeu de Oncologia, Milão; Pellegrini Maurizio, chefe do Distrito de Saúde local, Milan; Rotmensz Nicole, Chefe da Unidade de Controlo de Qualidade, Instituto Europeu de Oncologia, Milão; Tomamichel Michele, Diretor, Sottoceneri Sector Cantonal Sociopsychiatric Organização, Lugano; Dom Vella Charles, bioeticista e teólogo, S. Raffaele Hospital e Instituto Científico, Milan; Veronesi Umberto, Diretor Científico do Instituto Europeu de Oncologia, Milão

OBSERVADORES:. Ciani Carlo, Diretor-Presidente, Instituto Europeu de Oncologia, Milão; Della Porta Giuseppe, Research Coordenador, Instituto Europeu de Oncologia, Milão; Michelini Stefano, Managing Director, Instituto Europeu de Oncologia, Milão

Secretariat ESCRITÓRIO:. Nonis Atanasio (cabeça), controlada Gabinete de Estudos Clínicos do Instituto Europeu de Oncologia, Milão; Tamagni Daniela (Assistente), controlada Gabinete de Estudos Clínicos do Instituto Europeu de Oncologia, em Milão.

Identificação e seleção de dubs, modelos de cDNA e preparação sonda

Foi utilizado o Pfam (Pfam 22,0, Julho 2007) [74], o InterPro (InterPro 16,0, Agosto de 2007, https://www.ebi.ac.uk/interpro/), e as bases de dados SMART para recuperar todas as proteínas que contêm um dos cinco domínios de Ub-protease. Depois de retirar sequências sobrepostas, foram identificados 55 PSU, 4 UCHs, 5 MJDs, 13 OTUs e 12 JAMMs, que representava os 89 genes selecionados em TMA (Tabela S2).

clones EST foram obtidas em nosso in- casa Unigene coleção clone, ou a partir de IMAGENES (https://www.imagenes.de/). Todos os clones foram sequência é verificada. pesquisas BLAST foram realizadas para identificar as regiões mais específicas -300 pb, partilhados pelo maior número de variantes de transcritos para cada gene individual e riboprobes foram sintetizados como descrito anteriormente [23].

As amostras de tecido

Para o estudo de triagem em larga escala, fixados em formalina e espécimes embebidos em parafina foram fornecidos pelo Departamentos de Patologia Ospedale Maggiore (Novara), Presidio Ospedaliero (Vimercate) e Ospedale Sacco (Milan). As amostras foram dispostas em diferentes TMA (Tabela S1), preparado essencialmente como descrito anteriormente [23], [25], [75]. Cada amostra foi dispostas em duplicado (também para a engenharia TMA para as análises prolongados, ver abaixo). Detalhes da engenharia TMA estão na Tabela S1

Para as análises períodos de Dubs representativas, foram utilizados três grupos diferentes:.

O cancro do pulmão de coorte. Nós projetamos TMAs específico do pulmão composto por 420 CPNPC (244 adenocarcinomas e 176 carcinomas de células escamosas), fornecidos pelo Instituto Europeu de Oncologia (Milan). As características clínicas e patológicas são apresentados na Tabela S4.

Melanoma coorte. Nós projetamos um TMA melanoma de progressão composto por 32 lesões benignas (nevos), 138 melanomas primários, e 62 melanomas metastáticos fornecidos pelo Departamentos de Patologia Ospedale S. Paolo (Milan) e pelo Instituto Europeu de Oncologia (Milan). As características clínicas e patológicas estão na Tabela S5.

coorte câncer gástrico.