Abstract

Câncer Sem dúvida ovário é uma doença irritante, incurável para pacientes com câncer recorrente e opções terapêuticas são limitadas. Embora o gene grupo Polycomb,

Bmi-1

que regula a auto-renovação das células-tronco e progenitoras normais tem sido implicado na patogênese de muitas doenças malignas humanas, mas um papel para Bmi-1 em influenciar a resposta a quimioterapia tem não foi abordada antes. Aqui demonstramos que o silenciamento Bmi-1 reduz os níveis de GSH intracelular e, assim, sensibiliza as células de cancro do ovário quimiorresistentes de quimioterápicos como a cisplatina. Exacerbando a produção de ROS em resposta a cisplatina, Bmi-1 silenciamento ativa a via DNA danos resposta, caspases e cliva PARP resultando na apoptose de indução em células de cancro do ovário. Em um

in vivo

modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário resistente à quimioterapia, knockdown de Bmi-1 por entrega nanoliposomal inibe significativamente o crescimento do tumor. Enquanto a cisplatina monoterapia era inactivo, combinação de Bmi-1 silenciamento juntamente com cisplatina revogada quase completamente o crescimento do tumor do ovário. Colectivamente estes resultados estabelecer Bmi-1 como um importante novo alvo para terapia no cancro do ovário resistente à quimioterapia

Citation:. Wang E, Bhattacharyya S, Szabolcs A, Rodriguez-Aguayo C, Jennings NB, Lopez-Berestein G, et ai. (2011) Melhorar a resposta à quimioterapia com Bmi-1 silenciamento no cancro do ovário. PLoS ONE 6 (3): e17918. doi: 10.1371 /journal.pone.0017918

editor: Sujit Basu, Universidade do Estado de Ohio, Estados Unidos da América

Recebido: 21 Janeiro, 2011; Aceito: 15 de fevereiro de 2011; Publicação: 21 de março de 2011

Direitos de autor: © 2011 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão Marsha Rivkin Pilot (RB), CA136494, CA135011 (PM) e CA083639 P50, U54 CA151668 (AS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário tem a maior taxa de mortalidade entre todas as malignidades ginecológicas [1]. Apesar de resposta inicial a debulking cirúrgico e da linha de frente de platina /taxano quimioterapia, a maioria dos tumores, eventualmente, desenvolver uma recaída resistente aos medicamentos [2], [3]. As evidências sugerem que a resistência da cisplatina pode ser o resultado de um programa de apoptose defeituosa. Neste caso, o aumento dos níveis de danos de ADN seria necessária para induzir a apoptose de sinal de início [4], [5].

Bmi-1 |, um gene grupo Polycomb, regula a proliferativa actividade de células estaminais e progenitoras normais [6]. É também indispensável para a auto-renovação das neural [7], [8] e células estaminais hematopoiéticas [9]. Bmi-1 é frequentemente regulada em uma variedade de cancros, incluindo o cancro do ovário e sua correlação com clínica grau /estágio, metástases em linfonodos e pior prognóstico foi relatada [10], [11], [12], [13], [14 ], [15], [16], [17], [18], [19].

Bmi-1 | provoca transformação neoplásica de linfócitos e coopera com H-Ras dando origem a cancro da mama metastático em camundongos [20], [21], [22], todos sugerindo fortemente um papel oncogênico em epitelial malignidades. Além disso, as células estaminais do cancro do ovário isolados exibem muito maior IMC-1 em comparação com os níveis de células tumorais grandes quantidades diferenciadas ou parentais e aumentaram a resistência à cisplatina e paclitaxel, quando comparado com as células tumorais [23]. Além disso, o aumento da expressão de Bmi-1 era um dos factores principais que determinam reguladoras um fenótipo celular capturado pela expressão de uma assinatura a partir de morte-cancro num amplo espectro de doenças malignas clinicamente resistente à terapia letais [24]. Apesar desta riqueza de informação que um possível papel para Bmi-1 em influenciar a resposta a quimioterapia não tem sido abordado antes. Neste contexto, a determinação do mecanismo através do qual Bmi-1 silenciamento sensibiliza as células cancerosas à cisplatina seria importante para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para combater cancro do ovário.

Os agentes de quimioterapia mais activas no cancro do ovário são a platina análogos, cisplatina e carboplatina. A atividade antitumoral da cisplatina (cis-diaminodicloroplatina (II) foi descoberto por Rosenberg e colegas em 1961 [25]. A cisplatina tem sido a droga mais ativo para o tratamento de câncer de ovário para as últimas 4 décadas e o prognóstico para as mulheres com câncer de ovário pode ser definida pela resposta do tumor à cisplatina [26]. Embora a maioria dos pacientes com cancro do ovário responder aos de linha de frente combinação de platina quimioterapia a maioria irá desenvolver a doença que se torna resistente à cisplatina e acabará por sucumbir à doença [26]. Assim, os métodos de prevenir ou superar a resistência à cisplatina poderia ter um impacto importante na luta contra esta doença.

Aqui demonstramos que

Bmi-1 | desempenha um papel importante na sensibilização de câncer de ovário resistente à quimioterapia células à cisplatina. Mostramos também que esta sensibilização é através de uma nova via modulada por Bmi-1, ou seja, espécies reativas de oxigênio (ROS) indução causando engajamento do DNA danos resposta (DDR) caminho que leva à apoptose. Também estabelecemos Bmi-1 como um alvo terapêutico válido

in vivo

usando uma abordagem facilmente traduzíveis da entrega nanoliposomal de siRNA em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário.

Resultados

Knockdown de Bmi-1 aumenta a sensibilidade a cisplatina in vitro

Temos demonstrado anteriormente que a redução dos níveis de Bmi-1 proteína em células de cancro do ovário usando microRNA 15a /16 diminui o crescimento clonal e proliferação [27]. Aqui, nós quisemos testar se knockdown de Bmi-1 afetados cisplatina apoptose mediada em células de cancro do ovário. knockdown eficiente de Bmi-1 em A-2780 e CP-70 células foi confirmada por comparação com as células de controlo transfectadas mexidos após 48 h (Fig. 1). As células transfectadas siRNA foram tratados com cisplatina durante 48 h e a apoptose determinados pelo método de anexina /FITC. A apoptose nas células quimiossensíveis A-2780 ARNsi de controlo transfectadas foi ~ 35 e 55% quando tratado com 5 ou 10 uM, respectivamente cisplatina isoladamente. Em contraste, a apoptose no resistente à quimioterapia, CP-70 foi ~17 e 40% quando tratado com 10 ou 20 uM de cisplatina sozinha, respectivamente, indicando a resistência destas células no sentido de cisplatina induziu a apoptose (Fig. 1). É importante o tratamento de IMC-1 células silenciados com cisplatina consistentemente aumentada apoptose em ambas as linhas de células por ~15-20% (Fig. 1). Para ambas as linhas celulares, o nível basal de apoptose determinada sem qualquer tratamento foi de ~ 10%. Apoptose experiências com três linhas celulares adicionais, tais como OVCAR-5, OV-202 e OV-167 produziu resultados semelhantes (dados não mostrados). Estes dados confirmaram que o knockdown de Bmi-1 pode sensibilizar células de cancro do ovário a cisplatina a morte celular induzida.

O painel superior demonstra knockdown eficiente de Bmi-1 por ARNsi nas linhas celulares do cancro do ovário (SC = mexidos siARN controlo ), tal como determinado por Western blot. O painel inferior demonstra a apoptose por cento, como determinado por anexina /PI coloração com FITC. células cancerosas do ovário transfectadas com controlo mexidos ou Bmi-1 siRNA foram tratados com ou sem cisplatina durante 48 h. NAC pré-tratamento foi realizado durante 1 h antes da adição de cisplatina quando apropriado.

Recentemente, foi relatado que os neurónios, timócitos e células de medula óssea isoladas a partir de Bmi-1 ratinhos nulos têm níveis aumentados de ROS do que os seus homólogos do tipo selvagem [28], [29]. Além disso, estudos têm relatado o envolvimento de geração de ROS em mediada pela cisplatina apoptose [30], [31]. Assim, para determinar como o silenciamento de Bmi-1 sensibiliza as células de cancro do ovário resistentes aos medicamentos à cisplatina induziu apoptose, foi investigado o possível envolvimento de ROS. Portanto, Bmi-1 ou mexidos-ARNsi de controlo transfectadas células de cancro do ovário foram pré-tratados com N-acetilcisteína (NAC) a 1 mg /ml durante 1 h, seguida por tratamento com cisplatina durante 48 h. inibição significativa de apoptose mediada por cisplatina em ambos Bmi-1, células de controlo de knockdown e foi observada na presença de ROS eliminador de NAC (Fig. 1). Estes dados indicam que a apoptose aumentada observada na cisplatina trataram células Bmi-1 silenciados foi devido ao envolvimento de ROS e levou-nos a determinar a produção de ROS como um próximo passo lógico.

Knockdown de Bmi-1 aumenta a cisplatina mediada por ROS produção

a seguir, determinou a produção de ROS no controle mexidos ou Bmi-1 siRNA transfectadas células tratadas com ou sem cisplatina através da medição de fluorescência usando DCFDA. tratamento com cisplatina isoladamente, aumentou significativamente a produção de ROS em 10 uM in-a 2780 células e em 10 e 20 uM em células CP-70. Em ambas as linhas celulares, knockdown de Bmi-1 seguida por qualquer tratamento com cisplatina aumentou significativamente a produção de ROS (Fig. 2). Esses dados corroboram nossas observações anteriores sobre a apoptose e postula ROS como a principal razão para uma maior sensibilização das células de cancro do ovário a cisplatina. A fim de determinar uma causa para o ROS apoptose mediada exacerbado observado nós próxima determinou os níveis totais de glutationa celular (GSH).

células do cancro do ovário transfectadas com controle mexidos ou Bmi-1 siRNA foram tratados com ou sem cisplatina para 24 h. Subsequentemente, as células foram incubadas com 5 ^ M carboxi-H2DCFDA em HBSS fresco durante 30 min a 37 ° C. As células foram colhidas com tripsina e de fluorescência das células marcadas foi medida a um comprimento de onda de excitação de 485 nm e comprimento de onda de emissão de 530 nm utilizando um Fluorolog 3 (Jobin Yvon-Horiba). Proporção de intensidade média de fluorescência (MFI) no que diz respeito à não tratada mexidos controle é representado.

Bmi-1 regula GSH produção

Redução GSH é um componente crítico da rede antioxidante da célula , estando directamente envolvido no varrimento ROS e na manutenção de proteínas tiol na sua reduzida estado, [33], [34] [32]. Assim, para determinar uma causa para o aumento da apoptose mediada por ROS observada em Bmi-1 células silenciadas, o próximo determinada totais níveis de GSH intracelular. Os lisados ​​foram preparados a partir de controle mexidos ou Bmi-1 siRNA células transfectadas tratadas com ou sem cisplatina. Knockdown de Bmi-1 diminuiu sozinho significativamente os níveis de GSH celular (~ 30% na A-2780 e ~ 40% na CP-70) e este foi ainda mais reduzida quando combinado com o tratamento com cisplatina (-45% na A-2780 e ~56% em CP-70) (Fig. 3). o tratamento com cisplatina sozinha no entanto não teve efeito sobre os níveis de GSH. Estes dados sugerem que pelo menos alguns dos efeitos mediados estresse oxidativo observado nas células de cancro do ovário knockdown Bmi-1 é devida a uma diminuição dos níveis de GSH intracelular.

O painel superior representa GSH celular total medido (materiais e métodos) em células de cancro do ovário transfectadas com controlo mexidos ou Bmi-1 siRNA tratados com ou sem cisplatina durante 24 h. O painel inferior representa dobrar mudança na expressão do gene (normalizado com beta actina e comparado com o controlo scrambled) tal como determinado por RT-PCR quantitativa de células de cancro do ovário transfectadas com controlo mexidos ou Bmi-1 siRNA durante 48 h.

Para investigar mais a causa do conteúdo de GSH reduzida em Bmi-1 células silenciadas nós próxima determinado se os níveis das enzimas chave envolvidas na via de biossíntese de GSH expressão foram alterados. Foi realizada RT-PCR quantitativa para determinar o nível de expressão do gene de ligase de glutamato-cisteína (GCLM) e sintase de glutationa (GSS), nas transfectadas linhas celulares de cancro do ovário Bmi-1 siRNA. Glutamato-cisteína ligase (GCLM) é a primeira enzima limitante da velocidade da via de biossíntese da glutationa [35]. No segundo passo, a glutationa-sintetase (GSS), converte gama-L-glutamil-L-cisteína para a glutationa [35]. Enquanto a expressão de ARNm de Bmi-1 foi reduzida como esperado em Bmi-1 células silenciados, curiosamente expressão de ARNm de GCLM diminuiu significativamente enquanto que a dos GSS aumentou (Fig. 3). A tendência foi semelhante em ambas as linhas de células de câncer de ovário. Estes resultados sugerem que a perturbação de GCLM, a enzima que limita a taxa é suficiente para reduzir os níveis totais de GSH celular e subsequente aumento de vezes nos níveis de ARNm GSS provavelmente representam um mecanismo de defesa para as células que tentam aliviar o stress oxidativo.

Bmi -1 modula a via de DDR

para investigar ainda mais o mecanismo de ROS mediada reforçada apoptose pela cisplatina em Bmi-1 células de cancro do ovário silenciados que queríamos testar o envolvimento dos danos e reparação do ADN (DDR) via. Estudos anteriores relataram que o stress oxidativo pode desencadear a activação da via DDR [36]. A fim de testar esta determinou-se os níveis de fosforilação de Chk2 e H2AX dois importantes biomarcadores para danos no DNA e activação da via de DDR [37]. o tratamento com cisplatina sozinha induziu a fosforilação de Chk2 e H2AX de um modo dependente da concentração e do knockdown de Bmi-1 exacerbou ainda mais este efeito (Fig. 4A). Corroborando, aumento da formação de focos nuclear foi observada por imunofluorescência 53 BP1 em células PC-70 Bmi-1 knockdown tratados com cisplatina (Fig. 4B). Estes resultados indicam que os níveis sustentados de ROS gerado mediante Bmi-1 knockdown juntamente com o tratamento com cisplatina são suficientes para danificar directamente o ADN e envolver a via RDA. Um grande corpo de literatura suporta que a danos no ADN pode conduzir a apoptose através da activação de caspases [38], [39]. Por isso, na próxima passou a determinar a activação das caspases em células de cancro do ovário Bmi-1 silenciados tratados com ou sem cisplatina.

(A) células do cancro do ovário transfectadas com controle mexidos ou Bmi-1 siRNA foram tratados com ou sem cisplatina durante 48 h. Western blot foi realizada para fosfo Chk-2, o total de Chk-2, fosfo-H2AX, H2AX total e actina beta utilizando anticorpos respectivos. (B) Scrambled controlo ou Bmi-1 siRNA transfectadas CP-70 células foram submetidas a microscopia confocal utilizando anticorpo 53BP1 (vermelho) e DAPI (coloração nuclear azul) para demonstrar a formação de focos nuclear.

Bmi- 1 regula efetores de apoptose

mediadores estabelecidas de apoptose incluem caspases [40]. A seguir, determinou a clivagem de caspase 8 e caspase 9 no controle mexidos ou Bmi-1 siRNA células transfectadas tratadas com ou sem cisplatina. tratamento com cisplatina sozinha causou clivagem da caspase 8, mas não caspase 9. É plausível que com maiores concentrações de clivagem cisplatina da caspase 9 pôde ser observado. Importante, no entanto, a combinação de Bmi-1 knockdown e cisplatina tratamento de forma significativa e dependente da dose aumentou a clivagem de caspase 8 e caspase 9 em ambas as linhas celulares (Fig. 5).

células de cancro do ovário transfectadas com controlo mexidos ou Bmi -1 siRNA foram tratados com ou sem cisplatina durante 48 h. Western blot foi realizada para a caspase-8, caspase-9 e PARP usando anticorpos respectivos.

PARP é um dos principais alvos de clivagem de caspases activadas e PARP clivada facilita a desmontagem celular e serve como um marcador de As células que sofrem apoptose [40]. Em Bmi-1 células de knockdown, foi observada clivagem clara de PARP de um modo dependente da dose de cisplatina (Fig. 5). Todos estes

in vitro

dados indicam que o tratamento com cisplatina de Bmi-1 células knockdown intensifica a apoptose, aumentando a produção ROS, fazendo com que o envolvimento da via DDR e ativar caspases. A seguir, procedeu-se determinar a eficácia terapêutica de silenciar Bmi-1 em um modelo de camundongo ortotópico resistente à quimioterapia de câncer de ovário.

Knockdown de Bmi-1 aumenta a sensibilidade a cisplatina in vivo

Em seguida, o potencial terapêutico da Bmi-1 foi testada por

in vivo

entrega de Bmi-1 siRNA usando DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina) nanoliposomes no modelo de rato PC-20 ortotópico. Este método de entrega tem sido extensivamente caracterizada anteriormente para a duração de knockdown e tem sido demonstrado que possuem as respostas inflamatórias não específicas [41], [42]. Para simular o tratamento da doença de pequeno volume avançada, a terapia foi iniciada de 1 semana após a injecção das células de tumor. Os ratinhos foram divididos em quatro grupos (N = 10 ratos por grupo): (a) controlar siRNA-DOPC (150 ug /kg ip duas vezes por semana), (b) controlar siRNA-DOPC + cisplatina (160 ug /IP rato doses semanais), (c) Bmi-1-DOPC ARNsi (150 ng /kg ip duas vezes por semana), e (d) Bmi-1-siRNA DOPC + cisplatina (o mesmo que tratamentos individuais). Todos os animais foram sacrificados após 4 semanas de terapia. knockdown eficiente de Bmi-1 (-85%) foi confirmada primeiro por RT-PCR (Fig. 6A). O tratamento com o Bmi-1 siRNA sozinho resultou numa redução significativa (-60%) em peso do tumor em comparação com o grupo de controlo de siRNA. A terapia de combinação com IMC-1 siRNA e cisplatina resultou numa redução ainda maior (~ 80%) em peso do tumor em comparação com a cisplatina grupo só tratados (Fig. 6B). Para avaliar ainda mais este efeito, o número de nódulos de tumores formados em cada grupo foi determinado. Novamente terapia combinada mostrou maior efeito com ~ 70% menos nódulos tumorais em comparação com a cisplatina grupo só tratados (Fig. 6B). Nenhuma toxicidade óbvia foi observado nos animais durante as experiências de terapia como avaliado por mudanças no comportamento, hábitos alimentares e mobilidade. O peso corporal médio foi também semelhante entre os grupos de tratamento (dados não mostrados).

Para avaliar os efeitos da terapia de ARNsi no crescimento do tumor, o tratamento foi iniciado uma semana depois da administração i.p. injecção (1,0 × 10

6 CP20) de células tumorais. Os ratinhos foram divididos em quatro grupos (N = 10 murganhos por grupo): (a) controlar siRNA-DOPC (150 ug /kg ip duas vezes por semana), (b) controlar siRNA-DOPC + cisplatina (160 ug /ratinho ip semanais), (doses mesmos como tratamentos individuais) (c) Bmi-1-DOPC ARNsi (150 ng /kg ip duas vezes por semana), e (d) Bmi-1-siRNA DOPC + cisplatina. O tratamento foi continuado durante 4 semanas após a inoculação do tumor antes do sacrifício. (A) ARN total foi isolado a partir de uma porção dos tecidos tumorais e submetido a RT-PCR utilizando iniciadores para o IMC-1 e beta-actina. O método C

t comparativa foi utilizada para calcular a abundância relativa do ARNm comparada com a de expressão da beta-actina. O experimento foi realizado em triplicado e significância determinada pelo teste t de Student de duas faces, P 0,05 foi considerado significativo. (B) Mouse e pesos do tumor e (C) o número de nódulos tumorais para cada grupo foram comparadas pelo teste t de Student (para comparações de dois grupos). A P ≤ 0,05 bicaudal foi considerado estatisticamente significativo.

efeito do IMC-1 knockdown na proliferação e apoptose in vivo

Para corroborar nosso

in vitro

dados que próxima examinou o efeito do IMC-1 knockdown no

in vivo

proliferação de células tumorais e apoptose usando Ki67 e TUNEL coloração. A terapia de combinação com IMC-1 siRNA e cisplatina apresentaram o maior efeito com diminuição ~ 50% na proliferação em comparação com o grupo não tratado de controlo (Fig. 7). Do mesmo modo, um aumento de aproximadamente 80% na apoptose foi observada no grupo de terapia de combinação em comparação com o grupo de controlo tratado (Fig. 7). Portanto demonstramos que o silenciamento de Bmi-1 em células de câncer de ovário se

in vitro

ou

in vivo

aumenta a apoptose em resposta a cisplatina.

(A) coloração imuno-histoquímica para Ki67 e (B) de TUNEL foi realizado para avaliar a proliferação celular e a apoptose. 200X ampliação original. A quantificação é mostrado graficamente na direita. braços de tratamento foram comparadas pelo teste t de Student e P ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Discussão

Câncer Sem dúvida ovário é uma doença irritante, incurável para pacientes com câncer recorrente e opções terapêuticas estão limitados [1], [43]. Aqui demonstramos Bmi-1 silenciamento do gene como uma opção eficaz, que em combinação com a cisplatina aumenta a eficácia terapêutica ainda mais. Além disso, nós delinear o mecanismo de aumento da sensibilidade ao ser principalmente através da produção de ROS. quimioterapia de primeira linha para o cancro do ovário envolve o uso do regime de platina /taxano, que são conhecidos para induzir a produção de ROS. Postulamos que knockdown de Bmi-1 vai provar eficaz em terapia de combinação com este regime. Neste contexto, um relatório recente demonstrou Bmi-1 a ser recrutados mais cedo para o site dupla vertente pausa após os danos da radiação [44] ionizante. Nossos resultados corroboram e estender esta ideia e demonstram

in vitro

e

in vivo

que Bmi-1 silenciamento synergizes com o estresse oxidativo aumentado levando ao acúmulo de danos ao DNA e apoptose.

Pelo menos duas publicações anteriores demonstraram aumento dos níveis de ROS em neurônios, timócitos e células de medula óssea isoladas de Bmi-1 ratos nulos [28], [29]. No entanto, a causa para esta produção de ROS foi varyingly atribuída a p53 repressão dependente e independente da expressão do gene anti-oxidante ou energética com deficiência mitocondrial [28], [29]. Mostramos aqui que, para além destas vias Bmi-1 também controla os níveis de GSH celular por regulação da transcrição das enzimas envolvidas na via de biossíntese de GSH. Notavelmente transcrição de GCLM é regulado positivamente por factores de transcrição, tais como Nrf-1 e NFkB. No contexto de Bmi-1 knockdown, ambos estes factores de transcrição são regulados negativamente em neurónios e células de glioma, respectivamente [28], [45]. Por isso, é possível que o IMC-1 silenciamento conduz a regulação negativa da Nrf-1 e NFkB ou em células de cancro do ovário, diminuindo desse modo a transcrição de GCLM resultando na síntese de GSH reduzidos. É importante notar aqui que mostram que o IMC-1, por regulação dos níveis de ROS e GSH protege as células de cancro do ovário a partir de insultos quimioterapêuticos.

A via de resposta a danos no ADN pode ser activada por stress genotóxico, tais como as causadas por agentes quimioterapêuticos e lesões oxidativas do ADN . Com efeito de activação de RDA pode levar a uma pausa no ciclo celular progressão, a senescência ou apoptose. De acordo descobrimos que o duplo insulto do dano oxidativo causado por Bmi-1 knockdown e tratamento com cisplatina, que é conhecido por causar rupturas dos filamentos duplos no ADN junto com ROS dicas de produção, o limiar para as células de cancro do ovário em direção a apoptose através da indução de fosforilação de i ) Chk2 e H2AX, ii), causando a formação de focos nuclear por 53BP1 e clivagem de marcadores apoptóticos como iii) caspases e PARP.

como temos demonstrado em nossos

in vivo

experimentos, knockdown de Bmi-1 poderia ser útil na prática clínica devido às seguintes razões; a) regulação negativa de Bmi-1 aumenta a apoptose induzida por cisplatina em células de cancro do ovário. b) BMI-1 é necessária para a auto-renovação e manutenção de células estaminais, incluindo células estaminais do cancro do ovário que, por definição, são resistentes a agentes quimioterapêuticos [23]. c) Bmi-1 regula vias múltiplas, mais importante das quais é a indução da telomerase levando à imortalização de células epiteliais mamárias [46]. d) regulação negativa do Bmi-1 leva a de-repressão da INK4a, que codifica supressores de tumor p16Ink e p19Arf que regulam a senescência e a apoptose [47]. A activação destes percursos foram invocada como uma importante barreira supressor de tumor, porque estas vias actuar como inibidores potentes da proliferação ou a propagação de células danificadas. e) Além disso postulamos que a cisplatina e Bmi-1 agir sobre caminhos semelhantes que afetam a função mitocondrial e /ou através de um maior dano ao DNA ROS geração causa que levam à indução eficiente de apoptose. Aumento dos níveis de danos no DNA, em seguida, aumentar o sinal de iniciar a apoptose. Assim, Bmi-1 é um novo e importante alvo para a terapia não só no câncer de ovário resistente à quimioterapia, mas também para outras doenças malignas caracterizadas por sobre-expressão de Bmi-1.

Materiais e Métodos

Reagentes

Bmi-1 anticorpo era de Zymed, CA, EUA. siRNA Bmi-1 e mexidos de controlo foram da Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Fosfo-H2AX, fosfo-Chk-2, 53 BP1 anticorpos caspase-8, caspase-9 e PARP clivada eram da Cell Signaling Technologies Inc., MA. Anexina /kit apoptose FITC-PI era de Biovision Inc.

Cultura de Células

A-2780 e CP-70 células foram cultivadas em RPMI com 10% de FBS e 1% de antibiótico (Penicilina /Estreptomicina ) de acordo com a recomendação do provedor. As linhas de células CP-20 foram cultivadas de acordo com nossos procedimentos publicados anteriormente [48].

transfecção SiRNA

O células do ovário A2780 ou CP-70 foram cultivadas em seu respectivo meio de um dia antes a transfecção. Usando oligofectamine as células foram transfectadas com 25 nM ou o controlo scrambled Bmi-1 siRNA. Após 48 horas, as células foram processadas para blot ou apoptose ensaios Ocidentais [49].

Western Blot

colhidas células do cancro do ovário, ambos tratados e não tratados, foram lavadas em PBS e lisadas em (RIPA) de tampão arrefecido com gelo radioimunoprecipitação com cocktail recém-acrescentado 0,01% de inibidor de protease (Sigma) e incubou-se em gelo durante 30 min. Os detritos celulares foram eliminados por centrifugação a 13000 rpm durante 10 min a 4 ° C e o sobrenadante (30-50 ug de proteína) foi executado em uma SDS-PAGE [49].

ensaio ROS

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