Sumário

A expressão constitutiva do alto risco HPV E6 e E7 oncogenes virais é a principal causa de câncer cervical. Para explorar de forma abrangente a composição do HPV16 primeiras transcrições e sua anotação genômica, tecidos epiteliais escamosas cervicais de 40 pacientes infectados com HPV16 foram coletadas para análise de transcritos papilomavírus oncogene (APOT). Observamos padrões de transcrição diferentes de oncogenes HPV16 na progressão de lesões cervicais de câncer cervical e identificou uma nova transcrição. eventos de múltiplas integração nos tecidos de carcinoma cervical (CxCa) são significativamente mais frequentemente do que os de baixo grau lesões intra-epiteliais (LSIL) e lesões intra-epiteliais de alto grau (HSIL). Além disso, a maioria dos genes celulares dentro ou próximo a estes locais de integração são genes associados ao câncer. Tomados em conjunto, este estudo sugere que os múltiplos-integrações do genoma do HPV durante a infecção viral persistente, que, assim, altera os padrões de oncogenes virais e genes celulares relacionados com a integração de expressão, desempenham um papel crucial na progressão de lesões cervicais de câncer de colo do útero.

Citation: Lu X, Lin Q, Lin M, Duan P, Ye L, Chen J, et al. (2014): múltipla Integrações de HPV16 Genoma e Transcrição alterado de Viral oncogenes e genes celulares estão associados com o desenvolvimento do câncer cervical. PLoS ONE 9 (7): e97588. doi: 10.1371 /journal.pone.0097588

editor: Xuefeng Liu, da Universidade de Georgetown, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de outubro de 2013; Aceito: 21 de abril de 2014; Publicação: 03 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (81001343, 81172463), o Departamento de Educação da Província de Zhejiang (Y200907403) e Wenzhou Secretaria de Ciência e Tecnologia (Y20090103, Y20100175 e H20100063). Esses patrocinadores forneceram o financiamento para as experiências ea recolha de amostras. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em mulheres em todo o mundo. A infecção persistente pelo vírus do papiloma de alto risco humanos (HR-HPV), tais como o genótipo 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, e 59 são essenciais para a progressão de lesões cervicais [1], e mais de 50% dos casos são causados ​​por HPV16 [2]. oncoproteínas virais, E6 e E7, da HR-HPV contribuir para a carcinogênese cervical por inactivação duas principais proteínas supressoras de tumor celular, p53 e pRb, respectivamente [3] – [6]. Estes oncoproteínas virais em células infectadas, também pode resultar em instabilidade dos cromossomas e acumulação de eventos de mutação [7].

Um promotor precoce viral mentido a montante da ORF de E6, tais como P97 de HPV16 em [8], [9] , P99 em HPV31 [10], [11] e P105 em HPV18 [12], [13], é responsável por quase toda a expressão do gene precoce, incluindo E6 e E7. cis-elementos a montante do LCR interagem com factores de transcrição celular e o transactivador virai /repressor E2 e regulam a transcrição de genes de HPV E6 e E7 [8], [14]. Além disso, a metilação do DNA [15], splicing alternativo do RNA [9], [16], [17] e poli início de sinal (A) local de poliadenilação [18], [19] também participar na regulação da expressão do gene E6 e E7 [19].

Até o momento, um mapa de transcrição completa de HPV16 oncogênico e HPV18 em células infectadas pelo HPV e tecidos jangada foram construídas [19], [20].

é bem conhecido que a integração dos genomas de HPV é um evento chave na carcinogénese cervical [21], [22]. Além integração genoma viral na activação de oncogenes celulares ou inactivação de genes supressores de tumor celular [23] – [25], a integração do genoma HPV no genoma do hospedeiro pode alterar os padrões de transcrição de ambos os genes virais e hospedeiras [26]. Tem sido relatado que a integração dos genomas de HPV pode romper o gene E2 virai em células e libertar a sua inibição sobre o promotor precoce viral que controla a expressão de E6 e E7 [27]. Além disso, os transcritos de E6 e E7 cotranscribed com sequências celulares podem ser mais estáveis, e, assim, aumentar o seu nível de expressão de [28] – [30].

padrões de transcrição de HPV16 nos tecidos de cancro cervical tem sido relatada [ ,,,0],26], [31]. Havia um episs�ica HPV gene precoce transcrição (E7-E1

∧E4) e várias transcrições de HPV integrados (tais como E7-E1

∧cellular RNA, E7-E1

∧E4-celular RNA, etc. ) em tecidos infectados com HPV16. No entanto, a selecção de transcrição em resposta a alterações ambientais é um processo dinâmico para conseguir a expressão do gene óptima para a sobrevivência celular e carcinogénese [32]. Neste estudo, foi aplicada uma técnica modificada de amplificação de transcritos oncogene papilomavírus (APOT) [26] para explorar exaustivamente a estrutura e sequências de HPV16 E7 transcrições relacionadas e sua anotação genômica em 8 LSIL (lesões intra-epiteliais escamosas de baixo grau), 24 amostras de biópsia do colo do útero HPV16 positiva HSIL (lesão intraepitelial de alto grau) e 8 CxCa.

Materiais e Métodos

pacientes e amostras

As amostras de tecido de colo uterino primária lesões contendo células epiteliais tumorais /displásicas foram coletados a partir da segunda Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Wenzhou (Zhejiang, China) a partir de dezembro de 2010 a abril de 2012. a presença de HR-HPV foi detectado pelo teste HCII, e ao rastreio do HPV16 em RH amostras -HPV-positivos foi feita por kit de detecção de genótipos de HPV (Kaipu, Guangzhou, China) [33]. Todos eles não receberam radioterapia ou quimioterapia antes da operação e cada paciente foi submetido a uma biópsia colposcopia dirigido. As amostras de biópsia coletados foram cortada. Uma porção foi apresentado para diagnóstico histopatológico padrão, enquanto que a outra porção foi armazenada em RNAlater (Ambion, Austin, Texas, EUA), a -80 ° C para análise subsequente. Na base do diagnóstico histopatológico, as amostras foram divididas em LSIL (CIN I, n = 8), HSIL (CIN II, n = 22; CIN III, n = 16) e carcinoma do colo do útero (CxCa, n = 17). Adicional de 8 tecidos cervicais com citologia normal e negatividade DNA HPV como controles foram obtidos de pacientes que foram submetidas a histerectomia devido a doenças ginecológicas benignas. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética Médica do Second Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Wenzhou. Todas as mulheres foram informadas e deram o seu consentimento por escrito para participar do estudo.

RNA e Isolamento de DNA a partir de amostras clínicas

O RNA total a partir de amostras de biópsia acima descrito foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Califórnia ., EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Para remover o ADN de contaminação residual, a preparação de RNA foi tratado com RNase-free DNase I (Takara, Dalian, China) de acordo com o protocolo do fabricante. ARN total purificado foi dissolvido em água isenta de RNase e armazenado a -80 ° C. A concentração e pureza do ARN total foram quantificados pelo espectrofotómetro de ultravioletas a 260 nm e 280 nm e de electroforese em gel de agarose a 1%. Apenas as amostras de ARN com uma razão A260 /A280 de 1,8-2,0 e de alta integridade foram utilizados para a experiência adicional.

transcrição reversa e amplificação por PCR de transcritos

ensaio APOT relataram anteriormente foi baseado em aninhada as reações de PCR [26], o que só poderia amplificar as transcrições abundantes e ignorar as transcrições com níveis mais baixos nas amostras. Assim APOT ensaio modificado foi utilizado para amplificar os transcritos de oncogenes de HPV. Os iniciadores para estas reacções foram concebidos de acordo com Klaes R, et al [26]. O ARN total (1 ug) foi transcrito inversamente utilizando um iniciador oligo (dT)

17-iniciador acoplado a uma sequência de ligação

RT

[34] de acordo com o protocolo do fabricante do kit de transcriptase inversa (TOYOBO, Japão) . Para verificar a qualidade da primeira cadeia de ADNc, a PCR usando desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) iniciadores espec�icos foram realizados como previamente descrito [35]. ADNc de primeira cadeia englobando sequências de oncogenes virais foram subsequentemente amplificados por PCR utilizando

p1

-HPV16E7 iniciador específico (5′-CGGACAGAGCCCATTACAAT-3 ‘) e ligante

P0

(5′-3-GACTCGAGTCGACATCG ‘) como o iniciador de sentido reverso; e a amplificação por PCR foi realizada num volume de reacção de 50 ul. Diferente de relatórios anteriores, os ciclos de PCR foi aumentado para 35, e todos os espécimes realizada apenas uma rodada reação de PCR. Para verificar a especificidade deste procedimento, o controlo “minus-RT”, em que a transcriptase reversa foi omitido das reacções foi também realizado em paralelo.

Análise da sequência de transcritos

Os produtos de amplificação foram APOT visualizados por electroforese em gel de agarose a 2,5%. Os produtos de PCR com interesse foram excisadas do gel e extraiu-se utilizando kit de recuperação de ADN em gel de agarose (TianGen, Pequim, China). Os amplimeres correspondentes foram clonados no vector de clonagem (transgen, Pequim, China) e análise da sequência de ADN foi executada usando um ABI 3730 XL Analisador Genético (Applied Biosystems, EUA) de acordo com protocolos padrão. Os resultados da sequenciação foram analisados ​​usando o programa BLASTn fornecido pelo National Center for Biotechnology Information, EUA. Além disso, os locais de integração cromossômicas foram apurados através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (BLAST) e Biologia Molecular Europeu Laboratory (EBI). Além disso, os sítios frágeis e genes de sites de integração foram definidos usando o visualizador de mapa do site frágil NCBI ea ferramenta UCSC Blat.

Resultados

Especificidade do ensaio APOT para HPV16 transcrições oncogene

o princípio do ensaio é APOT amplificação rápida a 3 ‘de extremidades de ADNc (RACE) ensaio de PCR que atinge a amplificação e a clonagem da região entre uma única sequência curta de uma molécula de ADNc e a sua extremidade 3’ desconhecido [34]. Em geral, as transcrições integradas derivadas de E6 e E7 oncogenes abranger sequências virais nas suas extremidades 5 ‘e sequências de genoma do hospedeiro nas suas extremidades 3’- [26]. O tamanho esperado dos produtos obtidos a partir de um transcrito derivado de epissoma é de 1050 pb [26] amplimeros que exibiam um tamanho diferente de 1050 pb, por conseguinte, pode ser derivado de um genoma de HPV integrado. Para comprovar a especificidade do ensaio APOT modificado, os ADNc a partir de células CaSki HPV16-positiva contém o genoma de HPV16 e HPV-negativos tecidos cervicais normais integrados, bem como os controlos “negativo-RT” em que transcriptase reversa foi omitido das reacções eram usava. Os produtos amplificados de ADNc a partir de células CaSki HPV16-positivos foram semelhantes para o relatório anterior [26], enquanto que nenhum produto de RT foi obtido a partir dos tecidos normais do colo do útero, sem ADN de HPV e o controlo “minus-RT” (Figura 1). Estes dados indicaram o ensaio APOT modificado pode detectar especificamente as transcrições derivadas a partir do genoma de HPV integrado.

produtos amplificados a partir de células CaSki (A), CxCa HPV16-positivas (B), HPV tecidos cervicais normais negativos (C) e os controlos de “minus-rt” do ARN isolado a partir de HPV-16 amostras positivas (D) pelo ensaio APOT foram separados em géis de agarose a 2,5%. A:

Pista 1-3

foram três células CaSki subcultura diferentes (como um controlo positivo); B:

Pista 1-3

foram três amostras CxCa diferentes; C:

Pista 1-3

foram três tecidos cervicais normais diferentes (como controles negativos); D:

Pista 1-3

foram correspondendo com amostras em B, respectivamente; M:. Escadas de ADN de 250 pb

Características de HPV16 transcrições de oncogenes nos tecidos de neoplasia intra-epitelial cervical e carcinoma do colo

Para analisar as transcrições oncogene HPV16, cervical 40 HPV16-positivos espécimes (LSIL, n = 8; HSIL, n = 24; CxCa, n = 8) com RNA de boa qualidade foram selecionados entre 63 amostras coletadas no presente estudo. Total de 133 transcrições contendo fragmentos virais foram encontrados. Entre essas transcrições, 64 fragmentos tinha sequências de HPV16 E7-E1 * nas suas extremidades 5 ‘e directamente relacionado com poli A em suas extremidades 3’- (Figura S1). Além disso, havia quatro perturbações diferentes da região E1 no nt 880, 949, 1054 e 1234 (Figura S2). Os transcritos que contenham um sinal de dador de splicing-E1 no nt 880 [36] pode pertencer a potencial epissomal padrão, enquanto que o transcrito truncado em nt949 pode ser um resultado de iniciação interna por oligo dT [37]. Outros transcrições que truncado no nt 1054 e nem sequências poli A continha 1234, nem qualquer sítio de poliadenilação pertencem a viral ou host, portanto, essas transcrições eram vistos como potenciais padrões integrados. Além disso, também encontramos uma outra transcrição que tem E7 ORF emendado no nt 880 ao site receptor de E4-tala no nt 3358 e depois emendado a partir do sinal de doadores E4-tala no nt 3632 ao site receptor L1-tala em 5639, e também terminado em poli a (Figura S1). Neste transcrição, o E4 ORF não é interrompido. A falta de um sinal de dador de splicing no nt 5815 nesta transcrição indica que o genoma HPV16 interrompido no nt 5815 pode também participar na integração vírus genoma.

Além disso, havia 64 transcritos virais ligados diretamente para hospedar genoma sequências e todos eles foram começou com o começo do iniciador directo (P1) no nt 729. Estes oncogenes integrado transcritos de HPV16 pode ser dividida três tipos diferentes (Figura 2). Entre essas transcrições, Tipo A tem HPV16 E7-E1

* sequências nas suas extremidades 5 ‘e conectado diretamente à sede sequências do genoma. No entanto, havia dois sítios diferentes de integração da região E1 (em nt880 e nt1107) neste tipo (Figura S3). O local em nt880 continha um sinal de dador de splicing-E1 embora o local truncada em nt1107 pode ser mais propensos a linearizar o genoma viral circular para a integração no genoma do hospedeiro. Tipo de Transcrição B tem um E2 ORF interrompido em nt2870 ea sequência Tipo B compõe de HPV16 E7-E1

∧E2

* nas suas extremidades 5 ‘e a sequência do genoma hospedeiro a seus 3’- extremidades. Em tipo de transcrição C, a E1

∧E4 códon de parada é interrompido para a integração de vírus e um E1 inteira

∧E4 ORF sem um códon de parada é fundida na estrutura para hospedar sequência. Entre estes três padrões, os transcritos de tipo A e C foi relatada por Wentzensen N, et al. [31]. No entanto, transcrição do Tipo B não tivessem sido previamente relatada em lesões pré-cancerosas e câncer cervical

Tipo A mostra sequências de E1 emendados diretamente a sequência lateral celular.; Tipo B mostra E1 emendados para E2, com E2 fundida com uma sequência celular; Tipo C mostra E1 emendado para E4, com E4 correndo em uma sequência de celular.

▴, existem dois locais de integração em E1 (dados apresentados na Figura S3). As caixas dentro de barras representam seis nucleotídeos entre E7 e E1gene.

Além disso, oncogenes HPV16 apresentaram padrões de transcrição significativamente diferentes nos tecidos de LSIL, HSIL e CxCa (Figura 3, 4 e Tabela 1). Entre estes 3 padrões de transcrição detectados nos nossos pacientes, do Tipo A e Tipo B foram maior prevalência de tipo C, que foi observada em quase todos os tipos patológicas, enquanto que o tipo C, foi detectada apenas nas amostras de CxCa, com uma frequência de detecção de 75% (Tabela 1 e Figura 4). Todas as amostras de doentes exibiram o tipo A, mas todas as amostras tinham CxCa o Tipo B e Tipo C (Figura 4). Consistente com a presunção de potencial de integração do genoma viral nas fases posteriores do desenvolvimento do câncer [38], [39], a prevalência de transcrições de fusão foram maiores no HSIL e CxCa de LSIL.

HPV16-positivos clínica amostras com LSIL, HSIL e CxCa foram submetidos ao ensaio de APOT e separado em géis de agarose a 2,5%,

pista 1-5

significa cinco amostras diferentes em cada tipo patológico. M:. Escadas de DNA de 250 pb

locais de integração e caracterização da sequência lateral celular

para identificar os locais cromossômicas individuais, todos os 64 Fusion-transcrições contendo sequências virais e celulares foram ainda analisadas por comparações BLASTN para toda a base de dados do genoma. Nossos dados mostram que todos os cromossomos, exceto para Chr21 e X, foram integrados com o genoma HPV16, confirmando os relatos anteriores de que nenhum local de integração HPV preferencial foi visto na selecção do cromossomo humano [40]. Alguns loci, como 1p36.22, 1p36, 2p24, 2q33, 5q31.1, 5q31, 6p24, 8p23, 10q22.1, 13q22.1, 19q13 e 19p13.3, foram relatados anteriormente [31], [41] – [45] (Tabela 2). Entre esses eventos de integração, quatorze de 40 amostras exibiram vários locais de integração (Tabela 2). Embora rearranjos de DNA locais poderia acontecer com frequência e rapidamente após a integração [43], verificou-se que as sequências flanqueantes celulares em 11 tecidos diferentes foram mapeados a cromossomas, indicando a presença de várias integrações independentes nestas amostras. Além disso, verificou-se que os eventos de integração de múltiplos foram significativamente mais elevados nos tecidos CxCa (75%) do que nos tecidos cervicais de LSIL (50%) e HSIL (53,8%). Triagem de todos os loci de integração indica que 35 dos 63 locais de integração mapeadas foram localizados em ou perto de um local frágil, com uma distância de 26 pb para 5 MBP (Tabela 2). Entre os 22 locais frágeis mapeadas, FRA13A foi encontrado em 4 amostras independentes. Vinte e duas transcrições não foram associados a qualquer site frágil.

As sequências laterais celulares de transcrições de fusão viral-celulares foram ainda examinadas para genes conhecidos. A maioria destes transcritos fundidos tinha uma sequência celular a partir da orientação de codificação de genes conhecidos e trinta transcritos tinha a sequência celular de uma região do intrão, e 8 transcritos foram fundidas com uma sequência de exão sentido dos genes preditos (Tabela 2). Entre estes genes previstos,

AMICA1

,

DAPK1

,

EBAG9

,

PIBF1

foram afetados duas vezes,

MRPS31

quatro vezes e

PRDX5

até seis vezes por a integração viral. Ao mesmo tempo, os genes hospedeiros mais próximas de cada local de integração na direcção da transcrição, também foram analisadas (Tabela 2). Entre estes genes preditos integrados ou fechados ao sítio de integração, foram identificados vários genes associados a tumores, incluindo

PRDX5

,

CD28

,

rock2

,

RHOH

,

TIMP3

e

DAPK1

, etc. Como mostrado na Tabela 1, as transcrições do tipo D e e só foram detectados em CxCa ea maioria de seus loci de integração foram localizados em ou perto de os sítios frágeis de FRA13C, FRA22B, FRA2I e FRA13A. Os genes associados com as transcrições do tipo D e E foram oncogenes (

CD28 Comprar e

EBAG9), genes supressores de tumor (

TIMP3

), ou genes relacionados ao tumor (

PIBF1

e

MRPS31

).

Discussão

Integração do genoma do HPV em cromossomas de acolhimento representa um evento clonal cedo para fornecer uma vantagem selectiva adicional para a expansão do neoplasma. transcritos virais foram detectados pelo ensaio APOT [26], [31], [42] – [45]. Embora ensaio APOT tem algumas vantagens em transcritos de detecção a partir de cada local de integração cromossômica, há várias limitações. Primeiro, é difícil para amplificar transcritos muito longas derivadas de integração, o que vai subestimam o número de tumores com ADN de HPV integrado [45]. Em segundo lugar, APOT é um tipo de PCR interna, o que pode tender para amplificar a transcrição com níveis mais elevados e ignorar aqueles com níveis mais baixos. Em terceiro lugar, tem sido relatado que o poli interno Uma escorva oligo poderia substituir o iniciador (dT) dentro de certos limites, e gerar um conjunto de oligo ancorado (dT) iniciadores para a síntese de cDNA. Estas sequências causadas por iniciação interna interrompido o gerador de ADNc de comprimento completo e confundido a análise de splicing alternativo [37]. Com o nosso ensaio APOT modificado para detectar o padrão de transcrição dos tecidos do colo do útero, conseguimos encontrar muitos transcritos virais relacionadas com sequências do genoma do hospedeiro poli A ou no colo do útero tecidos epiteliais escamosas infectadas pelo HPV16. Percebemos que havia um monte de transcritos virais diretamente terminou com poli A a seus 3′- extremidades. Exceto para o site relatado E1-emenda sinal de doador (nt 880), os locais de truncamento em nt1054, 1234 e 5815 não continha sequências internas poli A nem quaisquer sinais de poliadenila�o deve ser potencial novos locais integrados e necessidade de uma análise mais aprofundada. O transcrito de fusão viral-celulares do tipo A e C foi relatada anteriormente [26], [31], [41]. No Tipo C transcrição, o rompimento de integração E4 codão de terminação resultaria na E4 usar um codão de terminação de acolhimento. Neste estudo, observou-se também que algumas amostras de cancro cervical continha todos os três tipos de transcrições foram transcrições de fusão viral-celulares.

padrões HPV16 transcrição em LSIL, HSIL e CxCa foram significativamente diferentes. Verificou-se que a transcrição do tipo C foi apenas detectada nas amostras de CxCa e mais locais de integração aleatória existia nas nossas amostras de tecido. Semelhante à relatórios anteriores [31], [38] – [42], [46], [47], o nosso estudo indicam que a integração de HPV tem nenhum local preferencial no genoma humano. Exceto para o cromossomo 21 e X, outros cromossomos são todos suscetíveis a integração HPV16. Cerca de 55% integrações estão localizados em ou perto de um local frágil. Diferente de relatórios anteriores [42], [45], percebemos que eventos de integração muitas vezes ocorrem várias vezes significativamente mais no cancro do colo do útero do que em LSIL e HSIL. Estes dados não só fornecem suporte biológico para a observação epidemiológica que a infecção persistente pelos tipos específicos de HPV-RH é a causa importante de carcinoma cervical [1], mas também indicam que a seleção subsequente para e acumulação de mutações nos ainda a-ser- identificados genes reguladores celulares chave promove ainda mais a progressão para cancro cervical.

a integração, não só muda o padrão de transcrição relevantes para a expressão desregulada de oncogenes virais, mas também afecta a expressão do gene da hospedeira com a integração do genoma do vírus. A integração altera a expressão de genes do hospedeiro em locais de integração, mesmo se isso ocorrer dentro das sequências de intrão [43], [45]. Em nosso estudo, identificamos um amplo espectro de genes associados ao câncer nos locais de integração e regiões sequência lateral. A maioria dos genes nos locais de integração foram associados com o desenvolvimento do tumor, e genes dezenove foram fortemente relacionado ao câncer cervical. Alguns deles atuam como supressores de tumor (tais como,

miR-34a

,

MSH2

,

WWOX

e

TIMP3

,

et al

) ou oncogenes (como,

rock2

,

CD28

,

EBAG9

e

ANGPT1

,

et al

). Curiosamente, a maioria deles não foram relatados em documentos anteriores [31], [45].

miR-34a

, um importante supressor de tumor, é regulada no cancro do colo do útero [48], [49]. Tem sido relatado que a oncoproteína E6 de HPV16 e HPV18 pode inibir a expressão de tumor-supressor

miR-34a

por desestabilização de p53 e resultaram na proliferação das células [50]. A interrupção do

miR-34a

gene pode interpretar ainda mais o fenômeno da redução da expressão de

miR-34a

em câncer cervical.

MSH2

é uma proteína de reparo incompatível DNA, e associado a via de reparação do ADN [51], [52]. Diminuição da expressão de MSH2 pode ser um fator de risco para o câncer cervical fase inicial [53].

rock2

, uma molécula de sinalização importante, pode promover a metástase do câncer do colo do útero por upregulating e activar a expressão e função da proteína moesin através RhoA /rock2 caminho [54]. Além dos genes associados ao cancro, os genes em locais de integração e regiões sequência de flanqueio pode ser também benéfica para a integração do genoma virai.

FANCM

que é um translocase DNA e altamente relacionada à replicação do DNA regula a sinalização do ponto de verificação e progressão forquilha de replicação [55], [56]. Outros genes, tais como

COX6B1

está relacionada à célula apoptose [57] e

ESRRA

também foram relatados associados com câncer cervical [58]. Além disso, entre 45 eventos de integração, 13 eventos levou a transcrição antisense das sequências de codificação, tais como

PRDX5

,

EBAG9

e

CD28, etc

. Essas integrações foram geralmente considerados sem interesse. No entanto, as suas sequências com sentido foram associadas com a restauração de ADN ou o desenvolvimento do tumor e pode afectar tanto o hospedeiro e a expressão do gene virai durante o desenvolvimento do cancro do colo do útero. A integração mais na orientação anti-sentido foi o gene que codifica peroxiredoxina 5 (

PRDX5

), um emzyme de protecção contra o stress oxidativo [59], [60]. A sua expressão alterada devido à integração de HPV16 poderia ter consequências virológica significativa, juntamente com a integração em genes de reparação de ADN, tais como FANCM e MSH2. A sobre-regulação de

EBAG9

expressão tem sido observado em vários tumores malignos [61]. O fator de estimulação sinérgica de

CD28

que mantém a homeostase imunológico desempenha um papel no aumento da susceptibilidade ao câncer cervical [47].

Em conclusão, as alterações dos padrões de transcrição de HPV 16 genes precoces ir junto com a progressão da neoplasia intra-epitelial cervical carcinoma de colo do útero e a integração do genoma virai no cromossoma do hospedeiro. A mudança ou a seleção de padrões de transcrição e para a integração na expressão de genes do hospedeiro nos locais de integração e flanqueando regiões de sequências celulares tudo pode tomar parte na oncogênese de cancros induzidos por HPV16.

Informações de Apoio

Figura S1 .

Os tipos de sequências virais relacionadas com poli A na suas extremidades 3′-. O tipo de Classe I mostra sequências de E1 diretamente terminou com poli A; o tipo de Classe II mostra E1 emendado para E4 e depois para L1 e também terminou com sequências poli A.

▴, existem vários sites de truncamento em E1 (dados mostrados na figura S2)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0097588.s001

(TIF)

Figura S2.

diferentes locais de truncamento na região E1 no tipo de classe I. Existem quatro locais truncadas em E1, 880, 949, 1054 e 1234, respectivamente

doi:. 10.1371 /journal.pone.0097588.s002

(TIF)

Figura S3.

Vários sites doadores emendados em E1. Em Tipo A há dois locais de integração em E1, 880, e 1107, respectivamente. As caixas sólidas significa sequências celulares

doi:. 10.1371 /journal.pone.0097588.s003

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos Zhi-Ming Zheng da NIH e Kong -nan Zhao pelos comentários e revisões.