Abstract

Há evidências crescentes de que muitos tumores sólidos são organizadas hierarquicamente com a maior células tumorais terem potencial de reprodução limitado, mas são sustentados por uma célula-tronco, como que perpetua o tumor. Essas células-tronco cancerosas têm a hipótese de se originar de transformação de células-tronco de tecidos de adultos, ou através de re-aquisição de imóveis estaminais-como por células progenitoras. carcinoma adeno (ASC) é um tipo agressivo de câncer de pulmão que contém uma mistura de células com fenótipos escamosas (citoqueratina 5+) e adenocarcinoma (citoqueratina 7+). A origem destas misturas não é claro como carcinomas escamosos Pensa-se que surgem a partir de células basais no tracto respiratório superior, enquanto os adenocarcinomas se crê formarem a partir de células estaminais na junção alveolar brônquica. Temos isolada e caracterizada câncer populações estaminais-como ASC, através da aplicação de meios seletivos de cultura definido inicialmente usada para cultivar células-tronco pulmonar humanos. células homogêneas selecionados a partir de amostras tumorais ASC foram estavelmente expandiu

in vitro

. xenotransplantes primárias e lesões metastáticas derivadas destas células em camundongos NSG recapitular plenamente tanto o adenocarcinoma e características escamosas do tumor do paciente. Curiosamente, enquanto que a todos CSLC citoqueratinas co-expresso 5 e 7, a maioria das células de xenoenxerto expressos quer um, ou nenhum, com 10% restantes duplo positivo. Nós também demonstraram o potencial do CSLC para diferenciar a estruturas multi-linhagem de ramificação com morfologia pulmonar expressando brônquica, alveolares e neuroendócrinos marcadores in vitro. Tomados em conjunto as propriedades destes derivados de CSLC ASC ASC sugere que podem surgir a partir de uma célula-tronco pulmonar primitiva distinta das células bronquiais-alveolar ou estaminais basais.

Citation: Mather JP, Roberts PE, Pan Z, Chen F, Hooley J, Jovem P, et al. (2013) Isolamento of Cancer Stem Cells como da Human adenoescamoso Carcinoma do Pulmão Suporta uma Monoclonal origem a partir de um celular Tissue Stem multipotenciais. PLoS ONE 8 (12): e79456. doi: 10.1371 /journal.pone.0079456

editor: Alan P Fields, Mayo Clinic College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Abril 2013; Aceito: 23 de setembro de 2013; Publicação: 04 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Mather et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Nenhuma corrente fontes de financiamento externo para este estudo. O trabalho foi financiado integralmente pela MacroGenics, Inc., através de captação de recursos das empresas de private equity. Os financiadores não estavam envolvidos em qualquer aspecto do desenho ou condução da pesquisa

Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações: este trabalho foi financiado integralmente pela MacroGenics, Inc., através de captação de recursos das empresas de private equity. Todos os autores foram empregadas pela MacroGenics, Inc., quando este trabalho foi realizado e opções de ações próprias e /ou ações da empresa. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

A hipótese de células-tronco do câncer afirma que os cancros resultar de alterações mutacionais ou epigenética em células estaminais de tecidos (ou progenitoras), que permitem que estas células para escapar aos controlos de crescimento intrínsecas e extrínsecas e se tornar invasivo [1]. Além da evidência forte apoio a esta hipótese em cancros hematopoiéticas, existe um conjunto crescente de evidências de que uma série de tumores sólidos, incluindo o cérebro, cólon, mama e pulmão [2] estão hierarquicamente organizado com um subconjunto de haste de auto-renovação como as células. Além disso, há evidências recentes directa a partir de modelos animais que cólon, cérebro, e cancros da pele podem surgir a partir de tecido de células-tronco como presentes nos tecidos adultos [3-5]. As características estaminais-como de auto-renovação, tumorigenicidade, resistência aos medicamentos, bem como a capacidade de recapitular todos os tipos de células do tumor, têm permitido investigadores para abordar questões importantes sobre a biologia desta população de células, que têm relação direta com o tratamento do paciente [3,6].

Há evidências de ambos os modelos animais e doenças humanas que os cânceres de pulmão estão entre aquelas que surgem a partir de células-tronco-like [7-10]. No entanto, a fonte das células-tronco (SC) envolvidos no desenvolvimento normal do pulmão, manutenção e reparação após uma lesão é um pouco mais complicado do que os tecidos tais como a pele ou o cólon (para revisões ver: [11,12]), em que vários “condicional “células estaminais foram pensados ​​para ser envolvido na reparação de diferentes porções do pulmão após a lesão [13]. Estes podem, ou não, ser os mesmos células estaminais responsáveis ​​pela manutenção dos tecidos [14]. Sugeriu-se que dentro de cancros do pulmão, NSCLC (cancro do pulmão de não pequenas células) adenocarcinomas surgem de SC na junção alveolar brônquica (BASC), carcinomas escamosos surgir de SC basal dos brônquios e traquéia, e carcinomas de células pequenas surgem de neuroendócrinas pulmonares células [11,12].

carcinoma adenoescamoso (ASC) do pulmão é um subtipo pouco frequente de câncer NSLC diagnosticada por tumores que contêm células com fenótipos histológicos escamosas e adenocarcinoma (AC) (definido como 10% de cada). ASC compreende 4-8% das NSCLC, mas é muito agressivo para que os pacientes com ASC tem um pior prognóstico que aqueles com qualquer célula escamosa ou adeno-carcinomas [15]. Postula-se que estes tumores surgem quer a partir de misturas de células derivadas de dois tumores de diferentes tipos, o mais mutação de um tipo que dá origem a outro, ou de uma origem monoclonal de onde derivam a partir de um comum, ainda não identificada, precursor [16-19]. Estudos sobre os tumores de pacientes ASC têm mostrado que células do adeno e porções escamosas de ter um tumor semelhante, mas, anormalidades cromossómicas não necessariamente idênticas [16], ou mutações [17], sugerindo uma origem monoclonal para este tipo de tumor. No entanto, isso não constitui prova de que a capacidade destes dois fenótipos a surgir a partir de uma única célula, e as células a partir do qual ASC pode originar permanece não identificado.

Neste relatório, nós descrevemos-tronco cancerosas como as células (CSLC ) isolado a partir de pacientes com ASC utilizando condições de cultura isentas de soro definidas. Além disso, foi demonstrado que estas células têm as propriedades de auto-renovação, a tumorigenicidade, e metástase. Tumores derivados a partir destas células, designadas LUCA22 e LUCA35, incluindo as derivadas de células únicas e clonadas a partir de ambos os componentes contidos metástases com (adeno) diferenciação e áreas de diferenciação escamosa glandular, suportando uma origem monoclonal para este tumor. O propriedades de crescimento CSLC, expressão gênica e a capacidade para formar estruturas de ramificação em co-cultura 3D com estroma pulmonar continuar a apoiar a hipótese de que esses CSLC têm células-tronco como propriedades. Além disso, os derivados destes xenoenxertos CSLC conter células positivas para chromagranin A, mucina 5A, vimentina, surfactante de proteína D, aquaporina 5 e citoqueratinas 5, 7, 14 e 20, demonstrando a capacidade destas células para sofrerem diferenciação multi-linhagem. Estes dados sugerem que a ASC são de origem monoclonal e possivelmente surgir a partir de uma célula-tronco pulmonar primitiva distinta da bronquiolar células estaminais alveolar (BASC) ou a células estaminais basais das vias aéreas superiores.

Materiais e Métodos

declaração Ética

tecidos de câncer de pulmão foram obtidos através da National Disease Research Interchange, 1880 John F. Kennedy Boulevard, 6º andar, Philadelphia, PA 19103 (url: https://ndriresource.org/) . CEPs institucionais aprovou os protocolos NDRI para a aquisição de tecidos e usar, e consentimento informado apropriado foi obtido a partir de pacientes por NDRI. Nenhuma informação foi disponibilizada que de alguma forma comprometer o anonimato dos pacientes. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O Comitê Animal Care e Use MacroGenics Oeste Institucional aprovado todos os protocolos utilizando camundongos. Todos cirurgia foi realizada sob anestesia, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Os animais foram verificados diariamente e os animais doentes retirados e sacrificados. Todos os animais foram sacrificados no final da experiência antes da recolha de tecidos. A eutanásia foi por asfixia CO2 entregues em um cilindro de gás comprimido.

selecção CSLC, expansão e caracterização

tecidos de câncer de pulmão foram obtidos através da National Disease Research Interchange, 1880 John F. Kennedy Boulevard, 6º andar, Philadelphia, PA 19103. IRBs Institucionais aprovou a protocolos para a aquisição do tecido e uso, e o consentimento informado apropriado foi obtido a partir de pacientes por NDRI. O cancro do pulmão linhas celulares derivadas foram expandidos a partir ASC e tumores AC (ou estroma tumoral) e mestre e bancos de células de trabalho preparados. repetição em tandem breve análise (STR) foi utilizado para a identificação.

As condições definidas apropriados para as células estaminais /progenitoras normais humanos fetais epiteliais tecido pulmonar [20] foram utilizados inicialmente e depois optimizado empiricamente para o isolamento e o crescimento de tecido de cancro tal como previamente descrito [21]. condições isentas de soro foram derivados que enriquecer para, e permitir a expansão de, uma pequena população de células a partir de ASC e CA (mas não carcinoma de células escamosas (SCC)) do pulmão. A adição de soro de 1-2% para os suplementos hormonais ou suplementação com elevado 10% (v /v) de soro resultou numa população não-tumorigénica de células com o potencial de crescimento limitado

In vitro

e as propriedades das células estromais . Veja Métodos S1 e Tabela S1 para os métodos detalhados para isolamento de células de tumores; e meios de comunicação e as concentrações de suplemento para a seleção, a expansão, a clonagem e diferenciação do ASC-CSLC definido; e expansão das células do estroma. As condições para a diferenciação de células estaminais do pulmão em 3 dimensionais Matrigel

TM culturas foram modificados a partir de Delgado, et ai, tal como descrito nos métodos S1. As amostras de tumores e linhas CSLC isolados foram caracterizados comercialmente por seus padrões de repetição tandem curtas originais usando 16 STR regiões. Esta análise é descrita em Methods S1 e S2 resumidos na Tabela.

O tipo de tumor e do estádio (a partir dos relatórios de patologia) dos quatro CSLC tumor do estroma e 3 CSLC culturas encontram-se resumidos na Tabela S3. Cinco linhas celulares ATCC, derivadas a partir de AC, SC e ASC utilizando meios contendo soro, foram utilizados como controlos em uma série de experiências. As características destas linhas encontram-se resumidos na Tabela S4

analisa

genética

análise

transcriptase reversa (RT-PCR).

O ADN foi isolado a partir de amostras de animais utilizando o Assistente SV genómico kit de purificação de ADN seguindo o protocolo do fabricante (Promega). O DNA humano foi quantificado por PCR utilizando iniciadores específicos de gene RPL19-humanos e as sondas [22]. Os iniciadores foram adquiridos a partir SA Biosciences como “RT

2 qPCR Primer Ensaios”. A lista de iniciadores e números de catálogo é dada na Tabela S5. Para avaliar a expressão de genes específicos, as reacções de RT-PCR foram realizadas em ADNc gerado a partir de ARN total isolado a partir de culturas individuais, utilizando CSLC RT² qPCR Primer Ensaios e

GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) como um gene constitutivamente activa controle e RT² SYBR® verde /ROX qPCR Mastermix (Qiagen). Expressão de genes seleccionados foi também determinada em pulmão humano normal e células humanos normais isolados epiteliais brônquicas. Ciclo limiar (Ct) para cada conjunto de iniciadores foi determinada executando reações de RT-PCR em 7000 Sistema de Detecção de Sequência ABI PRISM® (Life Technologies Corporation). DCt para cada gene ISC foi determinada como (Ct [gene] – Ct [GAPDH]).., Em seguida, expressão relativa a GAPDH determinado como

análise de 2

-DCt

repetição em tandem curto (STR)

Dezasseis-lócus tandem curtas de repetição-análise (STR) foi realizada nas amostras de tumor original, se material suficiente estava disponível (7/9 casos), sobre os bancos de células mestras e de trabalho, e longitudinalmente em vários intervalos em cada a linha, e em tecidos excisados ​​a partir de xenoenxertos de tumor de rato para avaliar a identidade. Análise STR foi realizada com o Kit AmpFℓSTR® Identifiler® Amplificação por PCR (Applied Biosystems, Foster City CA). loci amplificados foram carregados em 3730xl da Applied Biosystem Automated Sequencer e analisados ​​usando a versão do software GeneMapper da Applied Biosystem 4. MSI-H foi diagnosticada pela presença de instabilidade alélicas em mais de 5 de 15 autossômica STR loci [23].

a análise da mutação.

a análise da mutação sobre as linhas de células foi realizada por dois métodos complementares. Análise do

KRAS

exão 2,

BRAF

exão 15,

PIK3CA

exons 9 e 23, eo Cluster Região Mutation (MCR) de

APC

exão 15 foi realizada por sequenciação do ADN genómico amplificado como descrito anteriormente [24,25]. A plataforma de espectrometria de massa MALDI-TOF e o painel OncoCarta foram usadas para detectar mutações de locais de 238 em 19 loci de genes, incluindo os acima, como previamente descrito [26].

análise de citometria de fluxo

As células em cultura foram removidos com colagenase /dispase (Roche Applied Science) ou com tripsina /EDTA (Invitrogen), lavada, e re-suspensas em meio F12 /DMEM (Gibco /Invitrogen) + 1,0% de BSA (Rockland Immunochemicals). As contagens de células foram obtidas utilizando reagentes Goiaba ViaCount (Guava Technologies). Cinquenta mil células viáveis ​​foram divididas em alíquotas para de fundo redondo, de HTS de ligação baixa placas de 96 cavidades (Beckton Dickinson), incubadas com o anticorpo, a 4 ° C durante 20 min., Lavadas em tampão de análise, e contra-corados, quando necessário, com dois ug /ml GAM-IgG (H + L) conjugado com PE ou Alexafluor532 (Invitrogen). As células foram lavadas e fixadas, quer em tampão de análise + 0,1% de formaldeído (Polysciences), ou re-suspenso em tampão de análise, em seguida, analisado num goiaba-PCA96 ou num FACScan (Becton Dickinson). Os dados foram analisados ​​utilizando o software FlowJo (TreeStar Inc.). Os resultados foram calculados como a intensidade de ligação (log

10 [manchado] – log

10 [de controlo de isotipo]). Veja Métodos S1 para obter detalhes adicionais. ALDH foi avaliada usando o fluxo baseado ALDEFLUOR

® ensaio (Stem Cell Technologies) [27] com o substrato titulada de 1:10 a 1:. 100 diluição

Para a análise de dupla imunomarcação de CK5 /7 ligação, placas confluentes de células foram dissociadas com tripsina a 0,05% /EDTA, neutralizada com inibidor de tripsina de soja, e lavadas por centrifugação. O sedimento resultante foi fixada em 4% de paraformaldeído (PFA) seguido por permeablization em 0,1% de Triton-X 100. anti-soro primário foi adicionado a uma diluição de ratinho anti-humano citoqueratina 7 (EPR1619Y) 1:50 (Abcam, Ad68459), adicionou ao mesmo tempo que 0,5? g /ml de ratinho anti-humano de citoqueratina 5 (BioCare médica, # PM234AA). anti-soro secundário foi de 1 ug /ml de anticorpo de cabra anti-coelho Alex Fluor 488 (Life Technologies) ™ adicionado em simultâneo com 1 ug /ml de anticorpo de cabra anti-ratinho I-Phycoerytherin (Life Technologies ™). amostras não coradas, amostras secundário-somente, e controles de amostra primária simples foram utilizados na análise.

In vivo tumorigenicidade

linhas CSLC foram implantados sob a cápsula renal (SRC) da imunológico NOD deficiente SCID comum γ murganhos com receptor de cadeia de ratos (NSG) como células embebidos em colágeno, como descrito anteriormente [ ,,,0],22,28] e deixou-se crescer durante até 32 semanas. Os animais foram examinados em 2-8 meses para os tumores e metástases. Os tumores foram removidos e embebidos em IHC, ou separados de células isoladas e usadas para PCR ou análise de marcador, tal como indicado.

Imunohistoquímica

tecidos fixos.

tecido de xenotransplante tumoral excisada foi fixado em formalina 10% neutra (Sigma), encaixado em um bloco de parafina e secções de 5 um corte. As lâminas foram de-parafinado e re-hidratadas, pré-tratada com uma solução de recuperação de antigénios (tampão de citrato a pH 6) numa câmara decloaking (Biocare Médico), e coradas durante 1 hora com indicados anticorpos anti-humanos (por exemplo, CD34, CD44) utilizando o protocolo do fornecedor ( biocare médica). As lâminas foram lavadas com PBS e incubadas durante 30 minutos com HRP de cabra anti-ratinho (MACH2, Biocare Médico) e substrato diaminobenzidina cromogénio, em seguida, ligeiramente contrastadas com hematoxilina e eosina.

tecidos congelados.

Para cortes congelados de câncer humano normal de pulmão e de pulmão, xenotransplantes LUCA derivados, pelotas de células de culturas 2D, ou Organóides de cultura 3D foram embebidos em OCT, em seguida, criostato seccionados a 7 um. As secções em série foram fixadas em acetona a 4 ° C durante 10 minutos, e secas ao ar durante 30 minutos. As lâminas foram incubadas em 3% H

2O

2 durante 10 minutos, seguido por duas lavagens em tampão. soro de cabra normal a 5% foi aplicada às lâminas durante 10 minutos em seguida, soprado. As lâminas foram incubadas com os anticorpos de teste (concentrações e tempos de incubação determinados por protocolos optimizados anteriores) e lavadas duas vezes com tampão. Os controlos foram incubados com um anticorpo de controlo de isotipo correspondente a cada anticorpo experimental testado. Após a incubação, o anticorpo primário, as lâminas foram incubadas com Dako Envision HRP anti-murganho de coelho ou polímero durante 30 minutos, seguido por duas lavagens em tampão. Diaminobenzidene tetrahidrocloreto (DAB) foi usado como um cromogénio para visualizar as manchas.

imunofluorescência em culturas de monocamada.

As células foram cultivadas quer em lamelas de vidro ou lâminas de câmara de vidro (Lab-Tek), seguida fixadas com PFA a 4% e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100. anti-soro primário foi de 1 ug /ml de ratinho anti-humano de citoqueratina 5 (BioCare médicos, # PM234AA), adicionado ao mesmo tempo como uma diluição de 1: 100 de anticorpo de coelho anti-humano citoqueratina 7 (EPR1619Y) (Abcam, Ad68459). anti-soro secundário era 2 ug /ml de cabra anti-ratinho Alex Fluor 488 (Life Technologies) ™ adicionado simultaneamente com 2 ug /ml de anticorpo de cabra anti-coelho Rodamina Red ™ -X (Life Technologies ™). IgG1 de ratinho foi utilizado como um controlo de isotipo, e foram usadas condições secundário-apenas para os controlos coloração não específica. A imunocoloração foi visualizado em um microscópio Nikon TE300 com um filtro ET Sedat Quad Definir e uma câmera CCD Retiga EXi. software iVision foi usado para capturar imagens.

Resultados

LUCA CSLC caracterização

O tecido tumoral, enviadas em gelo, foi recebida de um ressecção em cunha de tumores primários de pulmão. O tecido foi disperso e células plaqueadas em condições isentas de soro (ou meio contendo soro, para a expansão de células de estroma). Este meio definido seleccionados e expandidos uma pequena proporção das células epiteliais a partir de 3 de 4 adenocarcinomas do pulmão (AC) (LUCA 32, Luca33) e dois de dois carcinomas adenoescamosos (ASC) (LUCA22, LUCA35) tecidos. Em contraste, não há culturas bem sucedidas foram obtidos a partir de amostras de tecido de carcinoma escamoso (4 tentativas separadas) usando este mesmo meio. A adição de soro no início das culturas primárias a partir dos resultados de tumores no início da expansão das células estromais em 3 de 3 casos (por exemplo LUCA11 (1% de soro + hormona aditivos), LUCA36 (10% de soro)), que pode ser expandida para a passagem limitada e depositado. Estas células estromais têm uma aparência de fibroblastos em FBS a 10% e não são tumorigénicas quando implantados no 5×10

5 sob a cápsula sub-renal de um murganho imunodeficiente.

STR Caracterização e análise mutacional de culturas de células derivadas de tumores

Análise

Curto repetição em tandem (STR) em 16 locais deu um padrão único para cada uma das 6 linhas, que eram distintos uns dos outros e de quaisquer linhas ATCC (ver Tabela S2). Três de 4 linhas mostrou alguma perda de heterozigosidade quando se compara a amostra de tumor (que incluem células não tumorais) e o CSLC. Alguns ganho de heterozigosidade foi visto com a passagem alargada (p47 = 150 duplicações da população)

análises de mutações revelaram que 100% da ASC (LUCA22) exposições CSLC uma mutação de ponto único G12V dentro das regiões de codificação de

KRAS

, sem mutações encontradas em

APC

ou

PIK3CA

. As linhas de corrente alternada (LUCA32 e Luca33) também tinha uma mutação único ponto em KRAS somente (G12V e G12C respectivamente) (Tabela S3).

tumorigenicidade e metástase

Para testar a potencial tumorigénico, as células LUCA22 em vários inóculos (5x10e4, 5x10e3 ou 5x10e2) foram incluídos em botões de colágeno e implantado sob a cápsula sub-renal (SRC) de severamente ratos NSG imunodeficientes. Os tumores foram observados em todos os inóculos de células por 31 semanas (Figura 1, Tabela S6). Na célula superior foram observadas metástases inóculos em vários órgãos tão cedo quanto 10 semanas após a implantação SRC. As metástases aumentada na distribuição e tamanho com o tempo, com todos os animais inoculados com o número mais elevado de células que mostra metástases em 16 ou mais semanas. As metástases foram observadas no fígado, baço, pâncreas, mesentério, diafragma e, ocasionalmente, em locais distantes, tais como o pulmão e do cérebro (Figura 1). As células inoculadas por via subcutânea cresceu em tumores, mas não metástase (5x10e5, até 24 semanas).

Comparação da morfologia e histopatologia do tumor do paciente original do qual foi derivado LUCA22 e xenotransplantes e metástases derivado do LUCA22 CSLC. Seções dos tumores são coradas com H E para mostrar adenocarcinoma (setas grossas) e escamosas (setas finas) morfologias (top 2 linhas, à esquerda). Superior direito 2 linhas mostra metástases para o pulmão e fígado (setas) e H E seções destes órgãos que mostrem nódulos metastáticos (setas). seções adicionais são coradas para citoqueratinas 5 (CK5), 7 (CK7) e 18 (CK18), ou vimentina (VIM). A linha inferior é duplamente coradas para o factor de células estaminais (SCF-marrom) e c-kit (CD117 (vermelho). A caixa de inserção à direita mostra mais baixas crescentes aumentos de células LUCA22 humanos (box, setas) que têm metástase a partir de uma sub tumor renal para o cérebro, manchado para o tumor de pulmão Napsina específico (vermelho) /TTF1 (marrom) double mancha.

um elemento definidor CSCs é que eles podem formar um tumor a partir de uma única célula e recapitular a morfologia do tumor original do doente. para testar se uma única célula pode dar origem a tumores diferenciadas, oito clones de células únicas derivadas de LUCA22 foram escolhidos para expansão e implantação no SRC. os tumores cresceram a partir de todos os 8 clones seleccionados para o teste (Figura 2 , Tabela S6). dois dos clones apresentaram metástases por 8 semanas

in vivo

. Assim, a linha LUCA22 é capaz de dar origem a um tumor metastático a partir de uma única célula. a seguir, comparou os xenotransplantes derivados de LUCA22 ASC para o tumor do paciente original usando IHC de olhar para os marcadores característicos da ASC.

as células LUCA22 clonados dar origem a xenoenxertos coloração carcinoma como adeno- e escamosas. Os xenoenxertos decorrentes da LUCA22 CSLC, 5 LUCA22 clones, e uma metástase a partir do clone 2G1 são mostrados coradas com H E, Napsina /TTF1, ou p63 /CK5 após 8 semanas no animal (A). Os clones que metastizaram são indicados por *. B. Os xenoenxertos de tumor derivadas do paciente (topo) do LUCA 22 e xenotransplantes derivados de LUCA22 clone 5E11 nos tempos indicados e ampliações. Estas secções são duplamente coradas para CK5 (vermelho) e CK7 (marrom).

Análise comparativa do paciente e de xenotransplante de tumores por IHC

Desde CK5 e expressão CK7 em diferentes partes do mesmo tumor é patognomônico para ASC, comparamos a distribuição de CK5 e CK7 coloração dentro do tumor original do doente, xenotransplantes derivados de células LUCA22, LUCA22 clones, e metástases destes xenoenxertos. LUCA 22 xenoenxertos derivados apareceu como uma ASC pouco diferenciado que se assemelhasse de perto a histologia do tumor original do paciente (Figura 1). Algumas áreas do tumor tinha a aparência de um adenocarcinoma e foram positivas para a coloração CK7, enquanto outras áreas do tumor tinha características de um carcinoma epidermóide e coradas positivamente para CK5, reproduzindo assim o fenótipo ASC visto no tumor original do doente. Mesmo os tumores derivados das células 500 exibiu o padrão de ASC de ambos CK5 e coloração CK7 (dados não mostrados). As metástases no pulmão e fígado também continham células que eram positivas para a coloração e CK5 CK7 (Figura 1).

Para caracterizar ainda mais esses tumores, que os tecidos corados com duas combinações de anticorpos utilizados por patologistas para diferenciar adenocarcinomas do pulmão (Napsina A + TTF1) [29] e carcinomas de células escamosas (p63 + CK5) [30]. Estes dois conjuntos de anticorpos foram observados para corar diferentes áreas do tumor progenitoras e todos os 8 xenoenxertos e metástases derivadas clonalmente (Figura 2 A, Figura S1). xenotransplantes clonalmente derivados, duplos coradas para CK5 e CK7, também foram expressos em distintas, mas regiões adjacentes do tumor (Figura 2 B). Curiosamente, o tumor do paciente, bem como xenoenxertos, expressa CK18, um marcador epitelial, e vimentina, um marcador mesenquimais (Figura 1), com a porção do estroma do tumor do paciente, mas não o xenoenxerto, também coradas positivamente com o anti- vimentina anticorpo humano.

Além disso, foram examinados os tumores para o factor de células estaminais (SCF) e é do receptor CD117 (c-kit) e ALDH1A1 [9], proteínas reportadas para desempenhar um papel na tumorigénese do pulmão. Tanto o tumor do paciente e os tumores de xenoenxerto foram positivos para ambos os SCF e CD117, encontrada em áreas adjacentes do tumor (Figura 1), embora SCF coloração era mais extensa que a coloração CD117 (Figura S2 A). ALDH1A1 também foi encontrada tanto no tumor do paciente e xenotransplantes derivados de LUCA22, bem como metástases para o pulmão (Figura S2 A, B). O LUCA22 CSLC foram positivas para a actividade da ALDH, uma porção do qual pode ser neutralizado pela DEAB inibidor específico ALDH1 (Figura S2 C)

expressão Cytokeration em CSLC

Uma vez que a expressão de ambos e CK5 CK7, em diferentes áreas do tumor, é característica da ASC nós duplamente coradas LUCA22 e LUCA35 CSLC monocamadas para CK5 e CK7 usando rodamina ou anticorpos marcados com FITC. Surpreendentemente, a maioria das células CSLC foram duplo positiva CK5 + CK7 +. As células duplamente coradas pareciam ter níveis variáveis ​​de CK5 e CK7 nas células (Figura 3). Isso também aconteceu com a linha clonal derivada 5E11 (Figura 3 D). A quantificação de CK5 e CK7 células coradas duplo foi efectuada utilizando citometria de fluxo de células permeabilizadas, fixas e coradas (Figura 4 A). Novamente, o LUCA 22, as células LUCA22 -5E11 e LUCA35 clonados todos eram predominantemente dupla positiva para CK5 e CK7. Como controles, quatro ATCC células derivadas de soro linhas foram duplamente coradas para IHC e análise de fluxo (ver resultados S1). Nenhum mostrou esse padrão de coloração dupla do CSLC. Curiosamente, quando a LUCA22 CSLC (incluindo os clones de células individuais) são permitidos para formar tumores e o CK5 expressão CK7 classifica em diferentes populações de células (Figura 2 B). Assim, existem CK5 + /CK7-, CK5- /CK7 +, e uma pequena população de células CK5 + /+ CK7 nos tumores (Figura S4). A grande população CK5- /CK7- visto no SQ dispersa e tumores SRC pode ser contaminar células do estroma murino, uma vez que não seleciona ativamente contra estas células para esta análise.

Imunofluorescência (painéis AG) e contraste de fase (H) das culturas em monocamada coradas permeabilizadas para CK5 (vermelho), CK7 (verde), ou ambos. LUCA22 (A-C) o 5E11 clone LUCA22 (D) e LUCA35 (E-G) são mostrados. Os painéis A-C, E-G mostram o mesmo campo corados individualmente e a sobreposição de ambos. Painel H mostra o mesmo campo como (E-G) como uma imagem de contraste de fase. Todas as imagens são de 40X de ampliação.

O painel A é dados de análise de fluxo de clone LUCA22 permeabilizadas 5E11 e LUCA 35 células ASC dupla coradas para CK5 e CK7. As células positivas% e log de sinal a partir da análise de fluxo de proteínas da superfície celular (B) é mostrado para o CSLC 2 ASC-derivado (LUCA22 (escuras barras verdes), LUCA35 (verde claro)), o CSLC 2 AC-derivado (LUCA32 ( amarelo), Luca33 (laranja)) e células do estroma do cancro do pulmão (LUCA11 (azul escuro), LUCA36 (azul claro)) no painel B. A ligação log (símbolos) e de ligação sobre o controle isotipo cento (barras) é mostrada para cada um. O painel C mostra uma única população de que os rótulos dupla com anticorpos CD44 e CD24 para as células e LUCA22 LUCA35.

superfície celular análise marcador

Para melhor caracterizar as populações derivadas selectiva de tumores de células do pulmão, células a partir das linhas 4 CSLC (ASC: LUCA22, LUCA35; AC: LUCA32, Luca33) e 2 linhas de estroma (LUCA11, LUCA36) foram analisadas por citometria de fluxo para a ligação de um painel de anticorpos humanos para os marcadores frequentemente utilizados para seleccionar ou identificar, CSLC de tumores sólidos (Figura 4 B). CD44 e CD29 estiveram presentes em todas as linhas, incluindo as linhas do estroma. CD24 estava presente em todas as quatro das linhas CSLC, mas não as células estromais. Nenhuma das linhas com destino um dos anticorpos monoclonais CD133 que foram relatados para selecionar para o CSC em alguns tumores, embora a universalidade da CD133 como um marcador de células-tronco no câncer de pulmão foi contestada [12]. Mucina 1 (MUC1) e estágio específico embrionária antígeno 1 (SSEA1) foram expressos em um nível superior nas linhas de corrente alternada que as linhas ASC enquanto ABCG2 é encontrado em LUCA22, mas não as outras linhas. Para procurar homogeneidade das populações, o clone LUCA22-5E11 e a linha celular LUCA35 foram duplamente marcadas para CD24 /CD44 (Figura 4 C). A rotulagem dupla mostrou que um população ligada ambos os anticorpos. Quatro clones de LUCA22 foram seleccionados e analisados ​​em paralelo com a linha parental LUCA22. A ligação foi muito semelhante para os clones e da linha parental para a maioria dos marcadores com distribuições unimodal, embora tenha sido observado ligação alguma variação no pico. (Figura S5 A-C). Uma vez que o marcador de células estaminais CD117 foi encontrado em apenas uma pequena porção do CSLC, tentou-se enriquecer para esta população usando FACS. Após 4 tipos sucessivos, não fomos capazes de aumentar a percentagem de células positivas para CD117, sugerindo que estas células não representam uma subpopulação de células separáveis ​​na CSLC (Figura S5 D).

A expressão genética em linhas CSLC

Para caracterizar mais extensamente expressão genética nestes CSLC, olhamos para um conjunto de 23 genes selecionados daqueles supostamente expressa em cancros do pulmão AC e SCC e tipos de células do pulmão normais diferenciadas por RTPCR. O padrão de expressão das linhas de ASC era único na medida em que co-expressa (incluindo clones) múltiplos genes que se pensa serem característicos da CA e SCC, bem como uma série de marcadores de linhagem normais de pulmão. A expressão de um número de genes foi fortemente regulado para cima nas linhas ASC em comparação com as linhas de corrente alternada (Figura 5), ​​incluindo:

MAGEA3, MAGEA6, CSTA,

TFPI2,

KRT5, TWIST1

e

PTHLH

. Destes, apenas a expressão MAGEA3 /A6 foi totalmente restrita a células de câncer de pulmão ( 30X superior na ASC do que AC) e não vi nada no estroma tumoral ou amostras de pulmão normais. Marcadores para outros tipos de células diferenciadas foram expressos em níveis baixos no CSLC (

SCGB1A1

, células Clara;

MUC5AC

, células caliciformes;

AQP5

, tipo I pneumocytes; e

SFTPC

, BASC) ou em níveis muito baixos (

SFTPD

, pneumócitos tipo II;

CHGA

, células neuroendócrinas).