Chernobyl
Abstract
A relação forte e consistente entre a irradiação em uma idade jovem e subsequente cancro da tiróide é um excelente modelo para o estudo da carcinogénese radiação em seres humanos. Nós, portanto, avaliamos a expressão gênica diferencial em tecido tireoidiano em relação ao iodo-131 (I-131) doses recebidas a partir do acidente de Chernobyl. Sessenta e três de 104 cancros da tiróide papilar diagnosticados entre 1998 e 2008 no grupo ucraniano-americano com I-131 estimativas da dose de tireóide individuais tinha emparelhado amostras de RNA de tumor fresco congelado (T) e tecido normal (N) fornecidos pelo Tissue Chernobyl Banco e critérios de controle de qualidade satisfeitos. Nós primeira hybridized 32 alocados aleatoriamente pares de RNA de amostras (T /N) em 64 microarrays inteiras do genoma (Agilent, 4 × 44 K). Associações de expressão diferencial de genes (log
2 (T /N)) com a dose foram avaliados por meio de testes de tendência Kruskall-Wallis e em modelos de regressão lineares mistos. Embora nenhum dos genes resistiu a correção para a taxa de descoberta de falsas, foram selecionados 75 genes com
a priori
provas ou P Kruskall /P tendência 0,0005 para validação por qRT-PCR sobre os 31 pares RNA de amostras restantes ( T /N). Os dados qRT-PCR foram analisados por meio de modelos de regressão lineares mistos que incluíam dose de radiação como uma variável categórica ou ordinal. Onze dos 75 qRT-PCR ensaiadas genes (
ACVR2A
,
AJAP1
,
CA12
,
CDK12
,
FAM38A
,
GALNT7
,
LMO3
,
MTA1
,
SLC19A1
,
SLC43A3
,
ZNF493
) foram confirmados têm uma relação de dose-expressão diferencial significativa estatisticamente. Nosso estudo é um dos primeiros a fornecer dados humanos diretos sobre a expressão gênica diferencial de longo prazo em relação às doses individuais de I-131 e identificar um conjunto de genes potencialmente importantes na carcinogênese radiação
Citation:. Abend M, Pfeiffer RM, Ruf C, a Hatch M, Bogdanova TI, Tronko MD, et al. (2012) Iodo-131 Dose Expressão de genes dependente em cancros da tiróide e dos correspondentes tecidos normais após o acidente de Chernobyl. PLoS ONE 7 (7): e39103. doi: 10.1371 /journal.pone.0039103
editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Itália |
Recebido: 20 Março, 2012; Aceito: 16 de maio de 2012; Publicação: 25 de julho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Abend et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado principalmente pelo Ministério da Defesa alemão. fundos adicionais foram contribuídas pelo Programa de Pesquisa Intramural, Division of Cancer Epidemiology and Genetics, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores Declara que um dos co-autores sendo recentemente contratado pela Research NOVA empresa não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais. O co-autor estava trabalhando na radiação Epidemiologia Filial /Instituto Nacional do Câncer (REB /NCI) antes que ela mudou para NOVA Research Company, onde ela é empregada agora. No momento da radiação Epidemiologia Filial /Instituto Nacional do Câncer (REB /NCI) ela fez a sua contribuição.
Introdução
Uma das mais importantes consequências para a saúde do acidente de Chernobyl usina nuclear de 1986 um aumento dramático na incidência de câncer de tireóide entre aqueles que eram crianças ou adolescentes na época [1], [2]. Numerosos estudos epidemiológicos têm demonstrado que este está relacionado essencialmente com iodo-131 (I-131) exposição a partir do acidente para a glândula tireóide [3] – [7]. Apesar das diferenças em populações de estudo, modelos e abordagens de dosimetria, relatou estimativas de risco relativo (RR) por unidade de dose de radiação absorvida em gray (Gy) para aqueles expostos durante a infância são muito semelhantes entre a maioria dos estudos (3-6 per Gy) e compatível com os riscos estimados para o câncer de tireóide da exposição da infância à radiação externa [3] – [8]
o estudo da carcinogênese radiação em seres humanos pode tirar vantagem de situações onde as relações são fortes e consistentes, como no. situação em que a glândula tireóide é irradiado em uma idade jovem. A oportunidade para a investigação molecular do cancro da tiróide relacionadas com a radiação é facilitado pelos recursos do Chernobyl Tissue Bank (CTB), que recolhe sistematicamente amostras biológicas de pacientes com a patologia da tiróide relacionadas com Chernobyl [9]. Anteriormente estudos de pós-Chernobyl relatou diferenças genéticas entre tumores relacionados com radiação e esporádicos, incluindo
rearranjos específicos RET /PTC
genes [10] – [12]. No entanto, análises subsequentes utilizando as amostras CTB atribuiu as associações com a idade mais jovem de pacientes Chernobyl-expostos ao invés de sua exposição à radiação [13], [14]. Estudos recentes utilizando os materiais CTB e tecnologias de alto rendimento identificaram novos genes ‘específicos de radiação “[15] – [20]. Talvez a descoberta mais interessante deriva de um relatório comparando casos expostos e não expostos câncer papilar da tiróide (PTC) com tenra idade de início da Ucrânia que encontrou um ganho de banda cromossômica 7q11 com base em hibridização genômica comparativa, confirmou em casos independentes por fluorescência
a hibridação in situ
(FISH) e em tempo real de reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qRT-PCR) [20]. No entanto, os resultados a nível gene geralmente são inconsistentes entre estudos potencialmente devido ao pequeno tamanho das amostras, o uso de controles de diferentes populações, a falta de validação metodológica em amostras independentes e diferentes abordagens analíticas. Mais importante, nenhum dos estudos anteriores tinham as doses de radiação individuais assumindo que todos os casos expostos receberam a mesma dose. Dependendo da verdadeira relação dose-expressão, esta hipótese poderia causar associações falso-positivos ou falso-negativos.
Para melhorar a compreensão das consequências moleculares de I-131 exposição, avaliamos a expressão gênica diferencial primeira vez na tireóide tecido, definida como uma diferença nos níveis de expressão de genes entre o tumor e o tecido normal correspondente da tiróide, em relação a I-131 estimativas de doses individuais da tiróide. Nossa hipótese é que se os padrões de expressão de genes relacionados com a dose no tecido tumoral refletem verdadeiramente um evento importante na carcinogênese radiação em vez de um efeito de longa duração da exposição à radiação, eles devem diferir dos padrões observados no tecido normal; daí a nossa abordagem de analisar diferenciais relações dose-expressão no tumor em relação ao emparelhado amostras normais. Nosso estudo utilizou amostras de RNA a partir da CTB de pacientes submetidos a cirurgia de tireóide para o câncer de tireóide no estudo de coorte ucraniano-americana composta de aproximadamente 13.000 residentes ucranianos 18 anos no momento do acidente com medições de radioatividade individuais tomadas no prazo de dois meses após a acidente [21].
no estudo atual, primeiro realizado um ecrã inicial em metade dos casos para identificar candidatos promissores de genes que foram diferencialmente expressos em tumores e amostras de tecido normal em relação à I-131 doses baseados em microarranjos de ARN do genoma completo (fase I). Em seguida, validou os principais candidatos em tumores e amostras de tecidos normais a partir da segunda metade dos casos, utilizando qRT-PCR (fase II). Para os candidatos validados que, adicionalmente caracterizado a relação da expressão do gene separadamente no tumor e tecido normal.
Materiais e Métodos
Pacientes e Amostras de Tecido
Como resultado de quatro sequencial triagem de exames, 110 carcinomas da tiróide prevalentes e incidentes foram diagnosticados no grupo ucraniano-americano entre 1998 e 2008 no Laboratório de Morfologia do Sistema Endócrino do Instituto de Endocrinologia e Metabolismo (EIM, Kiev, Ucrânia) [3]. O Painel Internacional de Patologia, estabelecido no âmbito do projecto CTB, analisou todos os diagnósticos patológicos. Para diminuir a heterogeneidade fenotípica dos casos, foram excluídos 5 folicular e 1 carcinomas medulares da tireóide, resultando em 104 PTCs elegíveis para análise; destas 74 (71%) tinha armazenado alíquotas de ARN a partir do tumor e /ou tecidos normais em CTB. Casos incluídas e não incluídas na expressão do gene análises foram semelhantes em muitas características, incluindo dose de I-131 e, portanto, a nossa amostra do estudo é susceptível de ser imparcial. Todas as amostras de tecido foram tomadas no intra-operatório após os pacientes assinaram o termo de consentimento aprovado pelos conselhos de revisão institucional (IRB) do IEM eo centro de coordenação do projeto CTB (Comitê de Ética em Pesquisa Imperial College, Londres, Reino Unido). revisão anual de todo o projeto também foi fornecido pelo IRB do Instituto Nacional do Câncer nos EUA.
procedimentos operacionais detalhadas para a coleta, documentação e tratamento de tumor congelado e amostras de tecido da tireóide normais estão disponíveis a partir do . website CTB [22] e foram desenvolvidas em conjunto com o Laboratório de Morfologia do Sistema Endócrino do IEM eo cancro do Banco Wales
Dosimetria
métodos dosimétricos foram descritos em outros lugares [23] – [ ,,,0],25]. Resumidamente, individuais I-131 doses de tireóide e suas incertezas foram estimadas a partir da combinação de medições de radioatividade tireóide, dados sobre os hábitos alimentares e estilo de vida, e modelos de transferência ambientais utilizando um procedimento de Monte-Carlo com 1.000 realizações por indivíduo [23]. Para a análise, foi utilizada a média aritmética dos 1.000 realizações de cada indivíduo como a melhor estimativa da I-131 dose corrigida para massas tireóide típicos da população ucraniana [3].
Extração de RNA e Controle de Qualidade
os detalhes completos de extração de RNA podem ser obtidas no site da CTB [22]. Em resumo, o tecido da tiróide congelado é homogeneizado usando um Lyser tecido (Qiagen, Hilden, Alemanha). O ARN é extraído usando sistemas baseados em colunas Qiagen. ARN é congelado a -80 ° C em alíquotas de padrão de 5 ug em 20 uL. Qualidade e quantidade de RNA total isolado é medida espectrofotometricamente (NanoDrop, PeqLab Biotecnologia, Erlangen, Alemanha) e integridade do RNA é avaliada pela Agilent 2100 Bioanalyzer (Grupo de Ciências da Vida, Penzberg, Alemanha). Para nossa análise, usamos apenas as amostras de RNA com uma relação de A
260 /A
280 ≥ 2,0 (Nanodrop) eo número de integridade do RNA (RIN) ≥7.5 ≥5.5 ou para toda microarray do genoma e qRT-PCR análises, respectivamente (IMGM Laboratories, Martinsried, Alemanha).
Embora a CTB desde 137 amostras de RNA por 71 indivíduos com PTC, fomos capazes de utilizar 126 emparelhados (normais tumorais /) amostras de RNA correspondente a 63 indivíduos (Figura 1 ). Onze RNA exemplares de oito indivíduos foram excluídos devido à falta de tecido complementar (n = 5) ou devido a falhar os nossos critérios de qualidade especificados acima (n = 6).
Whole Genome Analysis Microarray (fase I)
Genoma ampla perfil de expressão foi levada a cabo utilizando o oligo de microarray da Agilent (4 × 44 K formato) combinado com um protocolo de hibridização com base de uma cor em 64 espécimes de RNA emparelhado a partir de 32 indivíduos seleccionados ao acaso (metade do conjunto de amostras) . Para garantir que os indivíduos selecionados para a análise microarray de expressão gênica (n = 32) e os restantes para análise validação por qRT-PCR (n = 31) foram semelhantes, que confirmou que suas distribuições de sexo, idade, local de residência, e I- 131 doses foram semelhantes.
Chemicals, kits e software para o ensaio genoma microarray todo foram fornecidas pela Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha. 500 ng de ARN total por amostra (fortificada com um controlo interno rotulagem) foram introduzidos numa reacção de RT-IVT e o ADNc foi, em seguida, convertido em ARNc marcado por passo de transcrição in vitro em-(uma cor Quick-Amp kit de marcação). Qualidade de ARNc marcado não fragmentado foi analisada (RNA 6000 Nano LabChip kit), e o ARNc foi limpo e quantificada (NanoDrop ND-1000 Spetralphotometer). Finalmente, 1,65 ug de cada amostra de ARNc marcado foi fragmentado e preparado para hibridação com base de uma cor (kit de hibridação a expressão do gene). A hibridação ocorreu a 65 ° C ao longo de 17 horas em microarrays separados que consistem de sondas 41000 alvo específico de gene (genes) ~20,000 e milhares de sondas de controlo. Após três lavagens com crescente severidade, intensidades de sinal de fluorescência foi detectada no scanner DNA microarray da Agilent e extraiu-se a partir das imagens, utilizando o software Agilent extracção. normalização quantil foi aplicada aos dados
Fase I:. Análise Estatística Os dados de microarray e Selecção de genes candidatos para a validação independente
Analisamos a expressão génica diferencial no tumor em relação ao tecido normal, obtido pela subtraindo o log
2 sinais da sonda transformadas do tecido normal (N) a partir do tecido tumoral correspondente (T), log
2 (t) -log
2 (N), em relação a I-131 doses estima. Esta abordagem reduz a variabilidade na expressão do gene. Utilizou-se o teste não paramétrico de Kruskall-Wallis (P Kruskall) para comparar expressão gênica diferencial em três categorias dose (≤0.30, 0,31-1,0, 1,0 Gy) com pontos de corte de aproximadamente correspondente aos tercis de distribuição de dose entre casos e modelos de regressão linear com teste de tendência (P linear) para a dose contínua. Apenas os transcritos de genes que tinham uma chamada “presente”, pelo menos, 50% das amostras de ARN a partir do tumor e tecido normal foram incluídos na análise da expressão génica diferencial (~15,000). Nós corrigido para comparações múltiplas utilizando a taxa de falsa descoberta (FDR) [26]. Como nenhum dos valores de P permaneceu significativa após a correção FDR, foram adotados os seguintes critérios para selecionar candidatos promissores para validação e quantificação por qRT-PCR: (P Kruskall ≤0.001) ou (0,001 P Kruskall ≤0.01 e P linear ≤0.01 ) ou (0,01 P Kruskall 0,05 e P linear ≤0.001). No geral, 106 candidatos fora de cerca de 2.500 diferencialmente expressos transcritos do gene em relação à dose satisfeitos os critérios de selecção. Nós estreitou ainda mais esta lista para 41 genes que apresentaram os menores valores de P (P Kruskall 0,0005 ou P linear 0,0005) e pelo menos uma diferença de duas vezes (aumento /diminuição) na expressão de gene diferencial entre a maior em relação ao menor dosear categoria. Um adicional de 34 genes com P Kruskall 0.005 foram incluídos na validação porque não havia evidências na literatura para a amplificação do gene (número de cópias a alteração, a CNA 3) ou forte para cima /para baixo-regulação em outros estudos de cancro da tiróide em irradiado populações [19], [27]. Assim, foram seleccionados 75 genes de validação por meio de qRT-PCR (Tabela S1). Além disso, para avaliar a concordância entre microarray totalidade do seu genoma e medições qRT-PCR, corremos qRT-PCR (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha) para estes genes entre os 32 indivíduos incluídos na Fase I.
Fase II: RT-PCR quantitativo Análise
Para validar os nossos resultados de microarray, avaliamos a expressão gênica por qRT-PCR (ensaios TaqMan sonda iniciador) em 62 amostras de RNA emparelhadas dos restantes 31 indivíduos. Todos os produtos químicos de qRT-PCR, utilizando TaqMan química foram fornecidos por Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha. Devido a razões técnicas ensaios com sondas de primers indivíduo eram ou executado em um poço de 96 plataforma de qRT-PCR ou utilizando outra plataforma chamada matriz de baixa densidade (LDA). Vinte e quatro dos 75 genes foram medidos em duplicado, por causa do espaço disponível para as plataformas e a fim de melhorar a estatística. Uma alíquota de 0,75 ug de ARN de cada indivíduo foi transcrito de forma inversa utilizando um protocolo de duas etapas de PCR (kit de alta capacidade). 50 ul de ADNc (equivalente a cerca de 0,25 ug de ARN) foi misturado com 50 uL 2 x de RT-PCR Master Mix e pipetado para 2 8 de portas de enchimento do LDA. Cartões foram centrifugadas duas vezes (1200 rpm, 1 min, Multifuge3S-R, Heraeus, Alemanha), selado, e transferidos para o instrumento 7900 de qRT-PCR. O qRT-PCR foi realizada durante duas horas seguindo o protocolo de qRT-PCR para o formato de 384 poços LDA. química Taqman para a plataforma 96 poços foi usado de forma semelhante excepto que o volume por reaccional foi ajustada para 20 mL. Todos os procedimentos técnicos para qRT-PCR foram realizados de acordo com os procedimentos operacionais padrão implementados em nosso laboratório em 2008, quando o Instituto Bundeswehr de Radiobiologia ficou acreditado de acordo com a norma DIN EN ISO 9001/2008.
Corremos quatro amostras de RNA em triplicata em três ADLs diferentes para estabelecer um limite superior do intervalo linear-dinâmica dos ciclos de limite (CT). O limite superior do CT foi de 30, por isso, utilizados apenas valores 30 para análise. Os valores Ct foram normalizados em relação à expressão do gene mediana dos genes analisados. Esta abordagem demonstrou ser mais robusta comparada com o uso de rRNA 18S em cada duplicados manchado LDA para fins de normalização. O coeficiente médio de variação (CV) de medições de qRT-PCR foi 2,5% e 95% das medições em triplicado tinha CV 4% (Figura S1). Expressão diferencial de genes reflectindo dobra-diferenças mudança do número de cópias de ARN em tecido tumoral relativamente ao tecido normal correspondente (utilizado como calibrador) foi calculada subtraindo os valores de CT associados (delta-delta-CT-Abordagem).
confiabilidade e comparação de resultados por diferentes técnicas de fase I e fase II
Ambos os métodos medidos em 32 indivíduos incluídos na fase I revelou resultados comparáveis em 70,6% (Figura S2A). A média da expressão diferencial de genes de toda microarray genoma analisado na fase I indivíduos também foi altamente correlacionada com as medições qRT-PCR examinadas em fase II indivíduos (comparação de métodos diferentes em diferentes indivíduos, r
2 = 0,81, Figura S2B). Finalmente, as medições qRT-PCR de indivíduos incluídos e não incluídos na fase I também foram altamente correlacionados (r
2 = 0,98, Figura S3), apoiando a fiabilidade dos métodos
Fase II:. Análise Estatística de qRT-PCR
para confirmar os resultados da fase I, fase II análises usado apenas indivíduos (n = 31) não incluídos na fase I. Depois de um poder ou de transformação e /ou remoção de outliers log de genes selecionados, normalizada valores de TC de todos os genes eram normalmente distribuídos. Nós resíduos primeiro lugar, calculada de modelos lineares padrão que equipam os valores de expressão gênica
y
ajuste para a idade no momento da cirurgia da tireóide (3 categorias), sexo e Oblast ou estado de residência (Chernigov, Zhytomyr, Kiev), (1) onde μ é o nível global de expressão média. Em seguida, avaliou a relação entre a dose I-131 e expressão gênica em modelos lineares mistos com espécimes individuais como variável desfecho. Esses modelos representam correlações do tumor e medições de tecido normal tiradas no mesmo indivíduo e também acomodar medições em duplicado na mesma pessoa para o mesmo tipo de tecido.
Os modelos foram (2), onde r
ij indica o resíduo a partir do modelo (1) para sujeitos i (i = 1, 2, …, 31) no j
th amostra (j = 1, 2 para o tumor e tecido normal), e ε
ij é normalmente distribuído termo de erro que incorpora também as correlações a partir de medições repetidas sobre a mesma amostra. O efeito da dose em amostras de tumor é quantificada por dose de
tumor, e a dose de efeito no tecido normal é dada pela dose de
normal. Para avaliar as diferenças de efeito da dose por tipo de tecido, foi testada a hipótese nula H
0: Dose
tumor = dose de
normal. Mais uma vez, a I-131 dose foi utilizada de duas formas: em 3 grupos de dosagem independentes, o que leva a uma 2 grau de Wald valor de liberdade ensaio P for H
0, e utilizando os 3 grupos de dose ordenados, correspondendo a um um grau de teste de liberdade para a H
0.The gráficos mostram os resíduos e encostas doses ajustadas para tecidos normais e tumorais. Fold alterações na expressão associada com a dose, foram calculados como dois elevado à potência da diferença nas pistas, isto é, dois (dose
tumoral dose –
normal). Parâmetros para os modelos mistos foram estimadas usando o método da máxima verossimilhança restrita incorporada em PROC MIXED, SAS 9.1.3 [28].
Resultados
Características da PTC Cases
De 63 casos em nosso estudo, 56% eram do sexo feminino e 54% eram residentes da Região de Chernigov (Tabela 1). Idade no momento do acidente variou de 0 a 18 anos (média de 7,9 anos) e cânceres foram diagnosticados 12.5-21.6 anos após o acidente (média de 16,5 anos). I-131 dose de tireóide significa foi de 1,25 Gy, variando entre 0,008 e 8,6 Gy. Meios para as 3 categorias de dose foram de 0,11, 0,57, e 2,62 Gy, respectivamente. O subtipo histológico mais comum de PTC foi misturado (48%) e o restante consistia em folicular (25%), papilar clássico (19%), e (8%) subtipos sólidos. A média do diâmetro maior do tumor foi de 16,0 mm, com um intervalo de 6,0-45,0 mm.
Whole Genome Microarray
De 19,596 mRNAs do gene (41,079 transcrições) observado no conjunto microarray genoma, em média, 73,4% (intervalo de: 63,3% -91,0%) eram distinguíveis do fundo (expresso). O número total de transcritos de genes diferencialmente expressos em relação à dose de I-131 foi 2500; destes foram selecionados 75 genes candidatos para validação por qRT-PCR (Tabela S1)
qRT-PCR
de 75 genes testados, 15 desenvolveram há parcelas de amplificação, 5 produziram resultados em 10 indivíduos, e 6 apresentaram alta variabilidade causada provavelmente por um design sonda iniciador insuficiente fazendo estes 26 genes não informativo. Para 11 dos restantes 49 genes, a expressão relacionada com a dose em tecidos de tumor foi estatisticamente significativamente diferente da expressão relacionada com a dose em tecidos normais quando a dose foi usada como uma variável categórica ou ordinal nos modelos lineares mistos (Tabela 2). Associações significativas tanto para a dose categórica e ordinal foram encontrados para os 6 genes seguintes:
ACVR2A
,
CA12
,
CDK12
,
FAM38A
,
LMO3
,
MTA1
(Tabela 2). Três genes (
SLC19A1
,
SLC43A3
,
ZNF493
) tiveram diferenças estatisticamente significativas na expressão gênica diferencial para a dose categórica (2 grau de testes liberdade), mas não para ordinal doses, sugerindo relações dose-expressão não-linear; e dois genes (
AJAP1
,
GALNT7
) tiveram uma diferença estatisticamente significativa na relação dose-expressão para a dose ordinal, mas não para a dose categórica. Para
SLC43A3
as associações entre a expressão do gene e da dose eram restritas ao tecido tumoral (2 grau de teste de liberdade) e para
FAM38A (Página 2 graus de liberdade e 1 grau de liberdade testes),
SLC43A3
(2 grau de teste de liberdade),
LMO3
(1 grau de liberdade de teste),
MTA1
(1 grau de liberdade de teste) para o tecido normal (Figuras 2 e 3). Para
CA12
,
GALNT7
,
LMO3
, e
SLC43A3
existe uma boa separação na expressão entre tumor e tecido normal para cada dose bem como uma sugestão de tendências opostas com a dose. No entanto, na maioria dos casos, as diferenças significativas na resposta-dose por tipo de tecido pareceu ser devido à heterogeneidade dos padrões de dose-resposta na ausência de uma dose-resposta monótona em qualquer tipo de tecido.
Nota: as médias da expressão do gene residual após a remoção dos efeitos da idade, oblast, e o sexo é representada separadamente para o tecido normal (parte esquerda do gráfico) e o tecido do tumor (lado direito do gráfico) contra a média de três doses I-131 Categorias (0,11, 0,57, 2,62 Gy). Círculos com preenchimentos em cinza correspondem a valores médios de expressão de genes para o tecido normal e praças com preenchimentos negros correspondem a valores médios de expressão de genes para o tecido do tumor. As barras de erro representam intervalos de confiança de 95%. Os valores de p para a associação com a dose baseiam-se num teste de dois graus de liberdade e um 1 grau de liberdade teste de tendência, respectivamente, e transmitidos separadamente para o tecido normal e de tumor na parte inferior de cada painel.
Nota: média da expressão do gene residual após a remoção dos efeitos da idade, oblast, e o sexo é representada separadamente para o tecido normal (parte esquerda do gráfico) e o tecido do tumor (lado direito do gráfico) contra a média de três I-131 Categorias de dose (0,11, 0,57, 2,62 Gy). Círculos com preenchimentos em cinza correspondem a valores médios de expressão de genes para o tecido normal e praças com preenchimentos negros correspondem a valores médios de expressão de genes para o tecido do tumor. As barras de erro representam intervalos de confiança de 95%. Os valores de p para a associação com a dose baseiam-se num teste de dois graus de liberdade e um 1 grau de liberdade teste de tendência, respectivamente, e transmitidos separadamente para o tecido normal e de tumor na parte inferior de cada painel.
Discussão
Como a relação entre a irradiação em uma idade jovem e risco de câncer de tireóide é forte e extremamente consistente, este tumor fornece um excelente modelo para o estudo de carcinogênese radiação em seres humanos. Aqui, foram empregados baseadas na medição individuais I-131 doses estimadas para uma coorte de residentes ucranianos que estavam 18 anos na época do acidente de Chernobyl e RNA amostras de tecido congelado tireóide fresco fornecido pela CTB. Pela primeira vez, foram realizadas análises de expressão de genes dependente da dose na papilar carcinoma da tiróide em relação ao tecido normal da tiróide dos mesmos indivíduos em todo o genoma e confirmação da presença de 11 genes por qRT-PCR em amostras de ARN a partir de um conjunto separado de casos .
Vários pontos devem ser considerados ao comparar os nossos resultados com estudos anteriores. perfis de transcrição usando microarrays que permite a avaliação simultânea de milhares de transcritos do gene tem sido amplamente utilizada para obter insights sobre as alterações moleculares induzidas pela radiação [29] ionizante – [35]. No entanto, foi aplicada principalmente para vários tipos de células
In vitro
: culturas de células de queratinócitos humanos [31], células linfoblastóides [34], etc. Alguns estudos com modelos animais ou doentes tratados com radioterapia expressão do gene investigado logo após o
in vivo
irradiação [32], [33], [35]. Os genes que apresentaram alterações relacionadas com a dose após a exposição à radiação ionizante nestes estudos são mais susceptíveis de ser útil como endpoints e /ou biomarcadores de exposição biológicos precoces. A sua utilidade em termos de risco de cancro a longo prazo no ser humano continua a ser estabelecida. Havia também alguns estudos sobre os mecanismos que compararam a expressão do gene em cancros relacionados com a radiação com a expressão gênica em cancros esporádicos ou tecido normal [15] correspondente – [20], mas nenhuma destas estimativas de doses individuais envolvidas. Nosso estudo tem tentado colmatar esta lacuna. Usando os cálculos das doses individuais I-131, foi avaliada a dose em três categorias, sem hipóteses sobre a forma de dose-resposta e assumindo uma relação dose-resposta linear. Uma vez que diferentes mecanismos radiobiológicos pode ocorrer com o aumento das doses de radiação, incluindo a morte celular e a indução de rearranjos cromossómicos persistentes, que em si são conhecidos a seguir relação não linear [36], [37], uma relação curvilínea para a expressão diferencial de genes é plausível. Consistente com esta ideia, pelo menos, alguns genes (
SLC19A1
,
SLC43A3
,
ZNF493
) exibiu uma sugestão de não-linearidade na dose-resposta diferencial.
Os 11 genes que foram validadas em um caso independente criada por qRT-PCR em nosso estudo (Tabela S2) estão todos localizados em cromossomos diferentes e pertencem a diferentes vias biológicas, incluindo a adesão celular (
AJAP1
,
FAM38A
), metabolismo energético (
CA12
), transcrição ou metilação do DNA (
LMO3
,
ZNF493
,
MTA1
,
SLC19A1
), e crescimento /diferenciação (
CDK12
,
ACVR2A
). Todas estas vias foram implicados em respostas celulares à radiação ionizante [31], [34]. Mais importante ainda, quatro genes específicos (
CA12
,
GALNT7
,
LMO3
, e
SLC43A3)
foram previamente relatado por Stein et al. a ser desregulamentado exclusivamente nos cânceres pós-Chernobyl tireóide [19] e um gene (
FAM38A
) foi previamente identificadas pela Ory et al. Num estudo de cancro da tiróide após a irradiação por uma primeira cancro primário na infância [27]. Além de encontrar esses cinco genes diferencialmente expressos em um conjunto independente de casos irradiados, que forneceu provas de que sua expressão diferencial parece ser dependente da dose. Portanto, esses genes são candidatos particularmente atraente para novos estudos de validação com ênfase nos mecanismos da carcinogênese radiação. Nenhum dos genes promissores identificados em nosso estudo foi localizado em 7q11.22-11.23; ganho nesta região cromossômica foi relatado em jovens de início pós-Chernobyl PTCs [20].
Várias pistas surgiram do nosso estudo que poderia guiar futuros estudos de carcinogênese radiação. Dose-dependência para a expressão diferencial de genes detectados anos após a exposição provável representa um efeito tardio e /ou de longa duração de radiação. Um mecanismo pelo qual as alterações induzidas por radiação pode ser sustentado ao longo do tempo é através da herança de danos no ADN [38]. Tem sido relatado que a radiação ionizante é capaz de induzir um tipo específico de danos no ADN, nomeadamente copiar alterações numéricas (ANC) [39]. Numerosos estudos de cânceres esporádicos estabeleceram que CNAs pode moldar o transcriptomes tecidos e influência expressão gênica [40]. Portanto, se CNAs induzida por radiação são mantidos durante a tumorigênese, expressão diferencial de genes relacionado com a dose pode ser parcialmente atribuída à dose, mudanças no CNAs. Esta ideia encontra algum apoio em estudos que relataram sobreposição de CNAs e genes desregulados exclusivamente em tumores pós-Chernobyl [19] e sobre-expressão significativa de um gene entre vários examinadas no 7q11.22-7q11.23 região ganhou [20]. Outro mecanismo que emerge através do qual a radiação pode induzir e perpetuar mudanças de longa duração na expressão dos genes é a epigenética [41], [42]. As mudanças epigenéticas afetam indiretamente DNA, alterando a metilação do DNA, a remodelação da cromatina, e expressão microRNA (miRNA) e não a estrutura do DNA. A nossa descoberta de expressão dose-dependente de determinados genes (
FAM38A
,
SLC43A3
,
LMO3
,
MTA1
) no tecido normal da tireóide podem estar relacionados a mudanças epigenéticas induzidas por radiação. Além disso, as mudanças de expressão relacionados com a dose nos tecidos normais pode oferecer uma oportunidade adicional para avaliar a susceptibilidade individual à exposição à radiação [43], [44]. avaliação simultânea da expressão do gene, CNAs e mudanças epigenéticas podem fornecer pistas para os efeitos complexos da radiação e da carcinogênese radiação ionizante.
Nosso estudo tem várias vantagens únicas. Primeiro, usamos estimativas da dose de I-131 individuais com base em medições de radioatividade tomadas logo após o acidente [3], [6]. Em segundo lugar, casos surgiram dentro de uma coorte bem caracterizada selecionados para o cancro da tiróide de acordo com um protocolo padronizado e independentemente da dose, minimizando o impacto da confusão desmedida.