Abstract

gradientes elétricos estão presentes em muitos tecidos em desenvolvimento e regeneração e ao redor de tumores. Imitando campos elétricos endógena

in vitro

tem efeitos profundos sobre o comportamento de muitos tipos de células. Curiosamente, os tipos específicos de células migram cathodally, outros anodally e alguns polarizar com o seu eixo longo perpendicular ao vector eléctrico. Esses fenômenos marcantes são susceptíveis de ter

in vivo

relevância uma vez que um dos fatores determinantes durante a metástase do câncer é a capacidade de alternar entre a migração atraente e repulsivo em resposta a estímulos de orientação extracelulares. Apresentamos provas de que a linha celular de cancro cervical HeLa migra cathodally em um campo eléctrico de corrente directa de intensidade fisiológico, enquanto que a linha de células de cancro da próstata metastático fortemente PC-3-M migra anodally. Notavelmente, perturbação genética de proteína serina /treonina fosfatase-1 (PP1) e o seu regulador NIPP1 diminuir a migração direccional nestas linhas celulares. Por outro lado, a expressão induzível de NIPP1 ligado a resposta direccional de células HeLa a partir de catódica a ligeiramente anódica de uma maneira PP1-dependente. Notavelmente, a indução de uma holoenzima PP1 /NIPP1 hiperativo, deslocou ainda mais a migração direcional para o ânodo. Mostramos que a associação PP1 com NIPP1 regula positivamente a sinalização pela GTPase Cdc42 e demonstrar que a inibição farmacológica de Cdc42 em células com superexpressão NIPP1 recuperado migração catódica. Tomados em conjunto, que fornecem a primeira evidência para a regulação da migração celular direcional por NIPP1. Além disso, identificamos PP1 /NIPP1 como uma bússola molecular romance que controla dirigido a migração de células através de regulação positiva de sinalização Cdc42 e sugerir uma maneira pela qual PP1 /NIPP1 pode contribuir para as propriedades migratórias de células cancerosas

Citation.: Martin-Granados C, Prescott AR, Van Dessel N, Van Eynde A, Arocena M, Klaska IP, et al. (2012) um papel para PP1 /NIPP1 em Migração Direcção de células cancerosas humanas. PLoS ONE 7 (7): e40769. doi: 10.1371 /journal.pone.0040769

editor: Maddy Parsons, do Kings College London, Reino Unido

Recebido: 24 Abril de 2012; Aceito: 13 de junho de 2012; Publicação: 16 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Martin-Granados et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por uma Wellcome Trust conceder 079.518 /z /06 /z para MDL e pela confiança Desenvolvimento da Universidade de Aberdeen para JVF. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a migração celular desempenha um papel fundamental em muitos processos tais como o desenvolvimento embrionário e reparação de feridas e mal-regulados respostas de sinalização para pistas migratórias podem induzir patologias como a metástase de tumor, inflamação e epilepsia [1] – [4]. Epiteliais, endoteliais, células neuronais e imunes, entre outros, são expostos a uma variedade de estímulos que a migração directa de células. campos eléctricos em adição aos sinais químicos mais amplamente reconhecidos, tais como factores de crescimento e citocinas, gerados endogenamente (EF) de natureza iónica foram medidos em torno de tecidos lesionados, locais de inflamação e tumores [5] – [10]. Estes sinais eléctricos podem actuar como pistas de orientação direccional durante a cicatrização de feridas, desenvolvimento embrionário e tumorigénese [11], por conseguinte, decifrar os mecanismos moleculares subjacentes a respostas celulares a EF é de grande importância. Aplicando uma corrente constante directa (DC) EF para células e tecidos in

in vitro

imita os efeitos de um EF endógeno [12] e esta identificou um número de receptores da superfície celular, proteínas de sinalização e de fosforilação de segundos mensageiros que transduzir sinais eléctricos. Por exemplo, o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e integrinas estão entre os primeiros sensores dos sinais eléctricos em vários tipos de células. EGFR translocar dentro do plano da bicamada lipídica para acumular no catódica, com o lado apical das células. Para queratinócitos e células epiteliais da córnea isto ocorre dentro de 5-10 min de exposição EF [13], [14]. Como consequência, torna-se polarizado de sinalização de EGF, fazendo com que uma maior activação catódica de ERK1 /2, a jusante da polimerização catódica F-actina e migração dirigida [13] – [15]. Achados semelhantes foram relatados para sustentar electrotaxis catódica de células progenitoras neurais embrionárias e adultas [16]. Além disso, as integrinas α5 e α5ß1 redistribuir e cathodally agregado em fibroblastos migrar cathodally, como faz β1 integrina nas células epiteliais [17], [18]. Além disso, a depleção de integrina SS4 ou a adição de um anticorpo anti-subunidade de integrina β1 suprime a migração dirigida EF-[18], [19].

O papel da proteína tirosina (Tyr) na migração de quinases tem sido bem estudados, ao passo que a contribuição das fosfatases de proteína começa a ser apreciado só recentemente [20]. De facto, a única fosfatase conhecido por estar envolvido em electrotaxis é o “homólogo de fosfatase tensina suprimida no cromossoma dez ‘lipídica fosfatase (PTEN) [7].

proteína serina /treonina (Ser /Thr) da fosfatase-1 (PP1) é uma das enzimas mais altamente conservadas conhecidas e desempenha um papel central numa variedade de processos celulares, incluindo a síntese de proteínas, de splicing de ARN, a progressão do ciclo celular e metabolismo do glicogénio [21], [22]. Uma grande variedade de subunidades reguladoras associa-se com a subunidade catalítica PP1 para determinar a sua localização celular e especificidade para o substrato, mediando o controlo destes diversos processos fisiológicos através Holoenzimas PP1 [22] – [24]. NIPP1 (inibidor nuclear de proteína fosfatase 1) é uma proteína altamente conservada e ubiquamente expresso que foi inicialmente caracterizado como um inibidor de PP1 [25] – [27]. NIPP1 serve como uma espécie de proteína de andaime em torno do qual uma variedade de proteínas, tais como as fosfatases, quinases, factores de splicing e modificadores de cromatina recolher funcionalmente. NIPP1 contém dois locais principais PP1-interacção que residem nos domínios centrais e C-terminal, entre os quais os resíduos de aminoácidos 200-203, que constituem um local de ancoragem PP1 RVxF-tipo. Evidências mais recentes sugerem que os efeitos de NIPP1 sobre PP1 são substrato dependente: é potentemente bloqueia a desfosforilação de diversos substratos a PP1, mas promove a desfosforilação de substratos que são recrutados através do seu domínio forkhead associados (FHA) [28]. Curiosamente, a PP1 obrigado a sobre-expresso de tipo selvagem NIPP1 (WT-NIPP1) é altamente fosforilada em Thr-320, uma marca que inactiva a PP1, ao passo que a PP1 ligado a uma proteína NIPP1 truncada terminal-C (ôc-NIPP1) é menos fosforilada em Thr -320, o que é indicativo de uma holoenzima PP1 /NIPP1 hiperativo [28].

um papel para PP1 como um regulador da polaridade e migração celular está começando a emergir. PP1 interage com várias proteínas que regulam o citosqueleto de actina e contribui para a formação de saliências celulares e aderências [24]. Além disso, um relatório bastante recente identificou um papel funcional para a PP1 no controlo da migração de células do nervo entérico [29]. Aqui, nós investigamos se a PP1 e níveis NIPP1 regulam a motilidade e a migração direccional de a linha de células HeLa derivadas de cancro do colo do útero. Além disso, exploramos a contribuição de PP1 NIPP1 associada à migração direcional usando células que foram manipuladas para expressar indutivamente WT-NIPP1, NIPP1 C-terminal truncado (Sc-NIPP1) HeLa Tet-Off (HTO) ou um mutante PP1 de ligação de NIPP1 (mNIPP1) [28], [30]. Utilizou-se um campo eléctrico DC (EF) como um sinal de orientação facilmente tratável conhecido para controlar a migração celular dirigida de células normais e tumorais [31], [32]. Aqui, demonstramos que os níveis PP1 e NIPP1 são necessários para motilidade aleatória óptimo das células HeLa individuais e para a migração dirigida em resposta a um EF DC. Confirmamos que os níveis NIPP1 são necessários para a migração celular direcional testando electrotaxis do altamente metastático linha de células de câncer de próstata derivado PC-3-M. Além disso, demonstra-se que a ligação de PP1 para funções NIPP1 como uma bússola que controla a direcção em que as células migram através da regulação da expressão de receptores de integrina e de factor de crescimento, actividade de GTPase e Cdc42. Estes resultados identificam um papel funcional para NIPP1 na migração celular e descobrir PP1 /NIPP1 como a primeira proteína complexo fosfatase Ser /Tre controlando a resposta direccional de células de pistas de orientação elétricos.

Resultados

PP1 e NIPP1 são necessários para Random e migração direcional de HeLa e PC-3-M células em resposta a Electrical Orientação Cues

um estudo muito recente mostrou que o tratamento de células da crista neural entéricas com ácido ocadaico, um inibidor da fosfatases 1 e 2A, induz saliências celulares sem direção e movimentos celulares aleatórios [29]. Assim, foi investigado um papel potencial para a PP1 em regular a migração direccional de células epiteliais do colo do útero HeLa de carcinoma derivadas de Tet-Off (HTO), em resposta a sinais eléctricos de orientação. Para isso, foi testado o efeito de siRNAs previamente validados alvo todos os três PP1 isoformas sobre a motilidade aleatória de células individuais e sobre a resposta migratória dirigida de células a um EF aplicada (electrotaxis) [33]. Os níveis de proteína PP1 foram reduzidos em 85% após 48 h de transfeco (Fig. 1a). Na ausência de um EF, o controlo e com knockdown células PP1 (KD) migrou aleatoriamente (Fig. 1B). Quando um EF DC foi aplicado, 82% ± 5 As células de ARNsi de controlo migrado cathodally (vermelho, para a direita) (Figura 1B;. Ver vídeo S1). EF tratamento aumentou a distância migrada, a velocidade de migração e o direcionamento das células ARNsi de controlo (Fig. 1C). electrotaxis No entanto, o esgotamento PP1 deficientes completamente, 57% ± 2 de células PP1 siRNA migraram cathodally (vermelho, à direita) e 43% ± 2 anodally (preto, à esquerda) (Fig 1B, C;. ver o vídeo S2). Além disso, observou-se que as células empobrecido em PP1 exibida menos saliências celulares e mais fibras de estresse em comparação com células de controlo siRNA (Fig. 1D). Em particular, a perda de PP1 diminuição da formação filopódios em células não tratadas e EF-tratados (Fig. 1E).

A. O tratamento de células HeLa parentais Tet-Off (HTO) com siRNA esgota fortemente os níveis de PP1 48 h após a transfecção. níveis PP1 endógenos foram visualizadas com anticorpos PP1 que reconhecem todas as isoformas. Lote B. diagramas mostram que a perda de PP1 prejudica a capacidade das células para migrar em direcção ao cátodo. Cada linha representa a trajectória de migração de uma única célula. O ponto de partida para cada faixa migração celular está na origem. faixas celulares com posições finais à direita aparecem em vermelho ( “C”, cátodo) e aqueles à esquerda aparecem em preto ( “A”, ânodo). células não tratadas-EF foram ensaiadas como controlos. As células de controlo siRNA fortemente migrar em direcção ao cátodo; PP1 siRNA células tratadas são incapazes de migrar em resposta a um EF DC. Escalas de mostrar a distância migrada em um. esgotamento C. PP1 reduz fortemente a distância migrada, velocidade e direcionamento em resposta a EF fisiológico DC. As barras de erro são S.E.M.

p valores Compra de diferenças significativas na distância, velocidade e direcionamento são mostrados. D. Localização da PP1 e distribuição de filamentos de actina-no controle e células PP1 empobrecido tratados com EF DC endógeno. PP1 níveis endógenos foram visualizadas com anticorpos que reconhecem a PP1 todas as isoformas (verde) e de actina polimerizada foi detectada usando rodamina faloidina (vermelho). Os núcleos foram coradas com DAPI (azul). As setas marcam as células com uma forte diminuição dos níveis da PP1, que se correlacionam com defeitos na formação de actina saliências ricos. Imagens representativas são mostrados. barra de escala é de 50 mm. E. Os números de células com filopios foram quantificados por contagem de 100 células. As barras de erro são S.E.M.

p valores Compra de diferenças significativas são mostrados. Imagens mostram um detalhe de protuberâncias celulares em células de controlo e de ARNip PP1 siRNA. Setas marcam numerosos filopódios em células de controlo e zonas de contorno com uma grande falta de filopódios nas bordas de células em células PP1 siRNA.

Além disso, nós investigamos um possível papel regulador para o interator NIPP1 PP1 na formação saliências de actina e na migração aleatória e direccional de células HTO. Em primeiro lugar, examinamos se NIPP1 é necessária para a migração, testando o efeito de siRNAs previamente validados alvo NIPP1 [34]. Os níveis de proteína NIPP1 foram reduzidos em 80% após 48 h de transfeco (FIG. 2A). Na ausência de um EF, o controlo e com células NIPP1 knockdown (KD) migrou aleatoriamente (Fig. 2B). Na presença de uma EF, as células de controlo mostraram forte migração catódica; 87% ± 4 de células siRNA controle migraram cathodally (vermelho, à direita) e 13% ± 4 anodally (preto, à esquerda) (Fig 2B;. Ver o vídeo S3). No entanto, as células NIPP1 KD mostrou uma migração muito embotada catódica, 57% ± 3 de células NIPP1 siRNA migraram cathodally (vermelho, direita) e 43% ± 3 anodally (preto, à esquerda) (Fig. 2B, C e ver vídeo S4). Além disso, na ausência de um EF uma diminuição de duas vezes na velocidade e, por conseguinte, a distância de migração celular foi observada em células NIPP1 siRNA em comparação com ARNsi de controlo células tratadas (Fig. 2C). A velocidade reduzida e a distância de migração causada pela perda de NIPP1 era ainda maior em células expostas a uma FE que mostrou uma diminuição de quatro vezes na migração de células e sobre uma diminuição de duas vezes na velocidade de migração em comparação com células de ARNsi de controlo tratado com EF (Fig. 2C). Consistente com relatórios anteriores, o DC EF promovido polimerização de actina e formação de saliências ricos em actina celular em células de controlo HTO (fig. 2D). No entanto, as células tinham menos NIPP1 KD saliências de células (Fig. 2D). Em particular, a capacidade para formar filopios em células NIPP1 KD foi gravemente comprometida em células não tratadas e EF-tratados (Fig. 2E).

. O tratamento de células HeLa parentais Tet-Off (HTO) com siRNA esgota fortemente níveis NIPP1 48 h após a transfecção. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por SDS /PAGE e imunotransferência. As bandas correspondentes a todas as isoformas foram detectadas PP1 e GAPDH foi usada como controlo de carga. Lote B. diagramas mostram que a perda de NIPP1 prejudica a capacidade das células para migrar em direcção ao cátodo. As células de controlo siRNA fortemente migrar em direcção ao cátodo; NIPP1 siRNA células tratadas mostram uma resposta catódica muito reduzida. Escalas de mostrar a distância migrada em um. As escalas são diferentes entre os diagramas de forma a incluir as faixas de todas as células testadas. esgotamento C. NIPP1 reduz fortemente a distância migrada, velocidade e direcionamento em resposta a EF fisiológico DC. Os dados são de pelo menos três experiências. As barras de erro são S.E.M.

p valores Compra de diferenças significativas na distância, velocidade e direcionamento são mostrados. D. Localização da NIPP1 e distribuição de filamentos de actina-no controle e células NIPP1 empobrecido tratados com EF DC endógeno. NIPP1 níveis endógenos foram reconhecidos com um anticorpo de coelho anti-anticorpo NIPP1 (verde) e de actina polimerizada foi detectada usando rodamina faloidina (vermelho). Os núcleos são corados com DAPI (azul). NIPP1 localiza no núcleo em células EF-tratados e não tratados e os seus níveis são esgotados por siRNA. barra de escala é de 50 mm. E. Os números de células com filopios foram quantificados por contagem de 100 células. As barras de erro são S.E.M.

p valores Compra de diferenças significativas são mostrados. Imagens mostram um detalhe de protuberâncias celulares em células de controlo e de ARNip NIPP1si ARN. Setas marcam numerosos filopódios em células de controlo e zonas de contorno com uma grande falta de filopódios nas bordas de células em células NIPP1 siRNA.

Para validar ainda mais nossos dados e para descartar possíveis efeitos fora do alvo da siRNA NIPP1 segmentação também examinaram a resposta electrotactic da linha humana altamente metastático de células de câncer de próstata, PC-3-M, empobrecido em níveis NIPP1 via expressão de um shRNA alvo NIPP1 após o tratamento IPTG. NIPP1 níveis foram reduzidos em cerca de 70%, após 5 dias de tratamento com IPTG (Fig. 3A). Nós mostramos pela primeira vez que as células de PC-3-M exibir uma resposta electrotactic muito robusto para o ânodo, tal como indicado por um direcionamento fortemente negativa de -0,9 (Fig. 3B, C e ver o video S5) e que a perda de NIPP1 reduz fortemente a resposta direccional destas células para um EF DC (Fig. 3B, C e ver o video S6).

. O tratamento de células PC-3-M com IPTG induz a depleção NIPP1. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por SDS /PAGE e imunotransferência. As bandas correspondentes às isoformas da PP1 foram detectados e GAPDH foi usada como controlo de carga. Lote B. diagramas mostram que a perda de NIPP1 prejudica a capacidade de células PC-3-M para migrar anodally. trajetórias de migração foram monitorados durante três horas. O ponto de partida para cada faixa migração celular está na origem. faixas celulares com posições finais à direita aparecem em vermelho e aqueles à esquerda aparecem em preto. Cátodo é marcado como “C” e o ânodo como “A” quando a EF CC é aplicada às células. Controle mexidos células PC-3-M migrar fortemente anodally (valor directedness negativo); células que expressam shRNA segmentação NIPP1 mostram uma resposta muito reduzida anódica. Escalas de mostrar a distância migrada em um. As escalas são diferentes entre os diagramas de forma a incluir as faixas de todas as células testadas. esgotamento C. NIPP1 distância migrado e direcionamento reduziu fortemente em resposta a EF fisiológico DC. Os dados são de pelo menos três experiências. As barras de erro são S.E.M.

p valores Compra de diferenças significativas na distância, velocidade e direcionamento são mostrados.

Em conjunto, estes dados mostram que tanto a PP1 e NIPP1 são necessários para a resposta migratória direccional de células HeLa e PC -3-M células a um EF DC.

PP1 /NIPP1 controles direcionais migração celular

em seguida, teve uma abordagem inversa e explorou o efeito da superexpressão de NIPP1 e sua ligação a PP1 em EF-induzida migração direccional. Para isso, foi utilizado previamente caracterizado linhas de células HeLa de Tet-Off (HTO), que expressam três variantes NIPP1 diferentes na ausência de doxiciclina (Fig. 4A) [28], [30]. Três dias após a remoção do meio de doxiciclina, a expressão das variantes NIPP1 foi avaliada por Western blot (Fig. 4B). Estas variantes incluídos FLAG marcada com WT-NIPP1, que está associado com (parcialmente) inactivo PP1, C-terminalmente entalhado FLAG-NIPP1 (ôc-NIPP1) que é complexado com a PP1 constitutivamente activa e um mutante de ponto (mNIPP1) que carece de um funcional motif RVxF tipo PP1 vinculativo e, portanto, pode ligar-se apenas marginalmente para PP1 (Fig. 4A).

a. Dos desenhos animados de NIPP1 endógeno e os diferentes NIPP1 marcado com FLAG variantes expressa após a remoção doxiciclina em linhas de células HeLa Tet-Off (HTO). Todas as três variantes NIPP1 tem um domínio associado forkhead (FHA). A sequência de consenso PP1 vinculativo, RVTF em W.T-NIPP1 foi mutado para RATA na variante de FLAG-mNIPP1. O (ID) de domínio C-terminal de auto-inibidora não está incluído na bandeira proteína etiquetada ôc-NIPP1, resultando na expressão de um constitutivamente activa holoenzima PP1 /NIPP1. B. Expressão de variantes NIPP1 confirmada por transferência de Western, após remoção da doxiciclina. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por SDS /PAGE e imunotransferência. As bandas correspondentes às isoformas da PP1 foram detectados e GAPDH foi usada como controlo de carga. expressão C. NIPP1 e localização nas células HTO foi confirmada pelo TPI em células HTO EF-tratados e não tratados. anticorpo anti-FLAG e phalloidin rodamina foram usados ​​para detectar as variantes NIPP1 Bandeira-marcado (verde) e F-actina (vermelho). Os núcleos foram corados com DAPI. NIPP1 overexpressed localiza no núcleo em células EF-tratados e não tratados. barra de escala é de 50 mm. diagramas de plotagem mostram que um EF de força fisiológica (200 mV /mm) induziu respostas migratórias distintas nas células HTO expressando diferentes variantes NIPP1. células HTO EF-tratada são mostradas como controlos. trajetórias de migração foram monitorados durante três horas na ausência e presença de EF. A posição de cada célula a 0 h é posicionado na origem (0, 0). Células cuja posição final é para a direita são de cor vermelha e aqueles à esquerda aparecem em preto. Cátodo é marcado como “C” e o ânodo é marcado como “A” quando DC EF é aplicado às células. Escalas de mostrar a distância migrada em um. Note-se que as escalas são diferentes entre os diagramas de forma a incluir as faixas de todas as células testadas.

Localização das três variantes NIPP1 diferentes foi analisado por imunocitoquímica. Semelhante a NIPP1 endógena, FLAG-marcado W.T- e Sc-NIPP1 foram localizados fortemente para o núcleo em células EF-tratados e não tratados (Fig. 4C, imagens de células). coloração perinuclear do mutante de NIPP1 (mNIPP1) PP1 de ligação também pode ser observado com a etiqueta FLAG-(Fig. 4C, imagens de células).

Em seguida, testamos se a associação de PP1 com NIPP1 afeta electrotaxis de células HTO . Sem a EF, a migração celular foi orientada aleatoriamente para todos os tipos de células (Fig. 4C, “não EF” parcelas). No entanto, as células que expressam variantes HTO NIPP1 marcado com FLAG apresentou um conjunto de comportamentos diferentes em um EF. 72% ± 3 de células HTO pais migraram cathodally (à direita) e 28% ± 3 anodally (à esquerda) e exibiu um direcionamento de 0,27 ± 0,05 (Fig 4C;. Ver o vídeo S7). Superexpressão de W.T-NIPP1 mudou a resposta catódica a ligeiramente anodal, com apenas 35% ± 12 das células migrando cathodally e 65% ± 12 anodally e um direcionamento de -0,12 ± 0,05 (Fig 4C;. Ver o vídeo S8). Além disso, a sobre-expressão de ôc-NIPP1 induziu uma forte mudança na resposta direccional. Apenas 16% ± 5 de células migraram cathodally com um notável 84% ± 5 de células que migram anodally dando uma invertida fortemente direcionamento de -0,55 ± 0,04 (Fig 4C;. Ver o vídeo S9). Curiosamente, a sobre-expressão de mNIPP1 não afectou a migração catódica e as células teve um comportamento semelhante às células parentais HTO; 80% ± 13 migraram cathodally e 20% ± 13 anodally, e exibido um forte direcionamento cathodal de 0,52 ± 0,1 (Fig 4C;. Ver o vídeo S10).

Estes resultados mostram que o controle da migração direcional por NIPP1 depende em sua associação com a PP1. Quando NIPP1 foi sobre-expresso e capaz de se ligar a PP1, a migração catódica ligeiramente deslocado para anódica. Além disso, a indução de um constitutivamente ativa PP1 /NIPP1 holoenzyme induziu uma resposta anodal ainda mais forte. No entanto, o mutante PP1 vinculativo de NIPP1 causado migração catódica, semelhantes às células parentais.

PP1 /NIPP1 Controles centrossoma Posicionamento durante a migração

A correlação entre a posição do centrossoma e a direção de migração celular foi observado em vários tipos de células [35]. Em muitos casos, o centrossoma está localizado por trás do bordo de ataque e em frente do núcleo. Portanto, o próximo destinada a corroboram os resultados obtidos a partir da medição da resposta direccional de células que sobre-expressam variantes HTO NIPP1 marcada com Flag por explorar se houve uma correlação entre a posição do centrossoma e na direcção do movimento celular nas células HTO. Em células HTO (sem EF) centrossomas foram posicionados aleatoriamente (Fig. 5). Centrossomas das células parentais em um cathodally polarizada EF (Índice de polarização (PI) = 0,46 (ver Procedimentos Experimentais); A Fig. 5). No entanto, as células que sobre-expressam W.T-NIPP1 exibida quase a mesma distribuição de centrossomas para o cátodo e o ânodo (PI = -0,09; Fig. 5). Perturbação de induzida por EF polarização centrosomal catódica em células que sobre-expressam WT-NIPP1 era dependente da ligação PP1 para NIPP1 porque as células que sobre-expressam mNIPP1 polarizada seus centrossomas para o cátodo (PI = 0,77), assim como as células parentais (PI = 0,46; Fig. 5) . Curiosamente, a indução de um constitutivamente ativa holoenzyme PP1 /NIPP1 induzida tanto uma forte polarização anodal de centrossomas (PI = -0,23) e migração anodal forte de células (Fig. 4C, 5). Estes resultados demonstram que o posicionamento do centrossoma durante a migração espelha a migração direccional de células HeLa. Mais significativamente, esses dados indicam que a associação de PP1 com NIPP1 controla o interruptor para anodal polarização centrossoma e anodal migração, provavelmente refletindo o engajamento de máquinas do citoesqueleto semelhante em ambos os processos.

A. Um EF DC polariza centrossomas para o cátodo em células HTO parentais como visto por contagem das células em 5 regiões, topo (T), para a direita (cátodo em células tratadas com EF), de fundo (B), para a esquerda (ânodo em células tratadas com EF ) e no centro do núcleo (marcado como um ponto branco). células parentais e células B. mNIPP1 posicionar os centrossomas cathodally em um EF, ao passo que a sobre-expressão de W.T-NIPP1 perturba polarização catódica centrosomal e sobre-expressão de ôc-NIPP1 desloca polarização catódica de centrossomas para anódica. 100 células foram contadas em cada caso e os resultados são expressos em percentagens.

A inibição da Cdc42 Inverte a induzida por NIPP1 migração anódica e Centrosomal Polarização

Os efeitos da NIPP1 sobre a formação de filopios (Fig. 2), a migração celular direccional (Fig. 4C) e um posicionamento do centrossoma em EF fisiológico (Fig. 5) são dependentes da PP1. Curiosamente, uma análise ao nível do genoma das células HTO descoberto que NIPP1 também afecta a expressão de numerosos genes de um modo dependente-PP1 [30]. Está bem estabelecido que a GTPase Cdc42 controla a extensão filopoidais e posicionamento do centrossoma na migração de células [36] – [38], e que a migração direccional de células epiteliais da córnea em resposta a um EF CC é controlado por um interruptor de Cdc42 /Rho [39 ]. Colectivamente, estes dados levam a hipótese atraente que a polarização anódica induzida por NIPP1 é mediada por sinalização através Cdc42. Para testar esta noção, analisou-se em primeiro lugar na lista de genes que são significativamente regulados positivamente pela sobreexpressão de WT-NIPP1 ou ôc-NIPP1, mas não por mNIPP1, tudo em comparação com a linha parental HTO células [30] e dados não publicados (ver Materiais e métodos). Curiosamente, verificou-se 24 genes que estão envolvidos na dinâmica do citoesqueleto, as interacções célula-matriz e a via de Cdc42, e são activados por sobre-expressão de WT-NIPP1 ou ôc-NIPP1, mas não por mNIPP1 (Tabela 1).

em seguida, foi medida a actividade de GTPase Cdc42 em células HTO de um EF fisiológico e verificado se a actividade medida foi inibida pelo inibidor da GTPase Cdc42 ML141 específica e célula-permeável (CID2950007) [40]. Descobrimos que um EF DC induz um pequeno mas significativo aumento da actividade de GTPase Cdc42 em todas as células HTO (Figura 6A;. P 0,001), e que o tratamento destas células com 10 uM ML141 completamente abolida actividade de GTPase Cdc42 (valores de p comparando amostras em na ausência e na presença de ML141 foram em todos os casos 0,01). Curiosamente, a inibição da Cdc42 não afetou a migração catódica de células parentais (directedness = 0,42 ± 0,06; A Fig. 6B; veja vídeo S11). No entanto, a reversão da migração EF-dirigido por superexpressão de W.T-NIPP1 foi recuperado por inibição da Cdc42 (directedness = 0,29 ± 0,05; A Fig. 6B; veja vídeo S12). Da mesma forma, EF expuseram células Sc-NIPP1, que migram anodally, perderam esta resposta quando Cdc42 foi inibida com o ML141 e até mesmo exibidos uma resposta catódica moderada (directedness = 0,2 ± 0,1; A Fig. 6B; veja vídeo S13). EF-estimulação destas células (+ ML141) promoveu a formação de fibras de stress (dados não apresentados) e induziu espalhamento e agitando em conjunto com vesiculação do citoesqueleto de actina da célula (dados não mostrados). Em muitos casos, onde foi observada forte ruffling, as células tornou-se independente. Um aumento na população sub-G1 (células mortas) nas células pré-tratadas ôc-NIPP1-ML141 (determinado por citometria de fluxo) pode, possivelmente, explicar a baixa migração e descolamento observado nestas células. Em contraste, ML141 não causar um defeito na viabilidade das, mNIPP1 e W.T-NIPP1 células parentais (Fig. S1).

A. Efeito de ML141 na actividade de GTPase Cdc42 em células não estimuladas cultivadas em meio completo e em células estimuladas HTO EF-sobre-expressam as variantes de proteína FLAG-NIPP1. Níveis de Cdc42-GTP determinados por G-lisa, em W.T-NIPP1, ôc-NIPP1 e mRATA células parentais na ausência ou na presença de DC EF e em células pré-tratadas com 10? M de ML141 antes da estimulação eléctrica.

p

valores dos pais para W.T-NIPP1 e dos pais para Sc-NIPP1 em meio completo foram de 0,1 e 0,01, respectivamente;

valores p

comparando amostras na ausência e na presença de ML141 foram em todos os casos 0,01. B. inibição Cdc42 resgata polarização catódica e isso correlaciona-se com o posicionamento do centrossoma. Directedness valores para a migração de células tratadas com EF incubadas com ML141. inibição Cdc42 resgata o direcionamento celular positiva diminuiu W.T-NIPP1 superexpressão. O valor directedness fortemente negativa apresentada pelas células Sc-NIPP1 torna-se mais próximo de 0 quando as células são pré-tratados com inibidor Cdc42. Para valores direcionamento de simplificação na ausência de EF do parental, W.T-NIPP1, Sc-NIPP1 e mNIPP1 com e sem ML141 não foram incluídos no diagrama. Estes eram, sem ML141, -0,07 ± 0,04; 0,05 ± 0,09; -0,08 ± 0,05 e -0,01 ± 0,04, respectivamente; com ML141 foram -0,07 ± 0,04; 0,09 ± 0,05; -0,07 ± 0,05 e -0,01 ± 0,04, respectivamente. Na ausência de valores de FE foram em todos os casos muito perto de 0 e as diferenças entre as quatro linhas não foram estatisticamente significativos em qualquer dos casos. Os dados foram quantificados a partir de pelo menos três experiências. As barras de erro são S.E.M.

p valores Compra de diferenças significativas no direcionamento são mostrados. Índice de polarização de centrossomas calculada conforme descrito em materiais e métodos. índice de polarização de células WT-NIPP1 e ôc-NIPP1 torna-se semelhante ao índice de polarização de células parentais quando as células são tratadas com o inibidor de Cdc42 ML141.

Inibição de Cdc42 GTPases em células que sobre-expressa, mas incapaz de NIPP1 vincular PP1 (mNIPP1) não afectou a sua migração forte catódica (directedness = 0,57 ± 0,03; a Fig. 6B; veja vídeo S14). Estes resultados mostram claramente que o interruptor no sentido da migração induzida por EF causada pela sobre-expressão de NIPP1 depende da associação de NIPP1 com PP1 e que é mediada pela actividade de GTPase Cdc42.

Investigou-se também se a inibição de Cdc42 HTO em células pode recuperar a polarização de centrossomas para o cátodo em que as células WT-NIPP1 e ôc-NIPP1. Nós demonstramos que a inibição Cdc42 aumentou a PI centrosomal de células parentais para níveis comparáveis ​​com aqueles observados na mNIPP1 células (PI = 0,76 em ambos os casos), recuperado a polarização centrosomal catódica em WT-NIPP1 células (PI = 0,59) e, mais notavelmente, induzida forte polarização de centrossomas para o cátodo em células ôc-NIPP1 (PI = 0,62) (Fig. 6B). Estes resultados indicam que a induzida por EF centrosomal polarização para o cátodo é de GTPase Cdc42-independente. No entanto, anodal polarização da centrossomas observadas em células WT-NIPP1 e Sc-NIPP1 requer tanto sua associação com a PP1 e da atividade GTPase Cdc42.

Discussão

Especificamente, descobrimos que tanto PP1 e NIPP1 positivamente