Sumário

As expressões alteradas de proteínas claudina foram relatados durante a tumorigênese do câncer colorretal. No entanto, os mecanismos moleculares que regulam estes eventos neste tipo de cancro são mal compreendidos. Aqui, nós mostramos que o fator de crescimento epidérmico (EGF) aumenta a expressão de claudin-3 em células HT-29 de adenocarcinoma colorectal humanos. Este aumento foi relacionado ao aumento da migração celular ea formação de colônias dependentes de ancoragem e independente de ancoragem. Nós ainda mostrou que as vias de ERK1 /2 e PI3K-Akt foram envolvidos na regulação destes efeitos, porque a inibição farmacológica específica bloqueada esses eventos. A manipulação genética de claudina-1 e claudina-3 em células HT-29 mostraram que a superexpressão da claudina-1 resultou numa diminuição da migração celular; No entanto, a migração não foi alterada em células que sobre-expressos claudina-3. Além disso, a sobre-expressão da claudina-3, mas não a da claudina-1, aumentou o fluxo paracelular relacionados com junção apertado de macromoléculas. Além disso, um aumento da formação de colónias de ancoragem e dependente de ancoragem-independentes foram observadas em células que sobre-expressos claudina-3, enquanto que tal alteração foi observada quando claudina-1 foi sobre-expresso. Finalmente, claudina-3 silenciamento sozinho apesar induzir aumentar a proliferação, e a formação de colónias e independentes de anchoragedependent, foi capaz de impedir o aumento potencial de malignidade induzida por EGF. Em conclusão, os nossos resultados mostram um novo papel para claudin 3-sobre-expressão na promoção do potencial maligno das células de câncer colorretal, que é potencialmente regulados pelas ERK1 /2 e PI3K-Akt percursos activado-EGF

Citation.: de Souza WF, Fortunato-Miranda N, Robbs BK, de Araujo WM, de-Freitas-Junior JC, Bastos LG, et al. (2013) Claudina-3 superexpressão aumenta o potencial maligno de células de câncer colorretal: Papéis de ERK1 /2 e PI3K-Akt como moduladores da sinalização de EGFR. PLoS ONE 8 (9): e74994. doi: 10.1371 /journal.pone.0074994

editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, República da Coreia

Recebido: 03 de janeiro de 2013; Aceito: 09 de agosto de 2013; Publicação: 19 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 de Souza et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi patrocinado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Ministério da Saúde – Brasil, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado de Rio de Janeiro (FAPERJ) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Câncer (573806 /2008-0 e 170,026 /2008). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

junções apertadas (TJS) são componentes estruturais importantes do complexo juncional apical do epitélio, onde regulam vários processos intracelulares, tais como o estabelecimento da polaridade apical-basal e o fluxo de substâncias através do espaço intercelular [1 ]. Claudinas são as principais proteínas que regulam as funções de TJs e são classificados como uma família de proteínas de membrana integrais Tetraspan, que atualmente compreende 27 membros [2]. Uma miríade de doenças, incluindo câncer, têm sido associados a alterações na expressão, estabilidade e localização subcelular de familiares claudin [3], [4], [5], [6]. No entanto, os mecanismos moleculares precisos que regulam a expressão e função destas proteínas, particularmente no cancro colo-rectal, são mal compreendidos.

O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) é dimerizada e activado pelo seu ligando extracelular, EGF, o que desencadeia uma cascata de sinalização que conduz à activação de vias de citoplasmáticos tais como MAPK e PI3K-Akt [7], [8]; estas vias são conhecidas por modular a proliferação, a diferenciação e a resistência à morte da célula [9], [10]. Estudos têm demonstrado que estas vias estão envolvidas em eventos relacionados com os processos cancerígenos em epidérmico do rato e células de cancro gástrico humano [11], [12], bem como no aumento do potencial migratório e invasiva durante a transição epitelial-mesenquimal no ovário humano células [13]. vias de sinalização mediada por EGF, também são conhecidos por desempenhar papéis importantes na organização de TJs, em que regulam a expressão e localização de proteínas claudina. Por exemplo, o EGF foi relatado para induzir a sobre-regulação de claudinas 1, 3 e 4, e a regulação negativa induzida pelo EGF da claudina-2 aumenta a força da barreira intercelular, tal como determinado por um aumento da resistência eléctrica transepitelial (TER) em MDCK- células II [14], [15]. No entanto, utilizando o mesmo modelo (células MDCK), outros autores relataram que a regulação negativa da claudina-2 induziu maior motilidade celular, mesmo com o aumento da TER [16]. Recentemente, o EGFR /ERK /c-Fos via foi mostrado para regular claudina-2, um aumento que foi correlacionado com um aumento da permeabilidade intercelular e a migração celular em células de adenocarcinoma do pulmão humano [17], [18].

informações Pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares subjacentes às alterações na expressão claudin que estão associados com tumorigênese colorretal. Temos demonstrado que pacientes com câncer colorretal apresentaram aumento dos níveis de claudinas 1, 3 e 4, que alterou a função de barreira da TJs [19] expressão. Estudos recentes têm relatado um papel controverso para claudin-1 durante a carcinogênese colorretal; aumento da claudina-1 de expressão foi observada em lesões metastáticas hepáticas de cancro colorectal, mas esta expressão foi diminuída nas metástases de nódulos linfáticos de carcinomas do cólon [20], [21]. Além disso, os ERK1 /2 e PI3K foram relatados para mediar aumentos na expressão de claudina-2 induzida por EGF em células de cancro do cólon; este evento foi acompanhado por aumentos na proliferação, crescimento e tumor de crescimento independente de ancoragem

in vivo

[22]. Portanto, é importante compreender os mecanismos moleculares que regulam a expressão de outros membros da família claudina e as implicações da superexpressão claudina na progressão do cancro colo-rectal.

No presente estudo, mostra-se que o aumento da expressão mediada por EGF de claudina-3 está relacionado com o aumento da migração de células e a formação de colónias dependentes de ancoragem e independentes de ancoragem em células de HT-29 adenocarcinoma colorrectal humano. Além disso, mostra-se que estes eventos foram mediados pela PI3K-Akt ERK1 /2 e. Demonstramos ainda que a sobre-expressão forçada de claudina-3 em células HT-29 por manipulação genética aumentou o potencial maligno, enquanto que a sobre-expressão de claudina-1 diminuiu a migração celular. Mais importante ainda, nossos resultados revelam que claudin-3 desempenha um papel de promotor do tumor, quando a sua expressão está desequilibrado e implicam as vias de sinalização ERK1 /2 e PI3K-Akt como moduladores da progressão relacionadas com a regulação positiva claudin-3 tumor em células de câncer colorretal.

Materiais e Métodos

Materiais

anti-claudin-1 (Cat. nº. 51-9000) e anti-claudin-3 (Cat. nº. 34-1700) Os anticorpos policlonais de coelho, bem como um anticorpo monoclonal de murganho anti-tubulina α (Cat. no. 32-2500) foram obtidos da Invitrogen Inc. (Carlsbad, CA, EUA). Anti-Akt (Cat. No. 4691) e anti-P-Akt (Cat. No. 4058) anticorpos monoclonais de coelho, bem como um anticorpo monoclonal de ratinho anti-ERK (Cat. No. 9107) de anticorpo foram adquiridos a partir de Cell Signaling (Beverly , MA, EUA). O anticorpo monoclonal anti-uvomorulin /E-caderina de rato (Cat. No. U3254) e anti-P-ERK1 /2 monoclonal de rato (Cat. No. M8159) anticorpos foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Um anticorpo monoclonal de ratinho anti-caderina-E (clone 36, Cat. No. 610182) foi adquirida a BD Biosciences (San Diego, CA, EUA). Rábano anti-coelho conjugado com peroxidase e anti-IgG de rato foram adquiridos a partir de GE Healthcare (Chalfont St Giles, Reino Unido). Alex-fluor-488 anti-coelho (Cat. Nº. A11008) e Alex-fluor-546 anti-rato (Cat. Nº. A11010) foram obtidos de Molecular Probes (Eugene, Oregon, EUA). O 2- (4-morfolinil) -8-f enil-1 (4H) -benzopiran-4-ona LY294002 (inibidor de PI3K) (Cat. No. L9908) foi obtido a partir de Sigma-Aldrich, o 2- (2-amino- 3-metoxifenil) -4H-1-benzopiran-4-ona PD98059 (inibidor de MEK1) (Cat. no. 9900) foi obtido a partir de Cell Signaling, e EGF (Cat. no. PHG0311) foi adquirido de Invitrogen Inc.

Cultura celular

as linhas celulares humanas de adenocarcinoma colorectal Caco-2 (Cat. no. HTB-37) e HT-29 (Cat. no. HTB-38), bem como o embrionário humano

linha celular de rim de HEK-293 (Cat. no. CRL-1573) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Caco-2 As células apresentam-se com um fenótipo diferenciado na fase de monocamada e possuem uma baixa invasivo e metastático potencial [23], [24], [25], enquanto as células HT-29 apresentam-se com um fenótipo indiferenciada e um elevado potencial tumorigénico [ ,,,0],26]. As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que foi suplementado com soro a 10% inactivado pelo calor fetal de bovino (FBS), penicilina G (60 mg /L) e estreptomicina (100 mg /L) a 37 ° C em numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 /ar. Para fins experimentais, as células foram semeadas em placas de cultura ou em lamelas de vidro.

O tratamento com EGF e farmacológico Inibidores

As culturas de células foram tratadas com 20 ng /mL de EGF, uma concentração que ter usado em um estudo anterior [27]. Os efeitos do tratamento com EGF em claudina-1 e expressão claudina-3 em células Caco-2 e células HT-29 foram avaliadas em células cultivadas em meio DMEM suplementado com FBS a 10% depois de 6, 24 e 48 h. Para a inibição farmacológica, as células foram privadas de soro durante a noite e inibidores selectivos foram adicionados às culturas de células 1 h antes de tratamento com o EGF para inibir a actividade de quinase intrínseca. As células foram então incubadas com meio de cultura fresco suplementado com FBS a 10% contendo EGF e inibidores selectivos, que foram mantidas durante todo o experimento. Os inibidores foram diluídos em DMSO e armazenado a -20 ° C. Cada solução concentrada foi diluída imediatamente antes de cada experiência para se obterem concentrações finais de 50 ^ M (PD98059) e 8 uM (LY294002).

O plasmídeo construção, produção de retrovírus recombinantes e infecção de células HT-29

As construções que contêm claudin-1 e claudin-3 cDNA murino foram previamente descritos [28], [29] e foram gentilmente cedidas pelo Dr. Mikio Furuse (Divisão de Biologia celular, Departamento de Fisiologia e Biologia celular, Universidade de Kobe , Japão). Os cADNs contidos nestas construções foram subclonados no plasmídeo de esqueleto retroviral pBABE-puro para gerar o pBABE-Cld1 (BamH1-Xho1) e construções de pBABE-Cld3 (Bgl2-Xho1). As células HEK-293 foram usadas como células de empacotamento retroviral, após co-transfecção transitória por precipitação com fosfato de cálcio durante 24 h com o vector de empacotamento retroviral PCL-Ampho (N ° Cat 10046P;.. Imgenex, CA, EUA) e uma das seguintes construções : pBABE-Cld1, pBABE-Cld3 ou vectores retrovirais vazios. O sobrenadante isento de células, que continha o vírus foi colhido 48 h após a transfecção, misturado 1:01 com meio fresco, suplementado com 8 ug /ml de polibreno (N ° Cat 107689;.. Sigma-Aldrich), e imediatamente utilizado para a cisão infecção (2 × 45 min a 400 x g à temperatura ambiente) de 5 × 10

4 células HT-29. As células infectadas foram incubadas a 37 ° C durante um adicional de 24 h, tratadas com tripsina e utilizado como indicado.

HT-29

Cld1 e HT-29

Cld3 celular Construção

HT -29

Cld1, HT-29

Cld3 ou vazio-vector (-29 HT

pBABE), as células foram geradas por transdução de células do tipo selvagem HT-29 com pBABE-Cld1, pBABE-Cld3 ou vetores vazios e selecionando as células transduzidas com sucesso com 7,5 mg /mL de puromicina (Cat não P8833;.. Sigma-Aldrich) durante pelo menos 5 dias. Os clones foram isolados e a sobre-expressão de claudinas 1 e 3 foi confirmada por imunotransferência.

Claudina-3 silenciamento

células HT-29 foram transfectadas com um controlo não segmentação siARN (siARN negativo controle # 1;. Cat sem 4.390.844;. Ambion, TX, EUA), precipitação como um controle para efeitos não-específicos de sequência, ou uma sequência de siRNA específico claudin-3-(Silencer predesigned siRNA CLDN3, gato não SI03101623..; Qiagen, MD, EUA). As células (10

6) foram ressuspensas em 100 ul de tampão de ME1 [30], gentilmente fornecidas pelo Dr. Martin Bonamino (inca, Brasil), contendo quer o duplex mexidos ou específico de CLDN3. As células foram transferidas de uma 0,2 centímetros cuvete (N ° Cat MIR 50121;.. Mirus Biotech, Madison, WI, EUA) e electroporadas utilizando o programa de W-17 do sistema de electroporação Lonza Nucleofector II por células HT-29 (Lonza Group Ltd , Basileia, Suíça). As células foram então suavemente ressuspensas em DMEM suplementado com FBS a 10% a uma concentração final de 25 siARN ou 45 nM. A atenuação da expressão CLDN3 foi verificada por imunotransferência de lisados ​​celulares e de sondagem-los com um anticorpo contra claudina-3.

Extracção Celular e imunotransferência

Caco-2 (3 × 10

5) e HT-29 (2 × 10

5) As células foram semeadas em placas de 6 cavidades e incubadas até confluência. Os molayers células foram então raspadas e homogeneizado em tampão de lise (1% Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,2% de SDS, NaCl 150 mM, EDTA a 2 mM, HEPES 10 mM, pH 7,3) que continha NaF 20 mM, 1 ortovanadato mM e um cocktail de inibidor de protease (1:100 diluição) para se obter lisados ​​de células totais. Os lisados ​​homogeneizados foram centrifugados a 10000 × g durante 10 min a 4 ° C. Os sobrenadantes foram recolhidos e armazenados a -20 ° C para análise posterior. Quantidades iguais de proteína (30 pg /pista) por amostra foram separados por electroforese de SDS-PAGE em géis de 13% e transferidas para folhas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas e incubadas com anticorpos primários contra claudina-1 (1:500), claudina-3 (2 ug /mL), ou α-tubulina (1:1000). Após a lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpos anti-coelho ou anti-ratinho conjugados com peroxidase de rábano. As proteínas foram visualizadas utilizando um kit de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido). As bandas foram quantificados de acordo com as suas densidades ópticas utilizando Labworks 4.6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Imunofluorescência

Caco-2 (2 × 10

5) e HT -29 (10

5) As células foram semeadas em lamelas de vidro em placas de 24 cavidades e incubadas até confluência. As monocamadas de células foram subsequentemente lavadas com PBS e fixadas com metanol durante 10 min a -20 ° C. Em seguida, as células foram bloqueadas com 0,2% de BSA em PBS durante 1 h e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100. As células foram incubadas durante a noite com anti-claudina-1, anti-claudina-3 (01:40), anti-caderina-E (1:300) anticorpos, seguido de 1 h as incubações com anticorpos secundários conjugados com Alexa 488 (apropriadas 1:500). Após as incubações, as células foram montados usando n-propil-galato para permitir a visualização tanto com um microscópio axio Observe.Z1 que foi equipado com um HRc AxioCam e o software de processamento de imagem digital AxioVision lançamento 4,8 (Carl Zeiss Inc., Jena, Alemanha) ou um microscópio confocal de varrimento laser

FV10i-o

, a partir do qual as imagens foram analisadas utilizando o software FV10-ASW (Olympus, Tóquio, Japão).

cicatrização Ensaio

células HT-29 (2 × 10

5) foram semeadas em placas de 6 cavidades e incubadas até confluência. Para realizar ensaios para cicatrização de feridas, as monocamadas celulares foram feridos manualmente raspando com pontas de pipeta. Depois de diferentes tratamentos, as células foram autorizados a migrar para as zonas desnudadas e fotografada imediatamente após o ferimento (0 h) e às 6 h ou 24 h após o ferimento. A distância entre as duas bordas de uma área desnudada foi quantificado em triplicado e repetidas três vezes, independentemente. A migração é representada como a percentagem de migração de células e representadas num gráfico.

Ensaios de Proliferação de Células

Os números relativos de células viáveis ​​foram determinadas utilizando violeta de cristal ou corantes azul de tripano. O método de cristal violeta foi conduzida como descrito previamente [31]. Resumidamente, as células de HT-29 (10

4) foram semeadas em placas de 96 poços e incubadas em meio de cultura com ou sem EGF durante 24 e 48 h antes da fixação de etanol durante 10 min. Uma solução de violeta de cristal (0,05% de violeta de cristal e 20% de metanol) foi adicionado às células durante 10 min. As células foram lavadas e solubilizadas com metanol. As absorvâncias a 595 nm foram medidos com um espectros Max 190 espectrofotómetro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Para o método de azul de tripano, as células transduzidas HT-29 (2 × 10

5) foram semeadas em placas de 6 poços e incubadas em meio de cultura durante 6 h. Após as incubações, as células foram tratadas com tripsina (0,05% de tripsina /EDTA a 0,02% em solução de PBS) e contados com um microscópio axio Observe.Z1 (Zeiss) com um hemacitómetro câmara de Neubauer e tripano corante azul (0,4% de azul de tripano em solução de PBS) .

Anchorage-dependente e Formação de colónias independente de

para ensaios de formação de colónia dependentes de ancoragem, as células HT-29 foram semeadas a uma densidade baixa (2,5 × 10

2) para 4 h em placas de 12 poços e tratadas com EGF durante 5 dias ou deixada sem tratamento. Após 5 dias, as células foram fixadas com etanol durante 10 minutos e coradas com uma solução de violeta de cristal (0,05% de violeta de cristal e 20% de metanol). As células foram lavadas duas vezes com água e solubilizou-se com metanol. As colónias foram contadas quer com um microscópio axio Observer.Z1 (Zeiss) ou as absorvâncias foram medidas a 595 nm com um espectrofotómetro de espectros Max190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA).

Para colónia independente de ancoragem , ensaios de formação de placas de 12 poços foram revestidos com meio de crescimento suplementado com FBS a 10% contendo 0,6% de agarose, para evitar a adesão de células ao substrato. As células HT-29 (5 × 10

2), em seguida, foram novamente suspensas em meio de cultura contendo FBS a 10% e mais 0,3% de agarose, semeadas no substrato descrito anteriormente e submetidos a diferentes tratamentos durante 11 dias (tal como indicado). No ponto final, as colónias foram contadas com um Axio Observer.Z1 microscópio (Zeiss).

Medição da resistência eléctrica transepitelial (TER)

funcionalidade TJ também foi avaliada através da medição do TER para avaliar o fluxo paracelular a iões, tal como anteriormente descrito por Contreras e colaboradores [32], com ligeiras modificações. Resumidamente, transduzidas células HT-29 (10

4) foram semeadas a confluência em cultura de células de membrana de poliéster Transwell insere com um 0,4 um de tamanho de poro e 0,33 cm

área de superfície de 2 (N ° Cat CLS3470;.. Sigma-Aldrich ). Os valores de TER foram determinadas utilizando um sistema de Millicel-ERS (Millipore Co., Billirica, MA, EUA). Os valores representados no gráfico foram normalizados para a zona da inserção e o valor em branco (uma solução de banho incubadas com inserção sem células) foi subtraída. O TER foi assim medida em Ohms × cm

2 (Ω · cm

2).

Macromoléculas permeabilidade Ensaio

Para testar ainda mais a funcionalidade TJ, a permeabilidade macromolecular foi avaliada utilizando um ensaio de permeabilidade de anticorpo, tal como descrito anteriormente [33]. Transduzidas células HT-29 (10

5) foram semeadas em lamelas de vidro em placas de 24 cavidades e incubadas até confluência. As monocamadas de células foram então fixadas em paraformaldeído a 2% e incubadas com anticorpo anti-uvomorulin /E-caderina durante 2 h sob condições nonpermeabilization, seguido por 1 hora de incubação com o anticorpo secundário respectivo a 37 ° C. A coloração uvomorulin /E-caderina foi visualizado com um Axio Observer.Z1 microscópio (Zeiss).

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada com um one-way ANOVA, seguido de envio postal de Dunnett -Testes ou o t-teste, utilizando o software GraphPad Prism 4.02 (GraphPad software, San Diego, CA, EUA). Os gráficos representam a média ± o erro padrão (SEM) de três experiências independentes. Uma diferença de p . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

EGF aumenta os níveis de proteína de Claudina-3 em células HT-29, mas não em células Caco-2

Inicialmente, examinámos alterações nos níveis de expressão de claudina-1 e claudina-3 após tratamento com EGF em duas linhas de células de adenocarcinoma colorectal, Caco-2 e HT-29, que diferem no estado de diferenciação e o potencial metastático. Observou-se que o EGF-tratamento não alterou significativamente os níveis de proteína de claudinas 1 e 3 em células Caco-2 e HT-29 células em um ponto de tempo precoce (6 h) (Fig. 1A). Seguindo vezes EGF-tratamento prolongado (24 e 48 h), os níveis de proteína de claudinas 1 e 3 não se alteraram significativamente em células Caco-2. No entanto, as células de HT-29 mostraram um aumento significativamente os níveis de claudina-3, enquanto os níveis de claudina-1 permaneceu inalterado no mesmo ponto de tempo do tratamento (Fig. 1B). Além disso, a análise de imunof luorescência indicou que o tratamento com EGF durante 48 h não alterar os padrões de distribuição de claudinas 1 e 3 em células Caco-2 (Fig. 2A). No entanto, um padrão de coloração descontínua e a acumulação pontual destas proteínas foram observadas em algumas regiões de contacto célula-célula de células HT-29 (Fig. 2B). Uma vez que o EGF não alterou os níveis de proteína de claudinas 1 e 3 em células Caco-2, nós examinamos se a EGF pode activar as vias efectoras nesta linha celular. Verificou-se que tratamento com EGF aumentou os níveis de fosforilação de ERK1 /2 (Fig. S1), um efector de sinalização conhecido desencadeada por EGF. Estes resultados indicam que o tratamento com o EGF regula diferencialmente claudinas 1 e 3, dependendo do contexto celular. Com base nestes resultados, optamos por células HT-29, para posterior funcional analisa devido às alterações observadas na expressão e distribuição subcelular das proteínas claudina após o tratamento EGF.

Caco-2 cultivadas e células HT-29 foram tratadas com EGF (20 ng /mL) durante 6 h (a), 24 h e 48 h (B). Após tratamento com o EGF, os lisados ​​celulares totais foram recolhidos e analisados ​​por imunotransf erência para a expressão de claudinas 1 e 3. α-tubulina foi utilizada como um controlo de carga. Os números representam a razão entre a densidade óptica de EGF-tratado com células não tratadas normalizados pela α-tubulina.

Claudin

; Cale. α

tubulina

; α-banheira.

monocamadas de células foram cultivadas em lamelas de vidro e processada para análise de imunofluorescência de claudina-1 e distribuição claudin-3 após o tratamento EGF (48 h). As células coradas foram vistos com confocal

FV10i-O ou

microscópios Axio Observe.Z1. (A) As células Caco-2

; bar: 5

um. (B) As células HT-29; bar: 10 um.

Setas

; acumulação pontual da claudinas.

Ctr

; controle.

EGF tratamento aumenta a formação de Migração e Anchorage-dependente e Anchorage-Independent Colônia de células HT-29

Temos demonstrado que o aumento da migração celular está relacionada a mecanismos de tumor progressão em células cancerosas [10], [31] e que o tratamento com EGF aumentou a migração de células Caco-2 [34]. Para determinar se o EGF alterou a migração de células HT-29, foram realizados ensaios para cicatrização de feridas após tratamento com EGF. Observou-se que depois de 24 h de tratamento com o EGF, o potencial de migração de células foi aumentado em comparação com a de células não tratadas (Fig. 3A e 3B). Para investigar mais se o fechamento da ferida era de fato devido ao status de migração e não proliferação celular, verificou-se o número relativo de células viáveis. A Figura 3C mostra que a proliferação de células não foi alterado nas células tratadas com EGF quando comparado com as células não tratadas no mesmo ponto de tempo que foi observado no ensaio de cicatrização da ferida. Um aumento na proliferação das células foi observada apenas após 48 h de tratamento com EGF.

(A, B) células HT-29 foram cultivadas em placas de 6 poços até à confluência. Em seguida, as monocamadas celulares foram feridos e tratados com EGF, e a migração de células nestas regiões foi monitorizado durante 24 h. (C) As células HT-29 foram semeadas em placas de 96 poços e tratadas com EGF nos tempos indicados, e a proliferação foi quantificada utilizando a técnica de violeta de cristal. O gráfico de barras mostra a razão da absorvância do EGF-tratado com células não tratadas (controlo). Barra: 100 fim. As barras de erro indicam as médias ± SEM (n = 3); ** P 0,01, *** p 0,001, como determinado pelo teste t

Sabe-se que a transformação das células é um parâmetro importante para avaliar o potencial maligno, que pode também ser avaliada pela. capacidade das células para formarem colónias dependentes de ancoragem e independentes de ancoragem [35], [36]. Neste contexto, foi avaliado o potencial de transformação da célula do EGF em células HT-29. Como observado na Figura 4A, as células tratadas com EGF exibido um maior número de colónias dependentes de ancoragem, quando comparado com células não tratadas. Além disso, o tratamento EGF aumentou o número de colónias independentes de ancoragem e as dimensões das colónias em comparação com células de controlo (Fig. 4B). Em conjunto, estes dados mostram que o EGF aumenta a eventos relacionados com o potencial maligno de células de cancro colorrectal indiferenciadas.

(A) Fotografias representativas de colónias dependentes de ancoragem, que foram coradas com violeta de cristal, após tratamento com EGF. Os gráficos de barras que mostram a relação de vezes de aumento na formação de focos de células não tratadas tratados com EGF (controlo). (B) Imagens representativas de colónias independentes de ancoragem que mostram as diferenças de dimensão entre as células tratadas com EGF e não tratados. Os gráficos de barras que mostram a relação de vezes de aumento na formação de colónias de EGF-tratado com células não tratadas (controlo). Barra: 10 um. As barras de erro indicam as médias ± SEM (n = 3); * P 0,05, ** p 0,01, conforme determinado pelo teste t

ERK1 /2 e aumenta PI3K-Akt sinalização Mediate EGF-induzida em migração celular ea formação de colónias de células HT-29.

EGF é bem conhecido para activar as vias de sinalização, tais como ERK1 /2 e PI3K-Akt, para regular a proliferação celular, sobrevivência e diferenciação em vários modelos de células de tumor. Portanto, analisou se essas vias também pode modular os eventos induzida por EGF subjacentes que tínhamos aqui observados, incluindo o aumento da expressão da claudina-3. Como pode ser visto na figura 5A, o tratamento EGF aumentou os níveis de fosforilação de ERK1 /2 e AKT, indicando a activação destas proteínas. A seguir, farmacologicamente inibiu a PI3K-Akt com PD98059 e LY294002 MEK1 /2-ERK1 /2 e, respectivamente, para verificar se estas vias pode modular o aumento induzido por EGF na claudina-3 níveis de expressão em células de HT-29. Observou-se que o tratamento com estes inibidores, isoladamente ou em combinação impediu o aumento induzido por EGF em níveis de expressão claudina-3 (Fig. 5B). Além disso, observou-se que a inibição das vias de sinalização ERK1 /2 e PI3K-Akt impediu o aumento induzido por EGF na migração de células (Fig. 5C). Nas figuras 5D e 5E, que ainda verificado que a inibição de ambas vias impediu os aumentos induzidos por EGF no número de colónias dependentes de ancoragem e independentes de ancoragem. Interessantemente, o pré-tratamento com o inibidor de PI3K sozinho e em combinação com o inibidor de ERK1 /2 diminuiu a formação de colónias dependentes de ancoragem. Em conjunto, estes dados suportam fortemente a noção de que as vias de ERK1 /2 e PI3K-Akt também estão envolvidas no aumento da claudina-3 níveis de expressão, concomitante com o aumento do potencial maligno que é induzida por EGF em células de HT-29.

células HT-29 (a) foram semeadas e tratadas com EGF durante 5, 15, 30 e 60 min, após o que os lisados ​​celulares totais foram recolhidos e analisados ​​por imunotransferência por P-ERK1 /2, ERK1 /2, P- Akt, Akt e. (B) As células foram cultivadas e pré-tratadas durante 1 h com os inibidores indicados antes da incubação com EGF durante 48 h. Os lisados ​​celulares totais foram recolhidos e analisados ​​por imunotransferência por claudina-3. ácido a-tubulina foi utilizada como um controlo de carga. Os números representam a razão entre a densidade óptica da tratados com células não tratadas normalizados pela proteína total ou α-tubulina. Imagens representativas de cicatrização de feridas (C), a formação de colónias dependentes de ancoragem (D) e ensaios de formação de colónias independente de ancoragem (E). As células foram pré-tratadas com os inibidores, como indicado, e os ensaios foram realizados como descrito nos Materiais e Métodos. Para o ensaio dependente de ancoragem, o gráfico de barras que mostra a relação entre as vezes de aumento na formação de focos de tratados com células não tratadas (controlo). Para o ensaio independente da ancoragem, os gráficos de barras que mostram a relação entre o aumento de vezes na formação de colónias de tratados com células não tratadas (controlo). Barra: 200 fim. As barras de erro indicam as médias ± SEM (n = 3); ** P . 0,01 conforme determinado por um ANOVA

Forçado superexpressão de Claudina-1 e Claudina-3 aumenta o TER, mas Claudina-3 superexpressão Facilita o fluxo paracelular a macromoléculas

com base nos resultados descritos acima, postularam que os níveis de papéis importantes na progressão do cancro colo-rectal claudina-1 e claudina-3 jogo de expressão diferencial. Para testar ainda mais esta hipótese, foram forçados a expressão de ADNc de claudina-1 e claudina-3 em células HT-29, e as células resultantes foram denominados HT-29

CLD-1 e HT-29

CLD-3 , respectivamente. A análise de imunotransferência confirmaram robusta claudina-1 (HT-29

CLD-1) e claudina-3 (HT-29

CLD-3) a sobre-expressão em comparação com as células que foram transduzidas com o vector vazio (HT-29

pBABE) (Fig. 6A). Além disso, as células que sobre-expressos estas proteínas mostraram aumento da coloração citoplasmática; No entanto, a etiquetagem foi mantida a contactos célula-célula (Fig. 6B).

(A) As células foram cultivadas e os lisados ​​celulares totais foram recolhidos e analisados ​​por imunotransf erência para a expressão da claudina-1 e claudin- 3. Os números representam a razão entre a densidade óptica da claudina-transduzido para as células transduzidas por vetores vazios normalizados pela α-tubulina. (B) As células foram cultivadas em lamelas de vidro e processada sob condições de permeabilização de análise de imunofluorescência de claudina-1 e distribuição claudina-3; bar: 5 mm. (C) As células foram cultivadas em inserções Transwell e o TER foi medido usando o sistema de Millicel-ERS. Os gráficos de barras que mostram os valores de TER normalizado para a área da pastilha com o valor em branco foram subtraídos. (D) As células foram cultivadas em lamelas de vidro e processadas para imunof luorescência em condições não-permeabilização para avaliar a permeabilidade macromolecular utilizando o anticorpo anti-uvomorulin /E-caderina; bar: 10 um. (E) As células foram cultivadas em lamelas de vidro e processada sob condições de permeabilização para análise de imunofluorescência de distribuição de E-caderina. As células coradas foram vistos com

FV10i-O

microscópio confocal. As barras de erro indicam as médias ± SEM (n = 3); α-tubulina foi utilizada como um controlo de carga.