Abstract

A capecitabina (PAC) é um 5-FU pró-droga aprovada para o tratamento de vários tipos de câncer e é utilizado em combinação com gemcitabina (GEM) no tratamento de doentes com adenocarcinoma do pâncreas (PDAC). No entanto, os dados pré-clínicos limitados dos efeitos de PAC em PDAC estão disponíveis para suportar o uso da combinação GEMCAP na clínica. Por isso, foi investigada a farmacocinética e da eficácia de PAC como um agente único primeiro e, em seguida, em combinação com a gema para avaliar a utilidade da terapia GEMCAP na clínica. Usando um modelo de PDAC espontânea ocorre em Kras

G12D; p53

R172H; Pdx1-Cre (CPK) ratos e enxertos subcutâneos de uma linha celular derivada-KPC PDAC (K8484), mostrámos que a CAP alcançaram concentrações tumorais (~ 25 uM) de 5-FU em ambos os modelos, como um agente único, e a sobrevivência induzida semelhante ao GEM em camundongos KPC, o que sugere uma eficácia similar.

In vitro

estudos realizados em K8484 células, bem como em linhas de células pancreáticas humanas mostraram um efeito aditivo da combinação GEMCAP no entanto, aumento da toxicidade

in vivo

e nenhum benefício de uma combinação GEMCAP tolerável foi identificado no modelo de aloenxerto quando comparado com a GEM sozinho. O nosso trabalho fornece evidência pré-clínica de entrega de 5-FU para os tumores e eficácia anti-tumor, após a administração oral de PAC que era semelhante para efeitos de GEM. No entanto, a combinação GEMCAP não melhorar o índice terapêutico em comparação com somente GEM. Estes dados sugerem que PAC pode ser considerado como uma alternativa para GEM no futuro, racionalmente concebidos, estratégias de tratamento combinação para o câncer de pâncreas avançado

Citation:. Courtin A, Richards FM, Bapiro TE, Bramhall JL, Neesse A, Cozinhe N, et al. (2013) Anti-Tumor Eficácia da Capecitabina em um modelo de camundongo geneticamente modificada de cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (6): e67330. doi: 10.1371 /journal.pone.0067330

editor: Hana algul, Technische Universität München, Alemanha |

Recebido: 06 de fevereiro de 2013; Aceito: 16 de maio de 2013; Publicação: 28 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Courtin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Cancer Research UK (www.cancerresearchuk.org) através do Programa Grant C96 /A8333 para DJ e através de financiamento CRUK Cambridge Institute Líder do Grupo de DJ e DT. Este trabalho também foi apoiado pela Universidade de Cambridge, o Shing Foundation Li Ka e por uma doação de caridade para a Universidade de Cambridge da Hutchison Whampoa Ltd.-O trabalho também foi apoiado pelo financiamento do Centro de Investigação NIHR Cambridge Biomédica (www.nihr .ac.uk). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. DJ recebeu apoio aos ensaios clínicos da Roche e tem também servido em um conselho editorial para o site Xeloda (Capecitabina). Este estudo foi financiado em parte pela Hutchison Whampoa Ltd-na forma de uma doação de caridade ao Cambridge Institute CRUK que contribuiu para o salário de DT. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais. Todos os outros autores declaram que não existem interesses conflitantes.

Introdução

pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos países industrializados. taxa de sobrevivência de cinco anos geral é inferior a 5% [1]. O alto grau de mortalidade de PDAC é atribuível à falta de métodos de detecção precoce e os pobres eficácia das terapias existentes. Gemcitabina (GEM) é o tratamento padrão, mas o tempo de sobrevivência mediano permanece apenas 5-7 meses em pacientes com doença avançada [2]. Portanto, as estratégias de tratamento mais eficazes são necessárias

capecitabina. (Xeloda®; Hoffmann-La Roche) é um carbamato de fluoropirimidina administrada por via oral, metabolizados no fígado e tumor por carboxilesterases e da citidina-desaminase para 5′-desoxi-5-fluorocitidina (5′-DFCR) e 5′-desoxi-5-fluorouridina (5′-DFUR), respectivamente. O passo final da activação de capecitabina (CAP), a conversão do 5′-DFUR para citotóxico 5-f luorouracilo (5-FU), é mediada pela timidina-fosforilase [3] – [5], que é expresso em mais altamente neoplásica de tecido normal, tornando PAC mais específica do tumor do que o 5-FU [5], [6]. eficácia anti-tumor de PAC foi demonstrado em diversos estudos utilizando modelos de xenoenxerto de cancro humano da mama, do cólon, gástrico, do colo do útero, ovário da bexiga e cancro da próstata (ver para revisão [7]), mas apenas um estudo foi avaliado num modelo de pâncreas [8] e este foi em um tipo selvagem xenoenxerto de células de câncer pancreático atípica KRAS. Na clínica, CAP é aprovado pelo FDA como terapia de primeira linha agente único em doentes com cancro colorectal metastático e para o cancro da mama metastático como um agente único ou em combinação com docetaxel, após falha de quimioterapia anterior com base antracilina. Em pacientes com cancro do pâncreas completamente ressecada, tem sido demonstrado que combinado de bolus intravenosa de 5-fluorouracilo e ácido folínico (FUFA) é uma terapia adjuvante activo e o uso de FUFA é equivalente a GEM quando a sobrevivência global é o ponto final de [9 ], [10]. Em PDAC avançada, particularmente, no Reino Unido, PAC foi substituído FUFA e é utilizado em combinação com a gema (GEMCAP), com base nos resultados da meta-análise, realizada por Heinemann e ai. mostrando um benefício modesto, mas significativo, da sobrevivência de GEM combinação com uma fluoropirimidina e especialmente com PAC [2]. Um estudo clínico recente confirmou o benefício de GEMCAP em pacientes não selecionados com PDAC avançada [11].

Tendo em conta os dados pré-clínicos limitados usando PAC em PDAC,

in vivo foram realizados estudos

para avaliar PAC num modelo de ratinho geneticamente manipulado da doença. Kras

G12D; p53

R172H; (KPC) ratinhos Cre Pdx1 condicionalmente expressar mutantes endógena Kras e p53 alelos em células pancreáticas [12] e desenvolver tumores pancreáticos, que recapitulam os aspectos fisiopatológicos e as características moleculares do PDAC humana [13]. Nós também utilizado um aloenxerto de uma linha de células do cancro do pâncreas (K8484) isolado a partir de uma PDAC KPC. Os estudos farmacocinéticos e eficácia foram realizadas utilizando CAP agente único e da combinação de GEM e CAP. Estudos da literatura sugeriram uma associação entre a actividade da citidina-desaminase (CDA) da enzima e o risco de toxicidade em doentes a receber GEM ou à base de PAC terapia [14], [15]. CDA está envolvido na activação de CAP através da desaminação de DFCR em DFUR mas é inversamente responsável pela desaminação de GEM no seu metabolito inactivo dFdU [4], [5], [16], [17]. Devido à toxicidade foi observada com a combinação GEMCAP quantificamos atividade da enzima CDA no tecido tumoral.

Materiais e Métodos

Mouse Cepas

camundongos KPC desenvolver avançada PDAC de 2 3 meses e têm uma sobrevida mediana encurtado de aproximadamente 5 meses [12], [18]. Seus littermates controle, Kras; p53

R172H; Pdx1 por CRE (PC) ratos também foram utilizados neste estudo para transplante por via subcutânea a linhagem de células K8484. Assim, todas as experiências foram realizadas usando murganhos da mesma misturado 129 /SvJal /C57BL /6 antecedentes genéticos. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os animais do Reino Unido (Scientific Procedures) Act de 1986, com a aprovação do Comitê Local animal Ética, e seguindo as diretrizes de 2010 do Comité de Coordenação do Reino Unido sobre Cancer Research [19].

Linhas celulares

A linha de células K8484 foi estabelecida a partir de um tumor KPC PDAC por Olive et al. [18], [20]. As células foram cultivadas em meio DMEM (Life Technologies) suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS). As linhas de células de cancro pancreático humano Panc-1 e MiaPaCa-2 foram obtidos a partir de ECACC (Salisbury, UK) e cultivadas em DMEM com 10% de FBS. A identidade de todas as linhas de células humanas foram verificadas por genotipagem STR e testou negativo para micoplasma.

Ensaio de citotoxicidade

citotoxicidade Drogas

in vitro

foi avaliada por meio de Sulforodamina B colorimétrico (SRB) ensaio. As células foram plaqueadas numa placa de 96 alvéolos e doseados com uma gama de concentrações de 5-FU (0,03 uM a 30 uM) em linhas e gemcitabina (3 × 10

-4 uM a 0,3 uM) em colunas, dando uma grade de 8 × 8 combinações de concentração. Após 72 h de incubação a 37 ° C, as células foram então fixadas (ácido tricloroacético a 3%, 90 minutos, 4 ° C), lavado com água e coradas com uma SRB 0,057% de solução (Sigma) em ácido acético (w /v) durante 30 minutos. As placas foram lavadas (ácido acético a 1%, 4 vezes), e o corante ligado à proteína foi dissolvido numa solução de Tris base 10 mM (pH 10,5). A fluorescência foi medida utilizando Tecan Infinito M200 leitor de placas (excitação 488 nm, emissão 585 nm). A% de inibição de crescimento (GI) em comparação com células tratadas com o solvente de controlo foi calculada para cada combinação de concentração de droga.

O efeito da combinação foi avaliada usando o modelo Bliss Independência [21], [22] de acordo com o Protocolo temos descrito anteriormente [23]. Resumidamente, um modelo de aditividade foi construída com base nos dados de agente único a partir de 5-FU e GEM. valores de IG obtidos a partir deste modelo foram então subtraídos dos valores experimentais para identificar regiões de sinergia e antagonismo. Os números negativos mostram que menos de efeitos aditivos (cor amarela a vermelha) e números positivos mostram maior do efeito aditivo (verde para azul).

preparação da droga

Capecitabina pó (Sequoia Research) foi novamente suspenso em uma goma de 40 mM de tampão de citrato e arábica a 5%, a 100 mg /ml e administrado por sonda oral. cloridrato de gemcitabina (Tocris Bioscience) foi dissolvido em solução salina a 20 mg /ml e administrado por injecção intraperitoneal.

Farmacocinética e Estudos de Eficácia em Modelo K8484 aloenxerto

aloenxertos K8484 bilaterais foram obtidas por injecção subcutânea de 10

6 células por flanco. Para os estudos de farmacocinética, os ratinhos portadores de tumor aloenxerto foram tratados com uma dose única de PAC a 755 mg /kg, e as amostras foram recolhidas 10 min, 20 min, 40 min, 1 h, 2 h e 4 h depois, três animais por ponto de tempo. O sangue foi recolhido em heparina de lítio, e isolada de plasma e armazenados a -80 ° C. Fígado e tumores foram removidos e congelados instantaneamente em azoto líquido.

Em estudos de eficácia da PAC, os ratos foram tratados com CAP em 755 mg /kg ou veículo durante 5 dias consecutivos por semana, durante 3 semanas. Em GEMCAP estudo da eficácia da combinação, os ratinhos receberam doses gemcitabina a 75 mg /kg, a cada 3 dias, isoladamente ou em combinação com doses orais de PAC em 539 mg /kg administrada 5 dias por semana. Os tumores foram medidos utilizando por pinças. o volume do tumor foi calculado como comprimento x largura

2 × π /6.

Eficácia e Estudo de Sobrevivência no KPC Modelo rato

A inscrição de ratos KPC em estudo foi baseado no tamanho do tumor, medido por ultra-som em uma orientação axial. Ratos com diâmetros tumorais PDAC médios de 6-9 mm foram inscritos. Para o estudo de eficácia a curto prazo, os ratinhos foram tratados com PAC em 755 mg /kg ou veículo durante 7 dias consecutivos. Durante o tratamento, os ratinhos foram fotografadas duas vezes por imagens ultra-sónicas de alta resolução utilizando o Sistema Vevo 770 (Visual Sonics, Inc.) [24] e os volumes tumorais foram quantificados [18]. No dia 7, os ratos foram mortos 2 horas após a dose PAC. Plasma, tumor e fígado foram coletados como acima. Para o estudo de sobrevivência, os ratinhos foram incluídos, e fotografada a cada 3 dias, enquanto o tratamento com PAC a 755 mg /kg durante 5 dias consecutivos por semana ou com gema de 100 mg /kg a cada 3 dias até que os critérios de ponto de extremidade foram alcançadas. Estes incluíram o desenvolvimento de ascite abdominais, caquexia grave, perda de peso significativa (aproximando-se de 20%) do peso inicial ou de extrema fraqueza ou inatividade.

Imunohistoquímica

, embebidos em parafina secções de tecido fixadas em formalina foram coradas utilizando anticorpo de histona H3 fosfo-(Upstate, # 06-570) e detectado utilizando DAB peroxidase Substrate (Vector Labs). A coloração foi fotografada e quantificada utilizando o sistema Ariol (Leica Microsystems). Um mínimo de 3 campos por tumor foram quantificados. células positivas PH3 foram definidos como aqueles que possuem positivamente coloração da cromatina condensada.

GEMCAP estudos de tolerância de combinação

camundongos PC rolamento enxertos de células K8484 foram tratados com GEM a 100 mg /kg ou 75 mg /kg a cada 3 dias sozinho ou em combinação com PAC em 755 mg /kg ou 539 mg /kg ou 378 mg /kg, 5 dias consecutivos por semana e foram mortos, se todos os sinais clínicos se aproximou dos limites permitidos (que incluiu diarreia, hemorragia e perda de peso aproximando 20%). Utilizaram-se dois animais por dose. A resposta tumoral foi avaliada pela medição diária dos tumores com pinças.

Determinação de Capecitabina e do metabolito concentrações no plasma, fígado e tumores

CAP, DFCR, DFUR e 5-FU foram determinados tanto em plasma e tecidos, utilizando uma versão modificada do protocolo publicado anteriormente [25]. Resumidamente, as amostras de tecido foram homogeneizadas usando um homogeneizador Precellys 24 com rolamentos de esferas pequenas (kit Precellys MK28-R) durante 2 x 50 segundos a 6 000 rpm, em gelada de 50:50 de acetonitrilo: água (v /v) contendo 25 ug /ml de tetra-hidrouridina (Promega) para fazer uma concentração final de 50 mg de tecido por ml. Cinquenta ul de homogeneizado foi transferido para um tubo limpo prespiked com 200 mL de acetonitrilo arrefecido com gelo, contendo 50 ng /ml padrões internos estáveis ​​marcado (SIL) de todos os analitos (4 Toronto Research Chemicals). Após centrifugação a 20000 g durante 5 minutos, o sobrenadante foi evaporado até à secura, ressuspendeu-se em 100 mL de água e injectou-se a LC-MS /MS. Para as amostras de plasma, de 50 mL de plasma foi precipitado com 150 mL de acetonitrilo contendo 50 ng /ml padrões estáveis ​​marcados internos e processado de forma semelhante.

A detecção foi conseguida por LC-MS /MS utilizando um espectrómetro de massa Thermo TSQ Vantage com uma sonda HESI-II operado no modo positivo e negativo a uma voltagem de pulverização de 3 kV e a temperatura do vaporizador de 325 ° C. A detecção dos iões foi realizada no modo de monitorização de reacção múltipla, específicas para cada composto. Concentrações da capecitabina e metabolitos em amostras foram determinadas por comparação contra linhas de calibração construídos utilizando padrões de referência autênticos.

atividade enzimática CDA

Para preparar matriz de enzima em bruto, tecido tumoral foi homogeneizado em 500 mL de 0,1 M tampão Tris-HCl a pH 8, durante 2 x 50 segundos a 6000 rpm utilizando um homogeneizador Precelly. Os lisados ​​de tumor foram então centrifugadas durante 10 min a 14500 rpm a 4 ° C, os sobrenadantes decantados e o teor de proteínas foi medida utilizando o ensaio de proteína DC-BIORAD.

Para o ensaio de actividade da enzima CDA, soluções stock foram preparadas em GEM água. Para cada reacção, 20 ul de extracto de enzima do tumor foi misturado com 170 uL de 0,1 M de Tris-HCl, mM β-mercaptoetanol 50 e 10 mL da solução de estoque gemcitabina apropriado para perfazer concentrações finais de substrato GEM de 50 uM a 5,000 uM. As amostras foram incubadas a 37 ° C durante 30 minutos, a reacção foi parada pela adição de 600 mL de acetonitrilo e 50 mL de padrão interno 13C dFdU-

,

15N

2 foi adicionado a cada amostra. O mesmo protocolo foi utilizado para preparar uma curva padrão dFdU variando de 2,5 ng /mL até 5.000 ng /mL, bem como alta (3500 ng /mL), médio (200 ng /ml) e baixo (37,5 ng /mL) de controlo de qualidade normas dFdU.

Todas as amostras foram misturadas e centrifugadas a 5000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. 200 ul de sobrenadante foram transferidos para uma placa de 96 poços e evaporou-se até à secura. As amostras foram então reconstituído em 200 ul de água, agitada em vórtex durante 5 minutos e o dFdU foi quantificado por LC-MS /MS e normalizados para as concentrações de proteína total.

O

In vitro

ensaio de competição foi realizada num extracto de enzima a partir de um tumor de aloenxertos não tratada, utilizando o protocolo descrito acima. O extracto de enzima foi misturada com uma concentração fixa de 1,800 uM GEM, correspondente à Km de CDA neste extracto de enzima, e variando as doses de DFCR (0 a 1,200 uM) como competidor. O dFdU convertido de GEM foi quantificado por LC-MS /MS.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad Prism Versão 5.0. A significância das diferenças na eficácia anti-tumoral PAC, CDA Vmax e Km para o tampão contra o veículo foi determinada utilizando um teste t não emparelhado. Em estudos de tolerância e combinação GEMCAP, distinção na crescimentos tumorais foram analisados ​​usando um one-way ANOVA seguido por um comparações múltiplas pós-teste de Newman-Keuls.

Resultados

farmacocinética e farmacodinâmica do PAC e do seu metabolitos no mouse tecidos

Para investigar a farmacocinética do PAC e seus metabólitos, foram analisados ​​por espectrometria de massa os homogeneizados de plasma, tumor e fígado de ratos portadores de tumor K8484 enxerto coletadas em diferentes pontos de tempo após uma única dose de CAP dada oralmente a 755 mg /kg (2,1 mmol /kg /dia). Esta dose é a dose humana equivalente, determinada de acordo com o método de Reagan-Shaw et al [26]. PAC, DFCR e DFUR foram encontrados nos tecidos 3 em cada ponto de tempo (Figura 1). Plasma C

max para DFCR foi 393 ± 27 mM (20 minutos) e para DFUR 125 ± 90 m (40 minutos) (Figura 1A). No tecido do tumor, e DFCR DFUR C

max foram de 256 ± 7 pM e 101 ± 7 | iM, respectivamente, 45 minutos após a administração PAC e caiu para 64,4 ± 45,3 uM e 46,4 ± 28,1 uM após 4 h (Figura 1B). No fígado, C

max para todos os metabolitos foram atingidos 10 minutos após a dosagem e, em seguida, diminuiu progressivamente (Figura 1C). As concentrações de fígado foram maiores do que DFCR no tumor a partir dos mesmos ratinhos e o fígado foram menores concentrações DFUR, consistente com as distribuições previamente relatados de ACD e CDA em tecidos [5]. concentrações intra-tumorais de 5-FU aumentou progressivamente de 12,7 ± 3,7 uM, após 10 min de 49,5 pM após 1 h, e diminuiu para 10,7 ± 3,4 pM depois de 4 h (Figura 1B). Como nosso

in vitro

experiências com K8484 células mostraram um IC

50 para 5-FU de 2,56 ± 0,55 mM (dados não mostrados), estes

in vivo

resultados sugerem que um oral PAC de dosagem fornece uma dose terapeuticamente eficaz para os tumores de aloenxerto. 5-FU níveis foram mais de 30 vezes mais baixos no plasma (1,9 ± 0,5 ^ M em 40 min e 0,3 ± 0,2 uM após 4 h) do que no tumor e estavam abaixo do limite de quantificação no fígado a partir de 2 h (Figura 1C). Um estudo farmacológico também foi realizado para determinar o efeito de uma dose única de 755 mg de CAP /kg sobre a proliferação de tumores de aloenxerto K8484. Os tumores foram recolhidos 40 min, 2 horas e 4 horas após a dosagem e para imuno-histoquímica de fosfo-histona H3 (PH3) foi quantificado. coloração PH3 estava diminuída significativamente 4 horas após a dose (P 0,01; Figura 1D). em comparação com o controlo, revelando uma diminuição no número de células mitóticas após o tratamento com PAC

concentrações de metabolito no plasma (A), K8484 homogenatos tumorais aloenxerto (B) e homogeneizados de fígado (C) após uma dose única de PAC a 755 mg /kg. Média ± DP (n = 3, excepto durante 45 min e 1 h onde n = 2). (D) para imuno-histoquímica de fosfo-histona H3 (PH3) quantificado em KPC tumores de aloenxerto em diferentes pontos de tempo após uma dose única de 755 mg de CAP /kg. Média ± SEM de pelo menos três tumores (** P 0,01). concentrações (E) metabolito nos tecidos de ratinho KPC 2 h após a última de 7 doses consecutivas de PAC a 755 mg /kg, média e SEM de 6 ratinhos. concentrações (F) 5-FU 2 h depois de uma dose única (linha sólida) ou cinco doses consecutivas (linha tracejada) de CAP (755 mg /kg) dadas a camundongos com tumores de aloenxerto K8484.

foi demonstrado anteriormente que

in situ

tumores KPC PDAC são menos sensíveis a GEM de aloenxertos KPC apesar de sua idêntica

Kras Comprar e

p53

genótipos, e essa diferença de sensibilidade foi atribuída a entrega da droga limitado aos tumores KPC [18]. Portanto, analisamos a quantidade de PAC e metabolitos em tecidos de camundongos portadores de tumor KPC após sete dias de tratamento CAP (755 mg /kg). No plasma e no fígado PAC, DFCR, DFUR e concentrações de 5-FU foram comparáveis ​​entre ratos KPC e os hospedeiros de aloenxertos 2 h após a última dose (Figura 1E). Em tumores KPC PDAC, as concentrações de 5-FU foram de 26,9 ± 14,3 uM (Figura 1E), em comparação com 23,0 ± 8,1 ^ M em tumores de aloenxerto KPC, 2 h depois de uma dose única tampa (Figura 1B). Por causa da diferença no protocolo do estudo (7 doses em ratos em comparação com uma dose única KPC nos aloenxertos K8484), também em comparação com os dados aqueles a partir de um estudo farmacocinético independente realizada após 5 doses diárias de PAC administrados em ratinhos portadores de aloenxertos K8484. Neste estudo as concentrações de 5-FU no tumor 2 h após a quinta dose consecutivo de PAC foi de 22,7 ± 7,7 uM (Figura 1F), equivalente à concentração de 5-FU, após uma única dose no tumor aloenxerto (Figura 1B) ou após sete consecutivos doses em KPC tumores (Figura 1E). Estes dados sugerem que a administração de doses múltiplas de PAC não conduziu a 5-FU acumulação no tumor. Estes resultados mostram que PAC por via oral entregue uma quantidade similar de 5-FU para o

in situ

tumores PDAC e aos tumores enxerto.

CAP Anti-tumor Eficácia em pancreáticas Tumores

em primeiro lugar, estudou o efeito da PAC sobre o crescimento de tumores de aloenxerto K8484. Os ratos foram doseados com veículo ou PAC em 755 mg /kg durante 5 dias por semana. Após 3 semanas, os ratinhos tratados com veículo exibiram um volume tumoral médio de 1840 ± 201 mm

3 em comparação com 629 ± 86 milímetros

3 em ratinhos tratados com tampa (Figura 2a), com um aumento significativo no tempo de duplicação do tumor de 3,5 ± 0,5 dias em veículo de 7,5 ± 3,0 dias em murganhos tratados com tampa (P = 0,0002; Figura 2B).

(a), a eficácia Capecitabina em ratos portadores de tumores de aloenxerto K8484. Os animais receberam 755 mg /kg por dia durante 5 dias consecutivos por semana, durante 3 semanas. os volumes dos tumores são representados como a média ± SEM de 12 com veículo e 13 ratinhos tratados com CAP (** P 0,01). (B) O tumor tempo de duplicação para cada tumor (*** p 0,001).

Então, procedeu a um estudo de eficácia a curto prazo no

in situ

modelo KPC PDAC . KPC ratinhos foram tratados com PAC em 755 mg /kg durante 7 dias consecutivos e os volumes dos tumores foram monitorados duas vezes por semana por ultra-sonografia 3D. O crescimento tumoral foi reduzido em ratinhos tratados KPC-CAP em comparação com os ratinhos tratados com veículo (Figura 3A). O volume dos tumores tratados TAMPÃO era 121 ± 10,2% em comparação com 199 ± 21,8% no controlo (p 0,01; Figura 3B). tecido do tumor foi colhido 2 horas depois da última dose de PAC. coloração PH3 revelou menos células em mitose em tumores tratados com CAP em relação ao controle (p 0,05; Figura 3C), sugerindo a paragem do crescimento

(A) estudo de eficácia capecitabina de curta duração em camundongos KPC com

in. situ

PDAC, tratados com 755 mg /kg durante 7 dias consecutivos. os volumes de tumor para o veículo e CAP foram medidos por ultrassonografia e normalizada para o volume do tumor no dia da inscrição no estudo (média ± SEM, n = 6 por grupo). (B) O volume do tumor na extremidade como uma percentagem do volume no início, em ratinhos tratados com veículo KPC ou tampa (média ± SEM, n = 6 em cada grupo; ** p 0,01). (C) para imuno-histoquímica de fosfo-histona H3 foi quantificada em tumores PDAC 2 h após o 7

th e última dose de CAP 755 mg /kg. Os resultados são expressos como a média ± SEM (n = 6 por grupo; * p = 0,027).

O efeito da administração PAC em KPC Mice Survival Comparado a jóia de

Nossa farmacocinético dados mostraram eficiência na prestação do 5-FU e os dados do estudo de eficácia da PAC curto prazo nos levou para comparar PAC GEM em um estudo de longo prazo, utilizando sobrevivência como o ponto final. KPC ratos foram tratados quer com PAC a 755 mg /kg durante 5 dias por semana, ou com 100 mg /kg a cada 3 dias GEM. Os resultados identificaram que a sobrevivência foi semelhante nos 2 grupos; sobrevida média 8 e 10,5 dias para PAC e GEM, respectivamente, P = 0,61 (Figura 4A). A maior sobrevida foi de 67 dias no grupo PAC comparados a 26 dias no grupo GEM. Além disso, não houve diferença no crescimento tumoral entre o ca- e jóia- grupos (Figura 4B) tratados, o que sugere uma eficácia semelhante de GEM e PAC no PDA

(A):. As curvas de Kaplan-Meier para a capecitabina (tracejado ) e gemcitabina (sólido) a sobrevivência. = 0,61 teste log-rank P, Hazard Ratio = 0,78, 95% CI 0,29-2,06 (n = 10 por grupo). (B): curvas de crescimento individuais para TAMPÃO (preto) e tumores tratados com GEM (vermelho). Volumes foram normalizados para o volume no dia da inscrição no estudo de sobrevivência.

efeito da combinação GEMCAP

Em seguida, a combinação de GEMCAP foi investigada. A fim de escolher as doses apropriadas, primeiro investigou a tolerabilidade da combinação em ratinhos portadores de enxertos K8484. Os ratinhos foram tratados com gema de 100 mg /kg a cada 3 dias, isoladamente ou em combinação com PAC dada 5 dias por semana a 755 mg /kg, 539 mg /kg ou 378 mg /kg. Todas as três combinações usando GEM dose completa induzida marcada toxicidade gastrointestinal indicada pela perda de peso corporal do rato e a histologia do intestino delgado do rato: vilosidades encurtado com arquitetura interrompido e perda crypt (Supplemental Figura S1 D, F). Nem PAC 755 mg /kg ou a gema de 100 mg /kg por si só mostraram qualquer toxicidade gastrointestinal (Figura S1, A – C) Por conseguinte, repetiu-se a experiência com as mesmas doses PAC combinados com a dose reduzida GEM (75 mg /kg). O grupo tratado com a combinação de 755 mg /kg PAC mostrou toxicidade precoce, confirmado por histologia do intestino delgado (Figura S1, G). A combinação com 539 mg /kg de PAC (71% da dose completa) não exibiram sinais de toxicidade ao longo de dois ciclos de tratamento (11 dias). Com base nestes resultados, nós, por conseguinte, utilizadas as doses mais seguras de 539 mg /kg de PAC e 75 mg /kg GEM para estudar a eficácia da combinação GEMCAP em ratinhos com K8484 aloenxertos. Após 3 semanas, GEM reduziu significativamente o crescimento do tumor (p 0,001) em comparação com o veículo, assim como PAC sozinho (p 0,05) (Figura 5). A diferença observada entre GEM e CAP por si só não foi significativa (P 0,05). A combinação GEMCAP inibiu significativamente o crescimento do tumor com o tumor de tempo de 8,6 ± 10,8 dias (em comparação com 2,7 ± 0,9 dias em controlo) dobrando, mas esta não era superior ao sozinho GEM (tumor de tempo de 7,2 ± 2,8 dias de duplicação) e não significativamente diferente do CAP sozinho. Durante a semana 3

rd do tratamento, os ratinhos tratados com a combinação GEMCAP começou a mostrar toxicidade (perda de peso), em comparação com um único agente ratinhos tratados mas histologia intestinal no ponto final parecia normal (Figura S1, H e I).

eficácia combinação GEMCAP em camundongos com tumores de aloenxerto KPC. Os animais receberam veículo ou a gema de cada 3 dias a 75 mg /kg ou PAC em 539 mg /kg, 5 dias por semana, ou uma combinação destas duas doses. os volumes dos tumores são representados como a média ± SEM (n = 5 por grupo, * P 0,05, *** p 0,001 quando comparada ao veículo; NS: não significativo).

Estes dados, que mostra uma falta de sinergia da combinação, são consistentes com os de

in vitro

ensaios de citotoxicidade foram necessárias, em K8484 células e linhas de células pancreáticas humanas (MiaPaCa-2, Panc-1 e) doseados com uma gama de 5- Fu e GEM combinados, onde foram observados aditivos mas não efeitos sinérgicos (Figura S2). Tomados em conjunto, os nossos resultados mostraram efeito citotóxico aditivo

in vitro

mas também aditivo toxicidade

in vivo

. Portanto, GEMCAP não levar a um melhor índice terapêutico em ratinhos quando comparado com sozinho GEM.

Em seguida, investigou a atividade CDA tumor. Usando GEM como um substrato, determinou-se a taxa de conversão de GEM em dFdU e as constantes cinéticas de CDA, Vmax e Km, em tumores de aloenxerto com veículo e tratados com CAP (Figura 6). Os resultados mostraram redução Vmax e Km em tumores tratados com CAP (15,1 ± 2,6 nmol /h /mg de proteína e 1320 ± 147 mM, respectivamente) em comparação com tumores não tratados (h /proteína 56,3 ± 7,2 nmol /mg e 1880 ± 82 M. respectivamente; Figura 6C e 6D), sugerindo que a capacidade gemcitabina metabolização da CDA foi diminuída em tumores PDAC transplantados durante o tratamento PAC. Como os tumores foram recolhidos entre 2 h e 4 h após a última dose de CAP, nós saber se a actividade reduzida foi devido a competição entre o substrato GEM adicionado e a DFCR já nos tumores. Por conseguinte, realizada uma

In vitro

ensaio de competição utilizando o extracto de enzima a partir de um tumor não tratado de aloenxertos, uma concentração fixa de GEM 1800 uM correspondente à Km de CDA no extracto de enzima e concentrações variando DFCR 0-1200 ^ M . Os resultados, apresentados na Figura 6E, apresentaram alterações mínimas na taxa de conversão de GEM em dFdU mesmo na presença da concentração mais elevada de DFCR. A LC-MS /MS análises de tumores tratados com PAC revelou que as concentrações mais elevadas DFCR era 511 uM, dentro do intervalo testado neste ensaio de competição, apoiando que a diminuição observada na actividade CDA em tumores tratados com PAC não foi relacionado com um substrato concorrência. Isto sugere que o tratamento com PAC pode regular negativamente a actividade CDA.

Actividade da enzima

CDA foi determinada em não tratadas (A) e tumores (B) KPC aloenxertos tratados com tampão usando GEM como um substrato. A taxa de conversão de GEM em dFdU foi medida em homogeneizados de tumores individuais no final do estudo de eficácia PAC apresentado na Figura 2, e as constantes cinéticas foram determinadas Vmax (C) e Km (D) (n = 10 por grupo; * * p 0,01, *** p 0,001). (E)

In vitro

ensaio de competição realizados no extracto de enzima a partir de um tumor não tratado de aloenxertos. Foi utilizada uma concentração GEM fixa de 1800? M correspondentes ao Km da CDA no extrato enzimático e concentrações DFCR variando de 0 a 1200 M.

Por causa da

in vivo

toxicidade ea falta de efeito melhorado GEMCAP comparação com GEM sozinho nas aloenxertos, nós não testar GEMCAP em camundongos KPC PDAC, cuja saúde é menos robusta.

Discussão

os estudos apresentados aqui fornecem , pela primeira vez, os dados pré-clínicos sobre a farmacocinética e da eficácia de capecitabina em um modelo de rato geneticamente modificada de PDAC. Utilizou-se o Kras

G12D; Trp53

R172H; modelo do rato Pdx1-Cre [12], porque ele recapitula a síndrome clínica e histopatologia da doença humana. Os dados farmacocinéticos demonstraram que, após a administração oral, PAC sofre um extenso metabolismo no plasma, fígado e tumor. As concentrações de metabolitos da PAC em cada um desses compartimentos são consistentes com aqueles encontrados em um xenoenxerto de cancro do cólon humano [27]. Eles também são consistentes com a distribuição anteriormente relatado de as enzimas envolvidas no metabolismo humano PAC no rato e [5], [27]. 5-FU foi encontrado a níveis mais elevados no tumor do que no plasma de administração pós 30 min e foi indetectável no fígado confirmando a entrega selectiva de tumor do 5-FU após a administração PAC também descrita por Ishikawa et al. [6]. A partir de 5-FU no plasma e no fígado pode contribuir para a baixa toxicidade do PAC na dose de 755 mg /kg: nenhum dos ratos mostraram sinais de toxicidade devido ao tratamento PAC sozinho.