Abstract

Fundo

Apesar das evidências de que macrófagos activados ato em um microambiente inflamatório para promover tumorigênese gástrica via de sinalização β-catenina, os efeitos da sinalização de β-catenina em metástase de células de câncer gástrico e a relação dessas células com os macrófagos associados a tumores que cercam não tenham sido diretamente estudados.

Métodos

coloração imuno-histoquímica foi empregada para analisar 103 pacientes. Um ensaio de invasão foi usada para avaliar a relação entre os macrófagos e as células de cancro gástrico. p-catenina ganho-de-função e abordagens de perda de função foram realizadas. Para avaliar o mecanismo de regulação β-catenina em células de cancro gástrico, Western blot e reacção em cadeia da polimerase-transcrição reversa foram usadas.

Resultados

O aumento da densidade dos macrófagos foi associado com o estágio avançado e sobrevivência pobre . linhas celulares de cancro gástrico co-cultivadas com meio condicionado de macrófagos mostraram um aumento da acumulação nuclear de β-catenina e aumento da capacidade de invadir. AKT mas não ERK regulamentado translocação β-catenina. MMP7 e CD44, tanto β-catenina genes a jusante, foram envolvidas na invasão de células de cancro gástrico activadas e macrófagos.

Conclusão (s)

Colectivamente, os dados clínicos sugerem que a infiltração de macrófagos está correlacionada com aumento da qualidade e mau prognóstico para pacientes com câncer gástrico submetidos à ressecção radical. Os macrófagos podem induzir a invasão pela ativação da via β-catenina

Citation:. Wu MH, Lee WJ, Hua KT, Kuo ML, Lin MT (2015) macrófagos infiltração Provoca câncer gástrico Invasividade ativando a β-catenina Pathway . PLoS ONE 10 (7): e0134122. doi: 10.1371 /journal.pone.0134122

editor: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, ITALY

Recebido: 16 de setembro de 2014; Aceito: 06 de julho de 2015; Publicação: 30 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:.. Este trabalho foi financiado por doações do Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (NSC 98-2314-B-002-055-MY2)

Conflito de interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é um dos cânceres mais comuns em todo o mundo e quase dois terços desses pacientes vão morrer de. sua doença. [1] GC está intimamente relacionado com o

Helicobacter pylori

infecção, o que conduz à inflamação crónica. [2] Este microambiente inflamatório é caracterizado pela presença de leucócitos com hospedeiras principalmente macrófagos tanto no estroma de suporte e tecidos tumorais. [3] Pesquisas indicam que as respostas inflamatórias associadas a tumores, tanto locais como sistêmicos, são fatores independentes importantes na progressão tumoral e metástase. [4, 5] no entanto, as ligações entre estes mediadores moleculares e inflamação crónica não são totalmente compreendidos .

a activação da via Wnt é uma etapa importante na carcinogénese. As mutações ao longo da via Wnt-β-catenina ocorrem em aproximadamente 90% dos colorrectal e carcinomas hepatocelulares e em cerca de 30% de GC. [6, 7] Além disso, o factor de necrose tumoral-α (TNF-α) derivada a partir de macrófagos activados promove actividade β-catenina em células de GC. [8, 9] no entanto, apesar da evidência de que macrófagos activados ato num microambiente inflamatório para promover a tumorigénese gástrica através da sinalização β-catenina, os efeitos de sinalização β-catenina activado sobre a metástase de células de GC e o relacionamento destas células com macrófagos associados a tumores que cercam (TAMs) não tenham sido diretamente estudados.

com base no que precede, a hipótese de que a via β-catenina também podem estar envolvidos na regulação induzida por macrófagos metástase GC. Neste estudo, analisou em primeiro lugar a densidade dos macrófagos infiltrados e a expressão de β-catenina nos tecidos do carcinoma gástrico usando imuno-histoquímica (IHC). As características clinicopatológicas de carcinoma gástrico e prognóstico foram demonstrados. Além disso, verificou-se que os macrófagos induzir a translocação nuclear de β-catenina e aumentar a capacidade de invasão de células de GC. Nossas descobertas demonstram e apoiar ainda mais um elo importante entre TAM e seu mediador de sinalização a jusante, β-catenina, na regulação GC metástase.

Material e Métodos

Pacientes e espécimes

o estudo foi aprovado pelo Conselho e Ética Humana Comité das National Taiwan University Hospital Institutional Review. O consentimento por escrito para a utilização de amostras para fins de investigação foi obtido de todos os pacientes antes da cirurgia. As informações do paciente foi anónimos e de-identificados antes da análise.

O estudo retrospectivamente matriculados 205 pacientes com diagnóstico de GC que recebeu a ressecção cirúrgica radical no Departamento de Cirurgia Geral da Universidade Nacional de Taiwan a partir de Janeiro de 1998 a Janeiro de 2002. De destes, 102 doentes que não tinham dados de acompanhamento ou que morreram de complicações peri-operatórias foram excluídos e os restantes 103 pacientes foram incluídos nas análises. variáveis ​​clinicopatológicas foram classificados de acordo com a classificação TNM (5ª edição, 1997) e as características estão resumidas na Tabela 1. A sobrevida global (OS) foi definido como o intervalo entre a cirurgia ea morte ou entre a cirurgia eo último acompanhamento para os doentes sobreviventes.

Anticorpos monoclonais e IHC

Os espécimes ressecados de GC foram fixados em formalina e embebidos em parafina. As secções foram examinadas para a TAM infiltração e β-catenina usando anticorpo monoclonal anti-CD68 (clone KP1, DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) e um anticorpo monoclonal β-catenina (clone 15B8, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), respectivamente.

Avaliação da imunocoloração

Para avaliar a densidade de CD68 macrófagos infiltrantes de tecido +, cortes de tecido foram selecionados por um conselho patologista certificado (CI Jan) em baixa potência (100 ×) e os cinco mais representativos campos foram selecionados em 400 × ampliação. Os resultados foram contadas manualmente e foram expressos como a soma do número de células em cinco campos microscópicos × 400 para cada área de cada espécime.

Cultura celular

Células GC AGS, N87 (adquirido a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA)), MKN45 (adquirido a partir da Saúde Ciência Research Resources Bank (Osaka, Japão)) e TSGH (adquirido a partir da Colecção Bioresource e Research Center (Hsinchu, Taiwan)) e de células monocíticas humanas linha de células THP-1 (adquirido a partir de American Type Culture Collection (Manassas, VA)), as células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) com 10% de soro bovino fetal (FBS, Life Technologies, Inc. ) e 2 mM de L-glutamina (Life Technologies, Inc.).

células THP-1 foram semeadas em placas de cultura e induzidas para se diferenciarem em macrófagos por incubação com 100 ng /ml de 12-O-tetradecanoilforbol-13 -acetato (TPA, Sigma-Aldrich) durante 24 h. Os macrófagos foram lavados três vezes com meio RPMI contendo FBS a 10%, incubadas neste meio durante mais 24 h para eliminar o efeito de TPA e incubadas em meio isento de soro durante mais 24 h. Os sobrenadantes de cultura colhidos e reunidos foram usados ​​como macrófagos de meio condicionado (CM) tal como anteriormente descrito. [5, 10]

Proliferação /Viabilidade Ensaio

GC células foram semeadas em placas de 96 poços e co-cultivadas com ou sem CM macrófagos. A proliferação /viabilidade foi determinada através de um ensaio colorimétrico utilizando ácido 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) (Sigma-Aldrich).

In Vitro Ensaio de Invasão

O ensaio de invasão foi conduzida utilizando câmaras de cultura de células Transwell (Millipore Corp., Billerica, MA). As células invasoras foram contadas a 400 x de ampliação em 10 campos diferentes para cada inserção. A experiência foi repetida três vezes.

Extração de RNA e RT-PCR

Após estimulação com ou sem macrófagos CM durante 6 h, as células foram recolhidas e GC ARN total extraído usando o kit de reagente de Trizol ( Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as instruções do fabricante. cDNA foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) usando primers para MMP7 (forward: 5’AGTCAATCCTGCCTTCTTAGCC, reverso: 5’GCTCCCACCTTCCCTCTTGG), CD44 (para frente: 5’TGCCGCTTTGCAGGTGTAT, reverso: 5’TCCCATGTGAGTGTCTGGTAGC), ciclina D1 ( frente: 5’CCCAGCCATGGAACACCA, reverso: 5’GGAGGGCGGATTGGAAATGA), c-myc (forward: 5’AAAGAAGGTGTTGGGGTCGG, reverso: 5’TGGCTCCCCCTGTTATTTGG) e GAPDH (forward: 5’GGGTGATGCAGGTGCTACTT, reverso: 5’GGCAGGTTTCTCAAGACGGA) .

nuclear e citoplasmática Fraccionamento

Após estimulação com ou sem CM macrófagos durante 6 horas, as células foram lisadas em GC de 300 ul de tampão de lise em gelo e centrifugar a 5400 rpm. O sobrenadante foi recolhido como uma fracção citosólica. fracções nucleares foram recolhidas, em seguida, executar em sulfato de electroforese em gel de poliacrilamida dodecil de sódio (SDS-PAGE) para análise de mancha de Western.

Western Blotting Análise

Após estimulação com CM de macrófagos, as células foram lavadas com PBS , raspadas para tampão RIPA e centrifugado. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a 10% de SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore Corp.) A membrana foi sondada utilizando anticorpos primários para β-catenina, AKT, ERK, JNK (SC1496, SC8312, SC154, SC474, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA, EUA), MMP7 (MAB3322, CHEMICON, Temecula, CA, EUA), CD44 (ab51037, Abcam, Cambridge, MA, EUA), c-myc (GTX103436, GeneTex, Hsinchu Cidade , Taiwan), ciclina D1 (SC246, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA), β-actina (ab8226, Abcam), HDAC1, p-AKT, p-ERK, p-JNK (SC7872, SC7985-R, SC7383, SC6254, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA) e o anticorpo secundário (Santa Cruz Biotechnology).

a imunocitoquímica

o anticorpo anti-total de β-catenina foi usado como o anticorpo primário e anti- rato Imunoglobulina G (IgG) Alexa 594 foi usado como o anticorpo secundário. As lamelas foram então montadas utilizando meio de montagem contendo DAPI para a coloração nuclear.

Produção viral e infecção

RNAs curto hairpin (shRNA) foram adquiridos a partir da Facilidade núcleo Nacional RNAi na Academic Sinica (Taipei, Taiwan). A sequência alvo de β-catenina shRNA 1 foi 5′- CCGGTCTAACCTCACTTGCAATAATCTCGAGATTATTGCAAGTGAGGTTAGATTTTTG-3 ‘; que de β-catenina shRNA 2 era 5’-CCGGTTGTTATCAGAGGACT-AAATACTCGAGTATTTAGTCCTCTGATAACAATTTTTG-3 ‘. O vector lentiviral e os seus vectores de embalagem foram transfectados em células de empacotamento 293T por transfecção com fosfato de cálcio. Resumidamente, células 293T foram divididos (10

6) em 10 cm

2 pratos 1 dia antes da transfecção. Em seguida, as células foram transfectadas com 10 ug vectores shRNA e 10 ug de pCMVΔR8.91 (o vector de empacotamento) e 1 ug de pMD.G (o vector de envelope). Após 5 horas de incubação, o meio de transfecção foi substituído por meio de cultura fresco. Quarenta e oito horas mais tarde, o meio contendo lentivírus foi recolhido a partir de transfecção e centrifugadas a 1500 rpm durante 5 min para sedimentar os detritos celulares, o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,45 um, e células alvo foram infectadas com fresco lentivírus que contêm médio (suplementado com 8 mg /ml de polibreno) por 24 h.

análise estatística

a análise estatística das características clínicas foi feito usando o χ

2 de teste e o grau de infiltração entre os dois grupos foram comparados pelo teste t. As curvas de sobrevida foram construídas pelo método de Kaplan-Meier ea significância estatística foi analisada pelo teste de log-rank. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

correlação das variáveis ​​imuno-histoquímica com características clínico-patológicas em GC Pacientes

A análise imunohistoquímica mostrou um padrão de coloração CD68 citoplasmático para macrófagos. Os macrófagos CD68 + foram distribuídos por todo tecidos peritumoral e intratumoral mas apenas esparsamente espalhadas na mucosa normal (Fig 1A-1C). A densidade de macrófagos CD68 + foi especialmente elevado no estágio 4 lesões (pT4) de tumor tumor patológico comparação com lesões pT1 (Fig 1D). Para determinar a associação entre características clínicas e CD68 + macrófagos densidade, contagens de macrófagos CD68 + foram divididos entre aqueles acima e abaixo dos valores medianos. O número de macrófagos CD68 + foi encontrado para ser associado com a profundidade do tumor e fase (P = 0,001 e P = 0,043, respectivamente) (Tabela 1). Esta observação sugere que CD68 + macrófagos pode ser importante na promoção da invasão tumoral. Para uma análise mais aprofundada, as curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram plotados para determinar a associação de macrófagos com a sobrevivência (Fig 2). A densidade de CD68 + macrófagos no tecido tumoral foi negativamente associado com a sobrevida global (p = 0,0073). Os doentes com elevado número de macrófagos CD68 + tumorais tinham sobrevida global mais curto do que aqueles com baixos números de CD68 + macrófagos.

A imunocoloração contra CD68 foi realizada em lâminas de tecido de pacientes com câncer gástrico. CD68 + macrófagos coloração era escassa na mucosa gástrica normal (A). As células CD68 + foram detectados tanto no estroma do tumor e ninho (B C). A densidade de CD68 + macrófagos no tumor patológico estadiamento (PT) 1 (D) e pT4 (E) lesões tumorais.

O aumento da expressão e sinal mais forte de β-catenina foram observadas por coloração IHC em tumores. Na maioria dos casos, a expressão β-catenina foi localizado principalmente no citoplasma (Fig 3A). Curiosamente, forte coloração nuclear de células de GC β-catenina foi associada com CD68 + macrófagos nas lesões tumorais, especialmente na frente da invasão tumoral (Figura 3B). Com base nestes resultados, a hipótese de que a infiltração de macrófagos podem activar a sinalização β-catenina em células de tumor gástrico, que, em seguida, provavelmente conduz a invasão na malignidade gástrica.

β-catenina foi altamente expressa em tumores. (A) Na maior parte dos casos, a expressão β-catenina foi localizado principalmente no citoplasma. No entanto, (B) coloração nuclear forte de β-catenina em células GC foi positivamente associado com macrófagos CD68 + nas lesões tumorais.

Exigência de macrófagos para Tumor Invasion no GC e ativado Invasion Induzido por macrófagos de as células GC

Para confirmar ainda mais os nossos achados clínicos

in vitro

, primeiro macrófagos co-cultivadas com diferentes linhas de células GC (AGS, N87, MKN-45 e TSGH). Todas as linhas celulares GC testados seria recrutar macrófagos a migrar e a capacidade de macrófagos-recrutamento foi dependente do grau de malignidade das células de cancro, tal como determinado por sua capacidade de invasão (Fig 4A). [11] Para avaliar se a capacidade de invasão ou proliferação de células de GC pode ser regulada por macrófagos, AGS, N87, MKN45 e TSGH foram co-cultivadas com e sem macrófagos ou CM a partir de macrófagos durante 24 h e as suas capacidades de invasão e proliferação testados. Todos os tipos de células em co-cultura com macrófagos ou CM a partir de macrófagos mostrou um aumento de perto de duas vezes no número de células invasoras (em comparação com os controlos negativos, p 0,05), que não está associada com a sua capacidade de proliferação (Fig 4B-4D ).

(A) atividade de migração de THP-1 co-cultivados com diferentes linhas celulares de cancro gástrico (AGS, N87, MKN-45 e TSGH) monócitos. THP-1 de monócitos serão recrutados por diferentes linhas celulares de cancro gástrico e a capacidade de recrutamento é dependente do grau de malignidade. (B) a capacidade Invasão de células GC tratados pelo CM macrófagos. Quatro tipos diferentes de células GC (AGS, MKN45, N87 e TSGH) foram semeadas numa câmara de Boyden e co-cultivadas com ou sem células de macrófagos ou CM macrófagos durante 24 horas. habilidades invasão de cada linha celular foram medidos

in vitro Compra de 24 horas. Todos os dados representam a média aritmética ± SEM. * P 0,05, ** p 0,01. (C) Efeito da co-cultivadas com células de macrófagos CM. células N87 e AGS foram co-cultivados com CM de macrófagos, respectivamente, durante 24 horas e a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT.

translocação nuclear do β-catenina em células de GC por macrófagos activados

foi realizado um experimento in vitro para compreender se a sinalização β-catenina estava envolvido na invasão celular GC-activated macrófagos. Como mostrado na Fig 5A, a imunorreactividade β-catenina foi encontrada na fracção nuclear das células N87 tão cedo quanto 15 minutos após o tratamento de macrófagos cm, e a quantidade de proteína β-catenina nuclear aumentada de uma maneira dependente do tempo. De acordo com estes resultados, imunofluorescência mostrou acumulação e de localização nuclear de β-catenina em células de GC co-cultivados com CM de macrófagos em comparação com os controlos co-cultivadas em N87 (Figura 5B). Estes resultados sugerem fortemente que os factores solúveis derivados de macrófagos ajudar a mediar a acumulação e a translocação nuclear do β-catenina em células de GC. Nós transitoriamente derrubado β-catenina por shRNA e encontrou diminuição da expressão da proteína β-catenina no prazo de 24 h. ablação genética de β-catenina em células de N87 não consegue aumentar a sua capacidade invasiva após o tratamento de macrófagos CM. Em contraste, não-transfectadas e shRNA controle não apresentou alterações na capacidade invasora em células N87 em tratamento de macrófagos CM (Figura 5C). A quantidade de proteína β-catenina nuclear foi também aumentado em AGS e MKN45 células após o tratamento de macrófagos cm (S1 figura).

(A) β-catenina se acumula no núcleo após tratamento com CM de macrófagos durante 30 minutos em células N87. (B) as imagens Immunofiuorescent foram observadas com um microscópio confocal. células positivas β-catenina foram analisados ​​usando um anticorpo anti-β-catenina, o que é reconhecido pelo anticorpo de coelho secundário conjugado com FITC, representado por fluorescência verde; A coloração nuclear foi detectada pela contra células com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), representada como a fluorescência azul. A co-cultura com macrófagos CM, coloração immunofiuorescence complexos mostrou-β-catenina FITC translocados para o núcleo. (C) a capacidade Invasão de células GC tratados pelo CM macrófagos.

Efeitos de macrófagos na expressão de β-catenina e os genes a jusante em células N87

Foi avaliada a tradicional Wnt /β-catenina genes a jusante MMP7, CD44, c-myc e ciclina D1 para determinar se eles são activados por macrófagos. Os níveis de mRNA e proteína de MMP7, CD44 e genes c-myc foram todos significativamente aumentados em células incubadas com CM N87 de macrófagos e os níveis de ciclina D1 aumentou ligeiramente (Fig 6A). Depois que levou a diminuição da atividade invasão de derrubar β-catenina, MMP7, CD44 e ciclina D1, mas não c-myc mostrou proteína sub-regulação (Fig 6B). Para confirmar a relação entre a capacidade de invasão e MMP7 e CD44, foi testada a capacidade de um anticorpo neutralizante para bloquear a actividade MMP7 e CD44. capacidade de invasão foi significativamente comprometida por pré-tratamento com 2,5 jig /ml de anti-MMP7 e com 10 ug /mL de anti-CD44 (Figura 6C), respectivamente, o que sugere o envolvimento de ambos os genes na invasão de células activado GC-macrófago. Achamos que os níveis de proteína de CD44 e ciclina D1 genes foram aumentadas nas outras linhas de células GC (AGS e MKN45) incubadas com CM macrófagos mas MMP7 e c-myc foram alteradas não significativa (S2 Fig).

( A) Efeito da CM de macrófagos em mRNA e expressão de proteína de β-catenina genes a jusante. N87 células foram cultivadas na presença ou ausência de CM macrófagos. Para ARN e o nível de proteína, as células foram recolhidas após 6 horas e 24 horas de tratamento, respectivamente. células (B), com ou sem N87 knock-down de β-catenina utilizando shRNA-2 foram co-tratadas na presença ou ausência de CM macrófagos. N87 células foram recolhidas após 24 horas de tratamento e analisadas com western blot. (C) Efeito de MMP7 neutralizada anticorpo em células GC invasão. N87 células na presença de CM de macrófagos durante 24 horas foram pré-tratados com várias doses de anticorpo MMP7 neutralizada (0, 0,625, 1,25 e 2,5 ug /ml) durante 1 hora isotipo IgG foi usada como um controlo de bloqueio. (D) Efeito de anticorpo CD44 neutralizado na invasão de células de GC. N87 células na presença de CM de macrófagos durante 24 horas foram pré-tratados com várias doses de anticorpo neutralizou-CD44 (0, 1,25, 2,5, 5 e 10 ug /ml) durante 1 hora. Isotipo IgG foi usada como um controlo de bloqueio. Todos os dados representam a média aritmética ± SEM. *

p Art 0,05.

Outros relataram uma possível intersecção da via MAPK com a via de sinalização Wnt /β-catenina. [12, 13] Por conseguinte, um estudo realizado curso de tempo e descobriu que apenas fosfo-AKT e a expressão de fosfo-ERK foram regulados positivamente quando tratados com CM de macrófagos (Fig S3A). Para confirmar a interacção entre a Akt /ERK e β-catenina, que pré-tratados com as células quer o inibidor de ERK (U0126) ou o inibidor de AKT (LY294002). Diminuição da translocação β-catenina para o núcleo foi encontrada apenas em células tratadas com o inibidor de AKT, mas não inibidor de ERK, indicando via de sinalização /β-catenina avtivated Wnt-macrófago pode ser regulada por AKT (Fig S3B). Em células de GC, o efeito AKT parece ser dominante no macrófago activado Wnt /β-catenina via de sinalização. Estudos anteriores também sugeriram que o TNF-α produzido por macrófagos é um importante mediador da inflamação e pode promover a actividade β-catenina em células de tumor. Descobrimos que utilizando anticorpos neutralizantes contra o TNF-α no N87 activação de supressão β-catenina sob exposição a macrófagos CM (S4 Fig).

Discussão

O microambiente do tumor é de importância crítica no determinação da função dos leucócitos e fenótipo. dados conflitantes tem mostrado funções anti-tumorigénica ou protumorigenic nos macrófagos, em particular, no entanto nossos dados indicam macrófagos desempenham um papel protumorigenic em pacientes GC. Na maioria dos tumores, TAM produzem uma miríade de factores que promovem o crescimento tumoral e angiogénese. [14, 15] O grau de infiltração de macrófagos em ninho de células de cancro é também um preditor significativo da sobrevivência em pacientes GC. [16-18] IHC resultados deste estudo demonstram claramente que a densidade de macrófagos no tecido GC está correlacionada com o grau de fase clínica (especialmente no tumor [T] etapa) e a sobrevivência de pacientes. Os estudos atuais também implica que os macrófagos podem desempenhar papéis nocivas no GC avançado. Esta constatação está em harmonia com estudos que sugerem que o microambiente imunológico pode ser protumoral em vez de antitumoral, apesar de alguns dados conflitantes. [19, 20]

acumulação nuclear de β-catenina foi relatada em aproximadamente um terço de adenocarcinomas gástricos, ambos os tipos intestinal e difuso. [18] β-catenina é uma proteína de 92 kDa que funciona directamente na adesão célula-a-célula. [21] As mutações de β-catenina e da expressão aberrante da sua proteína têm sido implicados em invasão de tumores e metástases. [22, 23] nos nossos achados IHC, β-catenina foi localizado no núcleo na frente invasiva de células tumorais, mas não na zona mais central dos tumores primários, onde se localiza na membrana plasmática . Tais observações também pode ser encontrado em espécimes de tumor colorectal. [24] Wnt activação /β-catenina em células cancerosas localizadas na frente invasiva tem sido postulada como um passo importante no crescimento do tumor e progressão. [25]

Curiosamente, também encontramos β-catenina localiza-se no núcleo de células tumorais com os macrófagos localizadas de modo adjacente, sugerindo uma possível relação entre macrófagos e a translocação nuclear de β-catenina em células de tumor. β-catenina na frente invasiva de GCs é parcialmente explicada por interações dentro do microambiente do tumor. Nós confirmamos

in vitro

que os macrófagos aumentar a capacidade de invasão das células GC. Usando imunofluorescência microscopia confocal, determinou-se a localização e acumulação de β-catenina no núcleo em macrófagos tratados. Assim, nós suspeitamos que as citocinas secretadas por macrófagos induzir a translocação nuclear β-catenina em células de GC, aumentando assim a sua capacidade de invasão. A frente invasiva de tumores epiteliais representa um microambiente no qual macrófagos interagir com as células parenquimatosas por produção da matriz extracelular e pela secreção de citoquinas e factores de crescimento que promovem localmente a proliferação celular e a invasão. [26, 27] No entanto, no nosso estudo, o aumento da β-catenina expressão

in vitro

não alterou a proliferação, indicando que, por si só, não é suficiente para aumentar a malignidade do tumor. Esta conclusão também é demonstrada anteriormente que β-catenina só promove locais de adesão para formar focalmente e estimula a migração direccional e invasão de células cancerígenas do cólon, mas não estão envolvidos na proliferação de células de cancro da próstata e gástricas. [28-30] No entanto, a célula estromal parácrina modulação de sinalização de Wnt em células epiteliais é provável coordenado por uma rede mais complexa de promoção e inibindo factores de secreção. Os efeitos a jusante de diferentes níveis de sinalização de Wnt /β-catenina (e em especial as que afectam a proliferação celular, EMT e invasão local) estão a partir de ainda pouco compreendidos. β-catenina transloca-se para o núcleo onde se liga a factores de transcrição do factor de factor de células T /potenciador de linfócitos (TCF /LEF) familiar e inicia a transcrição de genes alvo, tais como

ciclina D1

,

c- myc

e

MMP-7

[31, 32] envolvidas na proliferação, invasão tumoral e metástase. [33, 34] Nossas descobertas sugerem que as vias de sinalização através do qual os macrófagos induzem β-catenina também induzir a expressão de genes alvo. Consistente com o nosso trabalho anterior, [5] a MMP-7 e CD44 foram identificadas duas matrizes de PCR após a co-cultura com macrófagos como genes expressos diferencialmente associados com a metástase de células de GC. A degradação da matriz extracelular mediada por metaloproteinases de matriz (MMPs) é um mecanismo crucial durante a invasão pelo tumor e metástases. Tal degradação é necessária para criar um micro-ambiente que suporta o crescimento de tumores primários e metástases. O complexo β-catenina /TCF subsequentemente activa um grande número de oncogenes, incluindo VEGF, c-myc, c-jun, fra-1 e a gastrina que podem também estar envolvidos em eventos a jusante de macrófagos activados β-catenina. [35]

Uma variedade de vias provável modular a /β-catenina via Wnt e regulação da sinalização β-catenina pode ser semelhante complicado. Estudos recentes descobriram que macrófagos CM desencadeia a via de ERK e Wnt activa de ERK em células endoteliais. [36, 37] Aqui, verificou-se que os macrófagos induzir a fosforilação de ERK e AKT tanto em células de GC. Foi demonstrado que o tratamento com inibidor de AKT, mas não reduz o inibidor de ERK β-catenina translocação. Estes resultados indicam que a AKT desempenha um papel na sinalização de macrófagos activados β-catenina em tipos de células gástricas.

Conclusões

Colectivamente, os dados clínicos sugerem que a infiltração de macrófagos está correlacionada com o aumento do grau e para o pior prognóstico pacientes GC submetidos à ressecção radical. Os macrófagos podem induzir GC invasão pela ativação da via β-catenina. Por conseguinte, a supressão da infiltração de macrófagos e supressão da activação da via β-catenina representam potenciais estratégias para o tratamento de GC.

Informações de Apoio

S1 Fig. . Efeito de CM de macrófagos na via β-catenina

β-catenina se acumula no núcleo após tratamento com CM de macrófagos durante 30 minutos em AGS e células MKN45

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s001

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S2 Fig. Efeito da CM de macrófagos na expressão da proteína de β-catenina genes a jusante de células AGS e MKN45

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s002

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S3 Fig. (A) dos macrófagos induzida CM AKT e activação de ERK em células N87. células (B) N87 foram pré-tratadas com 10? M dos inibidores β-catenina:. LY294002 ou U0126 durante 1 hora, em seguida, cultivadas na presença de CM de macrófagos durante 1 hora adicional

AKT, ERK e β-catenina expressão de proteínas foram determinados por Western blot

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s003

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S4 Fig. . Anticorpo neutralizante contra o TNF-α

N87 células na presença de CM de macrófagos durante 24 horas foram pré-tratadas com ou sem inibidor de TNF-α durante 1 hora

doi: 10.1371 /journal.pone.0134122.s004.

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