Abstract

linhas celulares de cancro canina tem sido progressivamente desenvolvido, mas ainda são subutilizados recursos para pesquisas em biologia radiação. Medição da radiossensibilidade intrínseca celular é importante porque a compreensão da diferença pode fornecer um quadro para elucidar ainda mais perfis para predição de resposta a terapia de radiação. Nossos estudos têm-se centrado na caracterização diversas linhas celulares de cancro canino

in vitro

e compreender os parâmetros que possam contribuir para radiossensibilidade intrínseco. Em primeiro lugar, radiossensibilidade intrínseca de 27 linhas celulares de cancro derivadas de canino dez tipos de tumores foi determinada utilizando um ensaio clonogénico. As 27 linhas celulares tinham variando radiosensitivities independentemente tipo de tumor (fracção de sobrevivência de 2 Gy, SF2 = 0,19-0,93). A fim de compreender parâmetros que podem contribuir para radiossensibilidade intrínseca, avaliou-se as relações de radiossensibilidade celular com características celulares básicas das linhas celulares. Não houve correlação significativa de SF2 com a fração de fase S, tempo de duplicação, número de cromossomos, ploidia, ou o número de cromossomos metacêntricos, enquanto houve uma correlação estatisticamente significativa entre SF2 e eficiência do plaqueamento. Em seguida, foram selecionadas as cinco linhas de células mais radiossensíveis como o grupo radiossensível e as cinco linhas de células mais radioresistentes como o grupo radiorresistente. Em seguida, foram avaliados os parâmetros conhecidos para a morte celular por radiação ionizante, incluindo ADN de cadeia dupla interrupção (DSB) de reparação e a apoptose induzida por radiação, no grupo radiossensíveis, em comparação com o grupo radiorresistente. Altos níveis de focos residual γ-H2AX nos locais de LAP estavam presentes em quatro das cinco linhas celulares de cancro canino radiossensíveis. Os nossos estudos sugeriram que as diferenças substanciais em radiossensibilidade intrínseca existir em linhas celulares de cancro canino, e reparação de DSB induzida por radiação foi relacionada com a sensibilidade à radiação, o que é consistente com estudos anteriores humanos. Estes dados podem ajudar novas investigações visando à detecção de DSB para prever a resposta individual à terapia de radiação para os cães, independentemente do tipo de tumor

Citation:. Maeda J, Froning CE, Brents CA, Rose BJ, Thamm DH, Kato TA (2016) intrínseca Radiosensibilidade e celular Caracterização de 27 linhas celulares de cancro canina. PLoS ONE 11 (6): e0156689. doi: 10.1371 /journal.pone.0156689

editor: Ying-Jan Wang, da Universidade Nacional Cheng Kung, TAIWAN

Recebido: 14 Janeiro, 2016; Aceito: 18 de maio de 2016; Publicação: 03 de junho de 2016

Direitos de autor: © 2016 Maeda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. o financiamento foi fornecido pelo Dr. Akiko Fundo Radiobiologia Ueno (TAK). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro é uma das principais causas de morte em cães, bem como em seres humanos. cancros humanos e caninos têm características semelhantes, não só na aparência anatômica e histopatológico, mas também comportamento biológico, genética do tumor e resposta às terapias convencionais [1, 2]. modelos de câncer canino emergiram como recursos valiosos no estudo do câncer humano [2]. Na pesquisa do câncer humano, numerosas linhas de células cancerosas humanas bem caracterizadas estão disponíveis para a investigação do cancro. linhas celulares de cancro têm sido amplamente utilizados como

in vitro

sistemas modelo experimentais e têm-se revelado útil para explorar a biologia subjacente de câncer [3]. linhas celulares de cancro canina tem sido progressivamente desenvolvidos e utilizados, mas não são tão completamente caracterizadas como linhas celulares humanas. Investigação da biologia celular através de caracterizações de linhas celulares de cancro canino pode fornecer informações adicionais sobre a biologia do câncer, alguns específicos para cães, e alguns potencialmente completem as relatados para o cancro humano.

Os tumores mesmo com mesma origem histopatológico pode mostrar uma vasta gama de sensibilidade à terapia de radiação [4, 5]. Medição da radiossensibilidade intrínseca celular é importante porque a compreensão da diferença pode fornecer um quadro para elucidar ainda mais perfis para a previsão da terapia de radiação de resposta (RT). radiosensitivities intrínsecas medidos por

In vitro

ensaios de formação de colónias são expressos como SF2, a fracção de células sobreviventes de uma dose única de 2 Gy de radiação (IR) ionizante. A dose de 2 Gy é também uma dose utilizada por fracção em RT clínica em seres humanos. O SF2 em humanos foi mostrado para prever a resposta do tumor

in vivo

em estudos anteriores [6, 7]. Tais estudos têm sugerido que as diferenças de radiossensibilidade intrínseca existir e compreender os mecanismos poderiam impactar significativamente a prática de RT personalizado [4, 5].

Os mecanismos subjacentes às diferenças de radiossensibilidade intrínseca das células tumorais é multifatorial [5] . Reparação de ADN rupturas dos filamentos duplos (LAP) é conhecido como um dos elementos mais importantes que determina radiossensibilidade intrínseca, porque essas lesões, se não reparados, levar à morte celular [8]. Anteriormente, a distribuição das células nas fases do ciclo de célula e o teor /cromossoma ADN têm sido sugeridos como factores que possam afectar a radiossensibilidade intrínseca das células tumorais [9, 10]. Além disso, parte das diferenças pode ser atribuível à tendência para sofrer apoptose em resposta a radiação, como visto em tumores linfóides [11]. No entanto, as correlações inconsistentes com radiossensibilidade das células tumorais humanas foram relatados na medição destes parâmetros, e o estabelecimento de um ensaio útil que prevê radiossensibilidade intrínseca ainda está sob investigação [4].

Nossos estudos têm-se centrado na caracterização diversas linhas de células de câncer canino

in vitro

e compreender os parâmetros que possam contribuir para radiossensibilidade intrínseco. Esta caracterização básica pode fornecer informações destas linhas celulares para futuras pesquisas na predição de resposta à radioterapia. Foi examinada a radiossensibilidade intrínseca de 27 linhas celulares de cancro derivadas de canino dez tipos de tumores. Cada linha celular foi caracterizado por uma combinação de dados que representam a distribuição do ciclo celular, tempo de duplicação celular, número de cromossoma, ploidia de DNA padrão e plaqueamento eficiência. Os parâmetros conhecidos, incluindo DNA DSB eficiência reparação e apoptose após exposição a radiação ionizante foram avaliados entre linhas celulares radiossensíveis e radioresistentes selecionados.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

A 27 de canino linhagens de células tumorais foram gentilmente fornecidos pela Flint Centro animal Câncer da Universidade Estadual do Colorado (Fort Collins, CO, EUA) (Tabela 1) [12]. As linhas celulares tumorais adesiva foram cultivadas em Meio Mínimo Essencial (MEM /EBSS, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 1% de vitaminas MEM, não- aminoácidos essenciais, piruvato de sódio, penicilina, estreptomicina e fungizona. As células tumorais foram cultivadas em suspensão em meio RPMI 1640 (Gibco Life Technologies) complementado com o mesmo que o MEM. As linhas de células foram mantidas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 95% de ar e 5% de CO

2.

A proliferação celular

De forma a determinar os tempos de duplicação de as linhas de células, as células foram plaqueadas a diferentes concentrações em placas de cultura de 35 mm. As células foram incubadas a 37 ° C. O número de células foi contado em cada 24 horas, utilizando um contador Coulter Z1 (Beckman Coulter, La Brea, CA). tempos de duplicação celulares foram calculados utilizando o software Prism 5 (Graph Pad Software, La Jolla, CA). Pelo menos três experimentos independentes foram realizadas.

número de cromossomos

As células foram cultivadas com 0,1 mcg /mL colcemid (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 6 horas, a fim de colher os cromossomas em metafase. As amostras foram tratadas em solução de KCl 75 mM hipotónico durante 20 minutos a 37 ° C e fixado em 3: 1 (metanol: ácido acético) solução de fixação três vezes. os spreads metáfase foram coradas com solução de Giemsa, e o número de cromossomos foi observado sob um microscópio Axioplan (Carl Zeiss, Jena, Alemanha). Um mínimo de 100 células em metafase foram analisados ​​para contar cromossomos por célula. Pelo menos 50 células em metafase foram analisados ​​para contar cromossomos metacêntricos por célula.

Cell Cycle Analysis

As culturas de células em 60% a 70% de confluência foram fixadas em 70% de etanol a -20 ° C durante a noite ou mais. As células foram então centrifugadas a 1500 rpm durante 5 minutos e lavadas uma vez com PBS. As células foram então ressuspendidas em 1 mL de solução de coloração (20 ug iodeto de propídio /ml, 0,1% Triton X-100, 500 ug /ml de RNase A) e incubou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. A análise foi realizada utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur com celular Busca Pro (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) e software ModFit LT (Verity, Topsham, ME). Três experiências independentes com cada linha celular foram realizadas. Ploidia foi estimada como sendo o conteúdo de ADN de células G1 nas células tumorais normalizados para células de ovário de hamster chinês diplóides.

A irradiação

culturas em fase logarítmica foram irradiadas com doses diferentes de

137Cs gama- raios usando um JL Shepherd Modelo Mark I-68 nominal 6000 Ci

137Cs do irradiador (JL Shepard, Carlsbad, CA), entregue em cerca de 2,5 Gy /min à temperatura ambiente.

clonogênica Survival Ensaio

Radiosensibilidade foi medida pelo ensaio clonogénico para linhas celulares nonsuspension. células aleatoriamente dividindo em T-12.5 frascos foram irradiados, tripsinizadas e semeadas em triplicado para 100 mm ou 60 mm pratos de cultura com uma densidade de célula apropriada. Após incubação durante 1-2 semanas para permitir a formação de colónias, os pratos foram lavados com NaCl a 0,9%, fixadas com etanol a 100% e coradas em 0,1% de violeta de cristal. Cada colônia composta por mais de 50 células foi marcado como um sobrevivente. Pelo menos três experimentos independentes foram realizados, então curvas de sobrevivência foram desenhadas usando equações de regressão linear-quadrática com o software Prism 5. A fracção de sobrevivência de 2 Gy de radiação (SF2) e a fracção de sobrevivência em 5 Gy de radiação (SF5) foram obtidas por interpolação da sobrevivência celular como estimativa da radiossensibilidade intrínseca de cada linha de células.

Para culturas em suspensão, uma ensaio de diluição limitante foi usado como anteriormente utilizado em linhas celulares de cancro humano [13, 14]. As células foram plaqueadas em placas de microtitulação de 96 poços a densidades de 1-200 células por poço em dois ou três densidades celulares por cada ponto de dose. Após a irradiação, as placas foram incubadas a 37 ° C durante 2-3 semanas antes de marcar como positivos ou negativos para o crescimento baseado em exame microscópico (isto é, os poços em que tinha ocorrido crescimento de células são positivas). Com base na distribuição de Poisson, frações de sobrevivência foram calculadas como descrito anteriormente [15].

γ-H2AX Focos em células irradiadas-G1

Indução de e LAP ADN residuais por IR foram avaliadas usando o ensaio γ-H2AX. Realizou-se o ensaio com células sincronizadas e mantidos em G1 durante a irradiação utilizando o método isoleucina privação [16]. Isto foi feito porque as células não irradiadas em fase S têm níveis muito mais elevados de focos γ-H2AX, e também porque o número de focos por célula dependem de o teor de ADN [17]. As células foram cultivadas durante 24 horas em lâminas de câmara de plástico a aproximadamente 50% de confluência e lavadas uma vez com PBS. O meio de crescimento normal foi substituída por duas vezes em 1,5 tempos de duplicação com MEM-isoleucina deficiente contendo 5% 3 × FBS dialisado para sincronizar as células na fase G1. Após a sincronização G1 e a exposição a 0 ou 1 Gy Gy de raios gama, as células foram incubadas com 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) durante 30 minutos (imediatamente ou após 5,5 horas de incubação para a reparação). EDU-marcação foi usado para julgar a sincronização G1 [18]. As células foram então lavadas em PBS e fixadas em paraformaldeído a 4% seguido de permeabilização com 0,5% de Triton X-100 e 0,1% de SDS. EdU foi corado pela primeira vez como as instruções do fabricante. As lâminas foram lavadas três vezes em PBS, fixadas em paraformaldeído a 4% e bloqueadas em PBS com soro de cabra a 10% durante a noite a 4 ° C. Após incubação durante a noite, as células foram incubadas com um anticorpo fosforilado histona H2AX (Ser139) (γ-H2AX) (Millipore, Billerica, MA) e seguido por Alexa 594 anticorpo Fluor-conjugado de cabra anti-murganho (Molecular Probes, Eugene, OR) . As células foram montadas numa solução com DAPI contendo desvanecimento lento (Invitrogen). As imagens digitais foram capturadas usando um microscópio de fase Z-motorizados Axioskop (Carl Zeiss) com CoolSnapHQ2 (Photometrics, Tucson, AZ) e software Metamorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). As imagens foram usadas para contar focos γ-H2AX por célula. Três experimentos independentes foram realizadas e os números da γ-H2AX foram contadas por um mínimo de 50 EdU coloração de células negativas para cada amostra em cada experimento.

Análise da apoptose

A indução de apoptose por IR foi avaliada usando a ativação Caspase 3/7, coloração de anexina V, e ensaio desoxinucleotidilo terminal transferase (TdT) mediado desoxiuridina trifosfato nick end-rotulagem (TUNEL). Log células em crescimento de fase foram irradiadas com 0 Gy ou 5 raios gama Gy. Após 16 horas de incubação, o início da apoptose foi medida com a activação de caspase 3/7 por caspase-Glo 3/7 Kit (Promega, Madison, WI). luminescente brilho de 10.000 células foi medida por Lumat LB9507 (Berthold tecnologias, Oak Ridge, TN). Após 24 horas de incubação, o mais cedo /tarde apoptose foi medida com a coloração de anexina V por kit de detecção de apoptose FITC anexina V com 7-AAD (BioLegend, San Diego, CA). Annnexin V positivo, mas 7-AAD negativo (células primeiros apoptóticos) e anexina V positiva e 7-AAD positivo (fase tardia apoptose) foi determinada por Guava-PCA citômetro de fluxo. Após 48 horas de incubação, o final de apoptose foi medida com o ensaio de TUNEL e morfologia nuclear fragmentada. As células foram fixadas com cytogentrifuged 4% de paraformaldeído e arrefecida com gelo de 70% de etanol. As células foram incubadas na mistura de reacção contendo 1,5 mM CoCl

2, 12,5 L TdT, 1 mM de 5-bromo-2′-desoxiuridina-5′-trifosfato em tampão de TdT (Br-dUTP, Sigma-Aldrich: os outros , Roche, Indianapolis, IN) durante 4 horas a 37 ° C no escuro. As lâminas foram incubadas com um anticorpo monoclonal de ratinho de BrdU e o anticorpo anti-ratinho de cabra Alexa Fluor 488 conjugado. Finalmente, as células foram contrastadas com DAPI. Aproximadamente 1.000 núcleos de cada lâmina foram contados e frequências positivas TUNEL foram calculados. índices de apoptose, também foram determinados ao marcar células de coloração DAPI com morfologia nuclear fragmentada.

Western Blot

As células foram lisadas com M-PER Mammalian Proteína Reagente de Extracção (Thermo Fisher Scientific) e inibidores da protease. Os extractos de proteína (20 pg por amostra) foram tamanho fraccionado em géis NuPage 4-12% Bis-Tris (Invitrogen), electro-transferidas para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad) em tampão (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 20% (v /v) de metanol, e 0,01% de SDS), a uma densidade de corrente de 3,0 mA /cm

2 durante 16 horas a 4 ° C. Os filtros foram bloqueados com solução salina tamponada com Tris com Tween 20 0,05% contendo 2% (w /v) de leite desnatado, e feito reagir com um anticorpo primário durante 2 horas à temperatura ambiente, seguido por uma incubação com um anticorpo secundário durante 1 hora a temperatura do quarto. Os sinais imunorreactivas foram detectadas utilizando SuperSignal Western Blotting Detection Kit (Thermo Fisher Scientific) e um ChemiDoc XRS + System (Bio-Rad). A expressão proteica a partir de força banda foi analisada por um software Image Lab (Bio-Rad). Os anticorpos primários utilizados neste estudo foram os de ratinho anti-ADN-PKcs anticorpo monoclonal (Ab-4; Neomarkers, Fremont, CA), o anticorpo policlonal de coelho anti-Rad51 (H-92; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), o FANCD2 anti-anticorpo policlonal de coelho (NB100-182; Novus Biologicals, Littleton, CO) e o anticorpo de beta-actina de rato monoclonal (Abram 8226; Abcam, Cambridge, MA). Os anticorpos secundários foram conjugados com anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho HRP (1: 10000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) e IgG de cabra anti-coelho conjugado com HRP de anticorpos (1: 10.000) (sinalização celular, Boston MA ). Cada banda expressão foi estimada a partir de peso molecular de cada proteína e a banda detectada em A549 linha de células de cancro humano.

Análise Estatística

Para a análise estatística, foi utilizado GraphPad Prism 5 software. O teste D’Agostino-Pearson foi utilizado para determinar se os valores eram normalmente distribuídos. Diferenças com um valor P inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Correlações de SF2 e outros parâmetros foram determinadas pelo teste Pearson. As comparações estatísticas de valores médios no ensaio γ-H2AX (controle vs 6 horas após a 1 Gy) foram realizadas por meio do teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn. A comparação estatística dos valores médios no SF2 /SF5 (grupo radioresistente vs grupo radiossensível) e no ensaio de apoptose (0 Gy vs 5 Gy) foi realizada utilizando não pareado bicaudal teste t.

Resultados

Caracterização de base de linhas celulares de cancro Canino

Cada linha celular foi caracterizado por uma combinação de dados representando tempo de duplicação celular, a distribuição do ciclo celular, o padrão de ploidia, e número de cromossomas, com os dados resumidos na Tabela 1. O tempos de duplicação de cada linha de células variou de 15 horas (CML-6M, CTAC) para 40 horas (STSA-1), que mostra a variação da largura. Medimos a distribuição do ciclo de células de cada linha celular por citometria de fluxo. A percentagem de células em cada fase do ciclo celular variou de 39,3% (CLBL1) a 69,6% (BR) para a fase G1, a partir de 17,3% (parques) a 50,1% (CLBL1) para a fase S, e de 1,52% (BR ) para 29,9% (Parques e STSA-1) para fase G2 /M. Estas linhas celulares exibidos números médios variáveis ​​de cromossomos, variando de 57 (1771) para 155 (17CM98). As linhas celulares de cancro canino mostrou aumento do número de cromossomas metacentric (cromossomas em forma de X) resultantes de eventos de translocação Robertsonianas [19], com a excepção de duas linhas de células (Jones e OSW) (Tabela 1). Frequências de metacêntricos variaram entre linhagens de células de menos de dois, o cariótipo normal, para 43,2 (D17) por célula. Todas as linhas celulares, excepto BR tinha maior do que a quantidade diplóide de ADN. Encontramos acordos globais entre ploidy anormal e aumento do número de cromossomos, mas nem sempre. Nike, por exemplo, teve um menor número de cromossomos por célula com 64,4, mas o padrão de ploidia foi entre diploidia e triploidia.

clonogênica sobrevivência após a exposição a radiação gama

Nós irradiado cada um dos as 27 linhas celulares de cancro canino com 0, 1, 2, 3 ou 5 Gy de raios-gama e formação de colónias medidos. As curvas de sobrevivência estão apresentados na figura 1. Os valores SF2 e SF5 que foram calculados a partir da curva de sobrevivência de regressão quadrática linear, bem como eficiência de plaqueamento, são apresentados na Tabela 1. Estes dados representam a gama de radiosensitivities células tumorais caninas em diferentes tipos de tumores . O SF2 variou 0,19-0,93, e o SF5 variou entre 0,01 e 0,60. A eficiência de plaqueamento destas linhas celulares também demonstrou uma grande variação, variando de 4% a 65%. A eficiência de plaqueamento de BR (4%) foi muito baixa para obter fracções de sobrevivência de confiança; portanto, a sua sensibilidade à radiação não foi utilizado para posteriores análises. A radiossensibilidade das quatro linhas de células de OSA canino (D17, Moresco, Grace e Mackinley) medidos por ensaio clonogénico foi consistente com aqueles que tenham sido previamente publicada [20]. Portanto, os dados das características de base celulares (por exemplo, tempo de duplicação, análise cromossómica) mostrados no relatório também foram utilizados para a análise no presente estudo. Foram avaliadas as correlações entre as características celulares variável ea radiossensibilidade. Nessas linhas celulares, não houve correlação significativa de SF2 com a fração de fase S, tempo de duplicação, número de cromossomos, ou o número de cromossomos metacêntricos, enquanto houve uma correlação modesta, mas estatisticamente significativa entre SF2 e eficiência do plaqueamento (R

2 = 0,34, p = 0,002, teste de Pearson) (Fig 2). Avaliação contra SF5 mostrou os resultados semelhantes a estes obtidos a partir de SF2 (R

2 = 0,24, p = 0,01, Pearson teste).

As experiências foram realizadas pelo menos três vezes e barras de erro indicam o erro padrão dos meios. Nós selecionamos as linhas mais radiossensíveis celulares (curvas vermelho) e as linhas de células mais radioresistentes (curvas azuis) para a seguinte análise.

Cada ponto representa uma linha celular. As correlações foram avaliadas pelo teste de Pearson. As linhas foram ajustadas por um método dos mínimos quadrados.

Seleção de radiossensível e radioresistentes Grupos em

As 27 linhas celulares de cancro caninos foram classificados pelos parâmetros radiossensibilidade, SF2 e SF5, e as cinco linhas mais sensíveis ou resistentes para cada parâmetro foram definidos como os grupos sensíveis e resistentes (Fig 3A e 3B). O grupo radioresistente seleccionado apresentado valores SF2 ,19-,44 (Nike, CML-C2, Bliley, MacKinley, STSA-1). O grupo radiossensíveis exibiram valores acima SF2 0,86 (CMT-12, K9TCC, DEN-HSA, a CMT-27, Abrams). As diferenças de sensibilidade à radiação de células tumorais foram discriminados melhor quando a radiossensibilidade das células de tumor foi expresso em fracções de sobrevivência com a dose mais elevada (SF5). As linhas celulares em dois grupos com base na comparação SF5 eram ligeiramente diferentes daqueles com base na comparação SF2. As fracções de sobrevivência entre os dois grupos de linhas de células quer com base em o comparação SF2 ou SF5 foram estatisticamente diferentes (p 0,001). (Figura 3C e 3D)

27 linhas de células são classificadas com base no SF2 (A) e SF5 (B). círculo vermelho: Grupo radiossensível, círculo azul: Grupo radiorresistente. (C, D) Comparação entre os valores médios dos dois grupos com base na SF2 (C) ou SF5 (D). As barras de erro indicam o desvio padrão. * P . 0,001 versus grupo sensível e resistente (teste t não emparelhado)

Relação entre Intrínseca Radiosensibilidade e DSB de ADN em células G1-Irradiatied

Para examinar se a resposta das células para DSB de ADN correlaciona-se com a radiossensibilidade em linhas celulares de cancro canino, foi utilizado ensaio γ-H2AX entre os cinco mais radiorresistente e cinco linhagens de células mais radiossensíveis seleccionado de classificação SF2. focos nuclear de histona H2AX fosforilada (γ-H2AX) resultante de danos no ADN são marcadores sensíveis para a DSB de ADN [21]. Nós medimos o número de focos γ-H2AX após 1 de irradiação gama Gy em células G1 de fase sincronizada seguinte 30 min ou 6 horas de tempo de reparo (Fig 4). Nos meios de comunicação deficientes isoleucina para sincronizar as células G1, a maioria das células DEN-HSA morreu após uma incubação de 24 horas, e a linha de células CMT-12 não foi sincronizado na mídia. Por conseguinte, estas duas linhas celulares não foram utilizados para esta análise. As outras linhas celulares mostraram sincronização G1 com menos de 16% na fase S na mídia deficiente isoleucina para 1,5 vezes de duplicação. Em algumas células que não estão em fase S com 0 Gy tratamento, um grande número de focos H2AX-y endógenos foram observadas em todas as células cancerosas canino. Foram excluídas as células com níveis elevados de focos externos de distribuição induzida por IR a partir da análise para detectar os níveis de focos induzida por IR. Com base na análise sem células com níveis elevados de números de focos γ-H2AX endógenos, 1 Gy de raios gama induzidos níveis significativamente mais elevados de focos γ-H2AX após 30 minutos de irradiação em todas as linhas celulares utilizadas neste análise (p 0,05 vs 0 Gy, não mostrado na figura) (Figura 4B). Aos 30 minutos após a irradiação, o número médio de focos γ-H2AX foi dependente do teor de ADN de cada linha de células. Além disso, o radiossensível CML-10C2, Nike, STSA-1 e MacKinley teve maior número de focos γ-H2AX após seis horas seguintes 1 Gy irradiação comparação com os seus níveis de controlo (p 0,05 vs 0 Gy). Por outro lado, todas as três linhas celulares radioresistentes e uma linha de células radiossensível, Bliley, não mostrou diferenças significativas entre as células de controlo e células com 6 horas após a irradiação.

As células foram sincronizadas no G1 utilizando isoleucina meios deficientes e, em seguida, irradiada com 1 Gy de raios gama. Após 30 min de incubação ou tempo de 6 horas, as células foram coradas com γ-H2AX. (A) Exemplos de focos γ-H2AX (verde) em DAPI nuclear (azul) coloração no controle, 1Gy seguido por 30 min de incubação e 1 Gy seguido de 6 horas de incubação em células negativas Edu. (B) A análise quantitativa dos focos H2AX gama-por célula. Os dados obtidos a partir de três experimentos independentes marcando 50 células em cada experimento são mostrados. A barra indica média. significâncias estatísticas são mostradas apenas para o controle versus 6 h após 1 Gy (teste não paramétrico de Kruskal-Wallis).

Relação entre Intrínseca Radiosensibilidade e apoptose Frequência em células irradiadas

Os cinco células radioresistente as linhas e as cinco linhas de células radiossensíveis também foram avaliadas quanto a apoptose em 18, 24, e 48 horas pós-irradiação (0 Gy e 5 Gy) (Figura 5). Caspase 3/7 activação foi analisada 18 horas pós-irradiação (Fig 5A). Anexina V expressão foi analisada em 24 horas pós-irradiação (Fig 5B). A actividade de Caspase 3/7 aumentou em mais do que duas vezes foram observados em CMT-12, Abrams, CMT-27, CML-10C2, Bliley, MacKinly, e STSA-1. A percentagem de células apoptóticas aumentou significativamente com 5 Gy de irradiação em CMT-12, Abrams, CMT-27, CML-10C2, Bliley, e MacKinley por análise de Anexina V. As células apoptóticas foram contadas por coloração TUNEL (Figura 5C) e DAPI afirmando (Figura 5D) e relataram separadamente. Embora a apoptose foi observada em todas as culturas de controlo que vão 0,1-3,4% por coloração TUNEL e 0,37-3,3% por coloração com DAPI das células, dependendo da linha celular, não houve diferença significativa entre as linhas de células. A percentagem de células apoptóticas aumentou significativamente com 5 Gy de irradiação em Abrams, Nike, e LMC-10C2 por coloração com DAPI em relação a amostras 0 Gy (p 0,05, teste-t não emparelhados) (Fig 5C). Usando a medição de células apoptóticas por ensaio de TUNEL, foram observados resultados semelhantes a estes por coloração com DAPI. Um aumento significativo na frequência de apoptose por IV foi observada em um (Abrams) das cinco linhas celulares radiorresistentes e em três (Nike, CML-10C2 e MacKinley) das cinco linhas celulares radiossensíveis (Figura 5D).

3/7 actividade (a), medido por caspase luminomator às 16 horas após a irradiação. (B) coloração de anexina V e 7AAD medido pelo citómetro de fluxo às 24 horas após a irradiação. (C) coloração TUNEL e (D), a coloração DAPI medido por microscópio de fluorescência. As células irradiadas com 0 Gy e 5 Gy de raios gama. *, P 0,05 versus 0 Gy e 5 Gy para cada linha de células (teste t não emparelhado)

Protein Expression da via DNA Repair em radiossensível e Grupos radioresistentes

Desde DNA. vias de reparação de DSB estão intimamente relacionados com a morte celular por IR, que estudaram o estado de proteína das principais vias nas células cancerosas canino. Estamos focados na grande final dois não homóloga juntar (NHEJ) e recombinação homóloga (HR) na reparação DSB e caminho da Anemia de Fanconi (FA), o que possivelmente contribui para a DNA reparação de danos por irradiação. a expressão da proteína de grandes jogadores em cada via, DNA-PKcs em NHEJ, RAD51 em RH e FANCD2 na FA via foram detectados por western blot na radioresistente e grupos radiossensíveis (Fig 6). A expressão de ADN-PKcs, FANCD2 RAD51 e não eram uniformes entre as linhas de células, e não havia nenhuma tendência clara entre níveis de expressão em dois grupos, como mostrado na Figura 6B. A expressão dos três proteínas nas células cancerosas caninas foram globalmente maiores do que os fibroblastos normais do cão. Observamos menor expressão de proteínas DNA-PKCS em Nike (1,4 vezes do normal) e a expressão mais alta no STSA-1 (5,4 vezes do normal). Para a proteína FANCD2, o menor expressão estava em DEN-HSA (0,8 vezes do normal) e a mais alta expressão estava em CMT-27 (7,2 vezes do normal). Para a proteína RAD51, o menor expressão em DEN-HSA (0,4 vezes do normal) e a mais alta expressão estava em MacKinley (3,0 vezes do normal). Quando comparado entre o canino e a linha celular de cancro humano (A549), os níveis de expressão de ADN-PKcs em STSA-1, que apresentou a maior expressão das linhas celulares caninas, foram 10 vezes menor do que a A549.

(a) a análise de Western blot de DNA-PKcs (460 kDa), FANCD2 (165 kDa) e RAD51 (37 kDa). β-actina (42 KDa) de expressão foi usado como um controlo. Cada banda de expressão foi estimada a partir do peso molecular. (B) Intensidade Band of western blot. (C, D) imagens representativas de focos RAD51 (C) e focos FANCD2 (D) co-localizada com gamma-H2AX nas células Moresco.

Também observamos os focos de RAD51 e FANCD2 como funcionalmente co-localizada com γ-H2AX sobre o stress sem irradiação de replicação em todas as linhas 27 celulares (Fig 6C e 6D). Outra vantagem para testar RAD51 e FANCD2 foi que estas formações focos de proteína requerem outras proteínas a montante, tais como cinco proteínas RAD51 parálogos e oito proteínas anemia Fanconi [22-24]. Por conseguinte, detectar a formação de focos nos permitiu rastrear a presença destas proteínas a montante em todas as 27 linhas celulares de cancro canino. Observamos focos funcional do RAD51 e FANCD2 em todas as linhas celulares.

Discussão

As 27 linhas celulares de cancro canino derivados de dez tipos de tumores diferentes utilizados no presente estudo tinham variados radiosensitivities independentemente tumor digitar com os valores de SF2 0,17-0,94 (Figura 1 e Tabela 1). A partir de dados de radiossensibilidade anteriores usando uma grande variedade de tumores humanos, SF2 variou 0,038-0,95 [13]. A gama mais baixa de SF2 relatados no estudo humano foi principalmente devido a tumores linfóides, que não eram altamente radiossensível no nosso resultado canino, onde SF2 foi medido utilizando o mesmo ensaio. tumores linfóides são conhecidos por serem sensíveis à terapia com radiações em oncologia humana e veterinária [2]. Esta discrepância pode ser causada pela variação entre as linhas celulares de tumores linfóides como relatado anteriormente [25], uma vez que apenas quatro linhas de células foram investigados no nosso estudo.

A fim de compreender parâmetros que podem contribuir para radiossensibilidade intrínseca, nós avaliamos as relações de radiossensibilidade celular com características celulares básicos nos 27 linhas celulares de cancro canina. Uma ampla variação também foi observada em características celulares em termos de número de cromossoma, fracção da fase S, tempo de duplicação e eficácia do plaqueamento nestas linhas de células (Tabela 1). Em nosso estudo, não encontramos uma correlação entre a radiossensibilidade e as características celulares, incluindo número de cromossomos, fração de fase S, e tempo de duplicação (Fig 2).