Abstract
Fundo
tensão mecânica à compressão produzida durante o crescimento em uma matriz de confinamento limita o tamanho de esferóides tumorais, mas pouco se sabe sobre a dinâmica da acumulação de estresse, como o estresse afeta o fenótipo da célula cancerosa, ou as vias moleculares envolvidas.
Metodologia /Apreciação Principais
Nós co células cancerosas individuais -embedded com micro-partículas fluorescentes em gel de agarose e, por meio de microscopia confocal, registrou a distribuição 3D de micro-esferas que cercam esferóides crescimento. A alteração na densidade de micro-esferas foi em seguida convertido para estirpe no gel, a partir dos quais se estima a distribuição espacial da tensão de compressão ao redor dos esferóides. Encontrou-se uma forte correlação entre a distribuição peri-esferóide sólido stress e forma esferóide, um resultado da supressão da proliferação celular e na indução de morte celular apoptótica em regiões de elevada tensão mecânica. Ao comprimir constituídos esferóides de células cancerosas que sobre-expressam os genes anti-apoptóticos, que demonstram que a apoptose induzida por esforço mecânico ocorre via a via mitocondrial.
Conclusões /Significado
Os nossos resultados fornecem uma visão detalhada, em quantitativa o papel do estresse mecânico micro-ambiental na dinâmica de crescimento esferóides tumor, e sugerir como os tumores crescem em locais confinados, onde o nível de estresse sólida torna-se elevado. Uma implicação importante é que a apoptose através da via mitocondrial, induzida por tensão de compressão, podem ser envolvidos em dormência do tumor, em que o crescimento do tumor é mantido em controlo por um equilíbrio de apoptose e a proliferação
citação:. Cheng L, Tse J, Jain RK, Munn LL (2009) estresse mecânico Micro-Ambiental Controles Tumor Spheroid tamanho e morfologia suprimindo a proliferação e induzir a apoptose em células cancerosas. PLoS ONE 4 (2): e4632. doi: 10.1371 /journal.pone.0004632
editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Pesquisa Ordway, Estados Unidos da América
Recebido: 21 Dezembro, 2008; Aceito: 02 de janeiro de 2009; Publicação: 27 de fevereiro de 2009
Direitos de autor: © 2009 Cheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede P01CA80124, R01CA085140 e R01CA126642. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O crescimento de tumores sólidos é fortemente influenciada pelo seu microambiente. Além bem estudados os parâmetros do microambiente, tais como a hipoxia [1], [2] e a angiogénese [3] – [5], tensões mecânicas também desempenham um papel importante. Para um tumor sólido crescer num espaço fechado definido pelo tecido circundante, ele deve vencer as forças de compressão resultantes. Tem sido mostrado que os tumores e os seus estroma associado são mecanicamente mais rígida do que o tecido normal do hospedeiro correspondente [6], e que a compressão mecânica em tal ambiente pode entrar em colapso sangue e vasos linfáticos [7]. No entanto, nossa compreensão de como essa compressão influencia diretamente o crescimento do tumor é limitado. Várias hipóteses têm sido propostas sobre a participação do estresse mecânico no desenvolvimento do tumor [8] – [11], e Helmlinger et al. [12] realizada a primeira quantificação da inibição de crescimento de esferóides em géis de agarose. Eles encontraram que os esferóides de carcinoma do cólon humano pode crescer a um tamanho máximo de 400 um (diâmetro) em 0,5% (w /v) de agarose, mas apenas 50 | iM em 1,0% de agarose (que é menos complacente). Isto foi associado com um aumento na embalagem celular e uma diminuição na proliferação celular. Eles também demonstraram que tal inibição do crescimento do tumor pode ser revertida através da libertação dos esferóides de gel. Ainda várias questões-chave permanecem sem resposta, incluindo: (1) Qual é a natureza do campo de tensões em torno crescente esferóides de tumor? (2) Pode local de distribuição de tensões sólido afecta a forma de esferóides de tumor? (3) A distribuição de tensões sólida também afetam fenótipo celular em diferentes regiões do esferóides individuais? (4) que é a via intracelular que regula a mudança fenotípica induzida por stress sólido (s)? Estas perguntas são essenciais para uma compreensão fundamental da dinâmica do crescimento de tumor sólido.
Neste estudo, mostra-se que o stress sólido acumulando em géis de agarose em torno de esferóides de crescimento de tumor (células de carcinoma mamário murino 67NR não metastáticos, a menos que indicado em contrário ) pode ser medida utilizando co-embedded fluorescentes micro-grânulos (diâmetro = 1 mm) como marcadores para a estirpe no gel: gel de agarose são resistentes à degradação por proteases celulares de cancro [13], e, assim, permitir estudos de sólido independente a acumulação de stress de invasão celular. Nós demonstramos que a forma do campo de tensões sólido dita a forma de esferóides de tumor e que este efeito é devido à supressão da proliferação celular e na indução de apoptose de células em regiões de alta tensão contínua. Finalmente, elucidar o mecanismo molecular para a apoptose induzida por estresse contínuo.
Resultados
Crescimento esferóides tumorais comprimir progressivamente a matriz circundante
Fig. 1
A
mostra o crescimento de um esferóide tumor típico (verde) co-integrado com micro-esferas (vermelho) em gel de agarose a 0,5% por 30 dias (veja configuração experimental em Suplementar Fig. S1
A
). Análise por microscopia confocal 3D revelaram que o gel de agarose foi progressivamente comprimida pelo esferóide de crescimento (Fig. 1
B
). Em pontos de tempo início, houve muita flutuação na densidade de micro-esferas (
ρ
grânulos), principalmente por causa do esferóide ainda foi relativamente pequeno e, como resultado, o volume de amostragem para a medição
ρ
grânulos foi limitado. aumentos significativos em
ρ
esferas começaram a aparecer no dia 17, quando o diâmetro esferóide (
D
sphd) foi apenas ~ 150 mm. Por volta do dia 30,
D
sphd tinha alcançado -250 mm e
ρ
pérolas nos primeiros 10 shell um de espessura de gel de agarose (
ρ
grânulos, 1) foi ~1.6 vezes maior do que géis átonas, o que corresponde a uma estirpe de 37,5% (
ε
gel, 1). pressão significativa foi limitada à vizinhança imediata do esferóide:
ρ
esferas diminuiu para o seu nível de controle dentro de ~ 50 mm a partir da superfície esferóide (Fig 1
B
, dia 30. curva). A relação entre crescimento de esferóides ea tensão resultante no gel agrose é linear na faixa de
D
sphd medido em nosso estudo (Fig. 1
C
). De propriedades mecânicas publicados de 0,5% de gel de agarose [14], estimou-se que o esferóide na Fig. 1
A
imposta ~28 mmHg de tensão sólida na matriz imediatamente adjacente aos 30 dias, semelhante ao valor estimado teoricamente por Helmlinger et al. [12]. Para esferóides cultivadas em gel de 1,0%, do volume de amostragem para a quantificação da densidade de micro-esferas foi demasiado pequeno porque a maioria dos esferóides não pode crescer mais do que 50 um de diâmetro.
(
Um
) Um esferóide crescente (verde) e seus micro-esferas circundantes (vermelho). Barra de escala = 100 pm. (
B
) Quantificação da densidade de micro-esferas relativa (
ρ
talão) em 10 mícrons cascas grossas de gel de agarose em torno do esferóide crescente demonstrado no
A
como uma função da distância da casca do centro esferóide (
dist
). (
C
) Correlação entre o diâmetro esferóide (
D
sphd
) ea tensão no primeiro 10 mícrons de espessura shell de gel de agarose (
ε
gel, 1) em torno de esferóides.
R
é o coeficiente de regressão linear; declive da linha de regressão é significativamente maior do que zero (
p Art 0,0001).
forma Tumor esferóide se correlaciona fortemente com a forma de sólido local, campo de tensões
na vizinhança de alguns esferóides, o gel de falha sob a tensão produzida pelo crescimento de esferóides. Isto resultou em fissuras planares micro-escala no gel (Fig. 2
A
, pontas de seta). Embora os esferóides seleccionados para análise na Fig. 1 não residem dentro de tais fendas e foram todos quase de forma esférica, esferóides que existiam dentro de rachaduras formas oblato adotadas (ou seja, achatada esferas, Fig 2
A
;. Também vemos Filme S1 para renderização 3D). Quantificação da densidade de micro-esferas em torno de esferóides achatados típicos esféricas e revelou uma forte correlação entre a forma esferóide e a forma do campo de tensão mecânica local (Fig. 2
B, 2C
). Isto foi ainda confirmado pelos resultados da análise semelhante em esferóides ~ 25 de diversas formas (Figs. 2
D
). Helmlinger et ai. observado um fenómeno semelhante por esferóides de crescimento capilar em tubos de vidro de 1 mm:. os esferóides alongada ao longo do eixo do tubo, presumivelmente em resposta ao campo de tensões locais [12]
(
Um
) gel de agarose pode falhar sob tensão de crescimento esferóides tumorais (verde). setas vermelhas indicam a borda de fissuras planares em gel de agarose (BF: imagem de campo brilhante tirada no modo Nomarski). Barra de escala = 50 mm. (
B
) Spheroids (verde) de diferentes formas e seus campos de tensão circundantes visualizadas por micro-esferas (vermelho). Barra de escala = 150 pm. (
C
) Relação entre a tensão local em gel de agarose (
ε
gel, 1, local) e deformação esferóide local (
λ
sphd, local) para os esferóides (verde, inserção) mostrados na
a
.
dist
seg é a distância de esferóides segmentos de Centro esferóide normalizados ao longo do comprimento do eixo maior. (
D
) Correlação entre a assimetria na forma esferóide e na estirpe correspondente no gel de agarose em torno, mostrando que os esferóides são mais deformados ao longo da direcção de maior tensão. Cada ponto de dados é de um esferóide.
R
é o coeficiente de regressão linear; declive da linha de regressão é significativamente maior do que zero (
P
0,0001). Métodos de análise de imagem em
C Comprar e
D
estão descritos na Suplementar métodos S1, Suplementar Fig. S2, Filme S2 e S3 filme.
estresse sólida alta suprime a proliferação celular e induz a morte celular por apoptose em esferóides tumorais
Para investigar o potencial fenotípica muda que o estresse contínuo induz nas células cancerosas, avaliou-se a proliferação celular e a apoptose nos esferóides. A divisão celular perto de regiões de maior tensão (isto é, na direcção do eixo menor de esferóides achatados) foi reduzida em comparação com as regiões de tensão mais baixa (Fig. 3). Para verificar como compressão estresse afeta a viabilidade das células, examinamos a apoptose e necrose em esferóides vivas cultivadas em 0,5% (Fig. 4) ou géis de 1,0% de agarose (Suplementar Fig. S3). No gel de 0.5%, a apoptose e a necrose apareceu quando os esferóides foram apenas ~ 50 um de diâmetro (fig. 4
Um
, dia 12) e continuou a aumentar, tornando-se por grande dia 28. Subsequentemente, a apoptose áreas foram gradualmente substituídos por necrose, até que, de dia 45, necrose quase tinha alcançado a superfície do esferóide. Em gel de agarose a 1,0%, o esferóide não pode crescer mais do que ~ 30 um de diâmetro, e a apoptose e necrose foram detectadas mesmo em pequenas estes esferóides (Recurso Fig. S3). Estas observações em esferóides vivos foram confirmadas por coloração imuno-histoquímica de amostras fixas (Fig. 4
B
). Além disso, houve uma forte correlação entre a fracção locais de morte celular em esferóides e a tensão local em gel de agarose (Fig. 5).
As setas indicam as regiões com mais proliferação celular. Barra de escala = 50 mm.
(
A
) O desenvolvimento da apoptose (verde) e necrose secundária (vermelho) em um esferóide crescente incorporado em gel de agarose 0,5%. Barra de escala = 100 pm. (
B
) coloração imuno-histoquímica (TUNEL e hematoxilina) confirmando os resultados em
A
. Imagem no painel inferior mostra o detalhe da área dentro da linha tracejada na imagem no painel superior. Barra de escala = 50 mm.
(
A
) esferóides ao vivo (verde) de diferentes formas, a sua morte celular interna (vermelho), e os seus campos de tensão circundantes visualizado por micro- grânulos (cinza). A linha verde na coluna da direita mostra a borda de esferóides. Barra de escala = 100 pm. (
B
) Relação entre a tensão local em gel de agarose (
ε
gel, 1, local) e fração de necrótica local em esferóides (
δ
sphd, local) para as duas esferóides mostrados na
a
. (
C
) Correlação entre a assimetria na fracção necrótico esferóide e na estirpe correspondente no gel de agarose em torno, que mostra que não há mais a morte celular ao longo da direcção de uma maior tensão de compressão. Cada ponto de dados é de um esferóide.
R
é o coeficiente de regressão linear; declive da linha de regressão é significativamente maior do que zero (
P
0,0001). Métodos de análise de imagem em
B Comprar e
C
são descritos em métodos complementares, Suplementar Fig. S2, S3 Filme e filme S4.
Para verificar se as limitações de nutrientes, fatores de crescimento ou de oxigênio não foram responsáveis pela morte celular por apoptose na Fig. 4, avaliamos a apoptose em esferóides crescido a tamanhos semelhantes em suspensão livre (gotículas suspensas). As culturas de suspensão livres não tinha matriz de confinamento externa e pouca apoptose (Fig. 6
A
, Condição 1). Para verificar se as interacções das células-agarose contribuíram para a morte celular, transferimos esferóides de suspensão livres em géis de agarose a 0,5% onde foram deixados a aclimatar durante 3 dias. Ao contrário de esferóides cultivadas a partir de células individuais em gel de agarose (Fig. 6
A
, Condição 3), os esferóides transferidos não têm tempo para acumular níveis significativos de stress contínuo, e eles tinham muito menos morte celular ( Fig. 6
A
, Condição 2). Assim, é pouco provável que a toxicidade gel ou limitações de nutrientes, factores de crescimento ou de oxigénio foram responsáveis pela apoptose observada nos esferóides estressadas.
(
Um
) Caspase-3 atividade (verde) em esferóides tumorais (vermelho) em cultura em suspensão livre (Condição 1), transferida para gel de agarose a 0,5% durante 3 dias após atingir patamar de fase em suspensão livre (condição 2), ou cultivada a partir de células isoladas em gel de agarose a 0,5% (condição 3 ). Barra de escala = 100 pm. (
B
) Quantificação da fracção de células em apoptose em esferóides tumorais cultivadas sob as condições 3 em
A
.
imita compressão aplicado externamente crescimento induzido pelo estresse
Se tensão de compressão provoca a morte celular por apoptose em esferóides tumorais, não deve importa se é induzido pelo crescimento ou aplicado externamente. Portanto, para quantificar o efeito do stress sólido na apoptose celular em condições controladas, primeiro monocamadas de células cancerosas comprimido durante 17 horas com as pressões que variam de 0 mmHg a 60 mmHg (ver configuração experimental em suplementar Fig. S1
B
) e observaram aumento da apoptose com o aumento do nível de estresse (Fig. 7
A
). Nós, então, transferidos esferóides cerca de 300 m de diâmetro a partir de suspensão livre em gel de agarose a 1% e cultivaram-los sob três condições: meio normal sem compressão externa, médio fome (sem glicose, sem soro e 1% de oxigênio) sem compressão ou médio normal com externo compressão (veja configuração experimental em suplementar Fig. S1
C
). Caspase-3 atividade foi avaliada em 1 hora, 3 horas, 5 horas e 7 horas (Fig 7
B, 7C
;. As vezes de compressão relativamente curtos foram escolhidos para minimizar o potencial de complicação de nutrientes /crescimento /fator de oxigênio limitações na cultura 3D). Compressão aumentou drasticamente a actividade da caspase-3, a qual estabilizou após 5 h. Esferóides que foram fome mas un-esforçado tinha muito menos apoptose do que aqueles nas amostras comprimidas, novamente indicando que as limitações de glicose, soro e oxigênio por si só não levam em conta os níveis de morte celular demonstrado na Fig. 4.
(
A
) aumenta a atividade da caspase-3 em monocamadas de células cancerosas em resposta a um maior estresse externo. As células foram comprimidos durante 17 horas. (
B
) a actividade da caspase-3 em esferóides produzidos a partir de duas linhas celulares de cancro diferentes em resposta ao stress externo diferente (0 mmHg ou 15 mm Hg) e as condições de nutrientes (normal: meio normal; fome: não glicose, nenhuma soro e 1% de oxigénio). (
C
) atividade da caspase-3 típica (verde) em esferóides (vermelho) cultivadas em 3 das condições em
B
. Barra de escala = 100 um. (
D
) Bcl-2 sobre-expressão inibe a apoptose induzida por estresse, mas crmA transdução não. Esferóides foram comprimidas com 15 mmHg durante 7 horas ao ser fornecido com meio normal.
A via mitocondrial regula a apoptose celular induzida por estresse mecânico em esferóides tumorais
Finalmente, nós investigamos o que, as duas principais vias apoptóticas [15], regula a apoptose celular induzida pelo stress sólido. Nós transduzidas células cancerosas para sobre-expressar crmA que inibe caspases iniciadoras incluindo a caspase-1 e caspase-8 na via do receptor de morte [16], ou a Bcl-2, um inibidor conhecido de várias caspases na via mitocondrial [17]. esferóides de suspensão isenta de tipo selvagem ou as células transduzidas cultivadas a -300 um de diâmetro foram transferidos em gel de agrose 1% e comprimida como se descreve antes. FIG. 7
D
mostra que a sobre-expressão de Bcl-2 reduz significativamente a morte celular induzida por compressão nos esferóides enquanto crmA sobre-expressão tem pouco efeito. Da mesma forma, a sobre-expressão de crmA em uma linha de células de carcinoma da mama de murídeo altamente metastático EMT6, que tem um elevado nível de endógena expressão de Bcl-2 [18], não protegeu mais de actividade da caspase-3 induzida por compressão (dados não mostrados), sugerindo que a via mitocondrial regula a apoptose induzida por estresse contínuo.
Discussão
o presente estudo abordou várias questões pendentes relativas ao efeito das tensões de compressão sobre a dinâmica de crescimento de tumores sólidos. Embora os modelos matemáticos empíricos tais como a curva conhecida Gompertziano crescimento [19] e a “lei do crescimento universal” mais recente [20] – [22] pode prever o alargamento de muitos tumores sólidos, com boa precisão, eles não consideram explicitamente celular dinâmicas no interior dos tumores. Em especial, o surgimento invariável de um fase de plateau após os tumores atingem um determinado tamanho nunca foi satisfatoriamente explicada. Como a maioria dos tumores sólidos maiores do que 1 mm de diâmetro induzir angiogénese [3], nutriente ou consumo de oxigénio não deve limitar o crescimento do tumor. O nosso estudo mostra que o stress sólido induzida por crescimento pode afectar o fenótipo celular e sugere que pode ser um “equilíbrio dinâmico” da proliferação e apoptose que mantém o tamanho do tumor na fase de planalto, tal como proposto por Holmgren et al [23].
A morte celular por apoptose causada por tal stress é de particular interesse. Apoptose durante o desenvolvimento geralmente é pensado para ser desencadeada por fatores de crescimento e outros estímulos ambientais [24], [25], bem como o papel do estresse mecânico neste processo só recentemente foi considerada [26], [27]. Os nossos resultados sugerem que as heterogeneidades nas propriedades mecânicas do tecido confinante pode orientar as alterações morfológicas no crescimento tumoral, independentes da migração de células, através da indução de apoptose em regiões de elevada tensão de compressão e permitindo a proliferação em regiões de baixa tensão. Além disso, a apoptose induzida por compressão ocorre via a via mitocondrial, um mecanismo de controlo regulador que as células cancerosas com elevada actividade de Bcl-2 pode escapar para produzir tumores malignos mais.
Materiais e Métodos
celular
cultura células de murídeo
não-metastáticas de carcinoma mamário 67NR foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) e foram usados para a maior parte das experiências no presente estudo. células metastáticas murino de carcinoma mamário EMT6 foram generosamente fornecer pelo Dr. James Freyer (Laboratório Nacional de Los Alamos, Los Alamos, NM). 67NR células foram mantidas em elevado teor de glucose (4,5 mg /ml) de Dulbecco meio de Eagle modificado (DMEM, Sigma, St. Louis, MO) suplementado com ácidos 1% não essenciais amino (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 10% de bovino fetal soro (FBS). células EMT6 foram mantidas em meio essencial mínimo alfa-(Mediatech, Manassas, VA) suplementado com 10% de FBS. Para as experiências que requerem isento de glicose, isento de soro e meio ambiente hipóxico (denotado o “meio de privação”), esferóides foram cultivadas em DMEM isento de glicose (Invitrogen) suplementado com FBS a não, e em 5% de CO
2-1% O
2-N
2 ar biomédica (Airgas Oriente, Salem, NH).
transdução Anti-apoptótica com Bcl-2 e crmA
Um milhão de células cancerosas foram semeadas em cerca de 10 cm de diâmetro e transfectou-se uma placa de Petri por meio de adição de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) e o ADN plasmídico que contém o comprimento total de Bcl-2 de murino (ATCC) ou modificador da resposta de citocinas a (crmA, oferta generosa do Dr. Brian semente no Massachusetts general Hospital, Boston, MA) de cDNA e o marcador seleccionável puromicina. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram passadas e adicionou-se meio de selecção contendo 20,0 ug /ml de puromicina. Depois de 7-10 dias de cultura neste meio, apenas algumas colónias permaneceu; estas foram reunidas e propagadas na presença de puromicina-nível selecção. A expressão de Bcl-2 e crmA nas células transfectadas foi determinada por quantitativa PCR em tempo real (Bcl-2) ou PCR (crmA) com os iniciadores apropriados. Uma vez que uma linha celular transfectada estável foi estabelecido, as células foram mantidas na presença de puromicina-nível selecção.
Os ensaios de PCR
Quantitative real-time PCR (ABI Prism 7300, Applied Biosystems, Foster City, CA) foi utilizado para determinar o nível de ARNm de Bcl-2 gene transfectado em células cancerosas. As condições dos ciclos térmicos consistiram em 35 ciclos de amplificação por PCR (desnaturação: 95 ° C 30 seg, emparelhamento /extensão: 68 ° C, 1 min). O nível de mRNA do gene crmA foi avaliada utilizando um ensaio de PCR convencional. Os seguintes iniciadores de sentido e anti-sentido foram concebidos utilizando o software Primer2 (Applied Biosystems): Bcl-2: 5′-GGGATGCCTTTGTGGAACTATATG e CTGAGCAGGGTCTTCAGAGACA-3 ‘; crmA: 5’-AAGCTTATGGATATCTTCAG e GCCTGCCGCTTAATTAGTTGT-3 ‘; e GAPDH:. 5’-ACAGCCGCATCTTCTTGTGCAGTG e GGCCTTGACTGTGCCGTTGAATTT-3 ‘
Cultura de esferóides tumorais co-integrado com micro-esferas em géis de agarose
Para monitorar crescimento de esferóides e acúmulo de estresse, quantidades apropriadas de GFP ou células marcadas com RFP individuais do cancro, de 1 um (diâmetro) esferas fluorescentes modificadas com carboxilato (Molecular Probes, Eugene, OR), 2,0% (w /v) de agarose (Tipo VII, de baixa temperatura de gelificação, Sigma, St. Louis , MO) solução de estoque (1X PBS) e meio de cultura de células foram misturados de modo a que as concentrações finais de células, micro-esferas e de agarose foram de 3,5 x 10
3 células /ml, 4,5 × 10
5 contas /ml e 0,5% ou 1,0%, respectivamente. A parte inferior de cerca de 10 mm x 2 mm (diâmetro x profundidade) cilíndrica bem em uma lâmina de vidro de 5 mm de espessura (feito à medida) foi revestido primeiro com 50 ul de gel de agarose isento de células de 1,0% para evitar a ligação de células. 300 ul da mistura de células /micro-esferas /agarose foi então adicionada ao recipiente e deixados a polimerizar durante 10 minutos à temperatura ambiente. A lâmina de vidro foi então colocada em um 100 mm x 25 milímetros de Petri cheio com 40 ml de meio de cultura celular (ver a configuração experimental em suplementar Fig. S1
Um
). O meio foi reabastecido a cada 5 dias.
Imagem e quantificação de compressão matriz em torno esferóides crescimento
Nós medimos o volume de esferóides crescimento ea distribuição 3D de suas vizinhas micro-esferas de todos os 5-7 dias usando um 500 sistema de microscópio confocal Olympus FlouView (Olympus, Center Valley, PA). Em cada ponto de tempo, um volume de 638 uM × 638 uM × 250 um foi representada por imagem de modo a que o equador do esferóide foi centrada na superfície inferior do volume; o tamanho do passo em Z foi de 1 uM. Três pilhas de imagens de controlo de micro-esferas foram então obtidos utilizando o mesmo processo, mas em zonas livres de esferóides nas proximidades de pelo menos 500 um de distância a partir de qualquer esferóide (de modo que a densidade do grânulo não foi afectada por compressão induzida por crescimento). Para determinar a densidade de micro-esferas local como uma função da distância a partir do esferóide, um Matlab (Mathworks, Natick, MA) de rotina calculada a distância mínima de cada micro-pérola para a superfície do esferóide e, subsequentemente, a densidade relativa do micro grânulos em 10 mm de espessura “conchas” em torno do esferóide (
ρ
contas, normalizados para a densidade de micro-esferas nas pilhas de imagens controle). A estirpe de gel de agarose nesses reservatórios é então calculada como
ε
gel = 1-1 /
ρ
esferas. Este procedimento preservado o efeito da variação microscópico em forma de superfície esferóide na deformação da matriz.
Cultura de esferóides de tumor na suspensão gotículas
Para criar esferóides tumorais para os experimentos de compressão aplicado externamente, foi utilizado o pendurado método de gotícula. Resumidamente, 20 gotas ul de suspensão de células do cancro (3,0 × 10
5 células /ml para 67NR e 2,0 × 10
5 células /ml para EMT6) foram adicionados para o interior de uma tampa de caixa de Petri de 10 cm de diâmetro . Depois de colocar a tampa de volta sobre o prato encheu-se com 10 ml de meio de cultura, a placa foi colocada na incubadora (5% de CO
2, 37 ° C) para permitir o crescimento dentro de cada gotícula esferóide. Esferóides geralmente atingiu cerca de 300 mm de diâmetro ao fim de 3 dias de cultura.
Compressão de monocamadas de células cancerosas e de tumor esferóides
para a compressão de monocamadas de células cancerosas, as células foram semeadas sobre a membrana de 6 poços inserir Transwell com poros 0,4 um (Corning, Lowell, MA). 1,5 ml e 2,5 ml de meio de cultura de células foram adicionados às câmaras superior e inferior do poço, respectivamente. Após incubação durante a noite (por adesão celular para a membrana), uma camada de gel de agarose a 1% 2 mm de espessura, foi colocado no topo das células e pistões de peso desejado foram, em seguida, aplicado sobre o gel de agarose por compressão (ver configuração experimental em suplementar Fig. S1
B
). Durante a compressão, os poros na membrana Transwell inserir permitido convecção de fluido para fora do gel e também a difusão de nutrientes, factores de crescimento e de oxigénio aos esferóides. Para a compactação de esferóides tumorais, os esferóides cultivadas em gotículas de suspensão foram recolhidos e re-suspensos em solução de agarose a 1,0%. 1 ml da solução foi, em seguida, adicionados a um de 6 poços inserir Transwell com 0,4 um poros na sua membrana, fazendo com que a espessura de gel de ~ 2 mm. A mistura esferóide-agarose foi deixada a gelificar durante 20 min à temperatura ambiente, após o que 1,5 ml e 2,5 ml de meio de cultura de células foram adicionados às câmaras superior e inferior do poço, respectivamente. A construção esferóide-gel foi então comprimida com um pistão de peso desejado (veja configuração experimental em Suplementar Fig. S1
C
).
Coloração e imagem da proliferação, caspase-3 atividade e necrose em esferóides tumorais
as células em proliferação em esferóides foram detectadas com um kit de proliferação de células de fluorescência (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido) por protocolo do fabricante. Resumidamente, esferóides foram marcadas com um reagente de marcação BrdU, fixo (1% de formalina, 0,1% de Triton em PBS), incubou-se com um anti-BrdU reagente /nuclease e finalmente incubadas com IgG de ratinho marcado com Cy5 anti cabra. A caspase-3 e necrose actividade em células cancerosas ou esferóides foram detectados com 488 Nucview caspase-3 Kit de Ensaio de células vivas (Biotium, Hayward, CA) e iodeto de propídio (PI, Molecular Probes, Eugene, OR), respectivamente. As monocamadas de células foram coradas durante 15 min e esferóide-gel construções coradas durante 45 minutos a 4 ° C e lavadas duas vezes com meio fresco. As células marcadas foram fotografadas usando um microscópio confocal sistema 500 Olympus FlouView (Olympus, Center Valley, PA). Os resultados foram quantificados como a percentagem de 3 caspase-células /PI positivas na população.
ensaios imunohistoquímicos para apoptótica em esferóides tumorais
esferóides foram fixados em paraformaldeído a 4% durante 4 horas e, em seguida embebidos em parafina. 5 uM secções foram cortadas a partir dos blocos de parafina e as células cancerosas foram coradas para a apoptose com ApopTag® (Chemicon International, Temecula, CA). As células foram contra-coradas com hematoxilina.
Estatísticas
Os valores foram caracterizadas por média aritmética e erro padrão da média (SEM). diferenças significativas entre diferentes populações de dados foram testados com Student
t
-teste para observações desemparelhados.
Informações de Apoio
métodos suplementares S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0004632.s001
(0.05 MB DOC)
Figura S1.
montagens experimentais. esferóides (A) de tumor A cultura co-integrado com micro-esferas de gel de agarose. (B) A aplicação exógena, bem definida tensão de compressão a uma monocamada de células cancerosas. (C) A aplicação exógena, bem definida tensão de compressão de esferóides tumorais cultivadas até o tamanho desejado em gotas penduradas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s002
(14.63 MB TIF)
Figura S2 .
Análise de imagens 2D. (A-L) Quantificar a deformação local num esferóide de tumor (verde, transdução GFP) e a correspondente tensão local em gel de agarose utilizando o micro-grânulos (vermelho). (H-K) Quantificar fração locais da área necrótica (vermelho, coloração de iodeto de propídio) em um esferóide (verde, transdução de GFP). (L) Correlacionando as assimetrias na forma esferóide e em tensão gel. (M) Correlacionando as assimetrias em necrose esferóide e em tensão gel
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s003
(5.25 MB TIF)
Figura S3.
O desenvolvimento da actividade da caspase-3 (verde, coluna da esquerda) e da necrose (vermelho, coluna central) no crescimento de tumor (esferóides da imagem transmitida, sobreposto com os caspase-3 e necrose imagens, coluna da direita) em 1% de agarose. Barra de escala = 20 mm
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s004
(7,48 MB TIF)
Filme S1. prestação
3D de um esferóide oblato tumor cultivadas em gel de agarose 0,5%
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s005
(3.13 MB MOV)
Filme S2. A análise de imagem
quantificar locais deformação esferóide tumor
doi: 10.1371 /journal.pone.0004632.s006
(0,45 MB MOV)
Filme S3. A análise de imagem
para quantificar a tensão local em gel de agarose causada pelo crescimento de esferóides tumor
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s007
(0,56 MB MOV)
filme S4. A análise de imagem
para quantificar a morte celular local no esferóide tumor
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s008
(0,31 MB MOV)
Reconhecimentos
agradecer Drs. Patrick Au, Yves Boucher, Emmanuelle di Tomaso, Igor Garkavtsev, Shan Liao, Tim Padera e Lei Xu (Hospital Geral de Massachusetts, Boston, MA) para contribuir experiência com este estudo, Dr. Brian Sementes (Hospital Geral de Massachusetts, Boston, MA ) para os plasmídeos CRMA e Dr. James Freyer (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM) para as células EMT6.