Abstract

Há uma necessidade urgente de obter e validar alvos altamente eficazes para a intervenção combinatória dos esforços de caracterização em larga escala em curso moleculares de tumores. Nós estabelecemos um in silico plataforma de bioinformática em conjunto com uma plataforma de triagem de alto rendimento avaliando 37 novos direcionados agentes em 669 linhas celulares de cancro extensivamente caracterizadas reflectindo a diversidade genômica e do tipo de tecido de cancros humanos, para identificar sistematicamente biomarcadores combinatórias de resposta e de co-acionável alvos em câncer. biomarcadores genômicas descobertos em um conjunto de linha de formação 141 células foram validados em um conjunto de linha de teste 359 da célula independente. Foram identificados co-ocorrência e eventos genômicas mutuamente exclusivos que representam potenciais motoristas e metas combinatórios em câncer. Nós demonstramos vários eventos genômicas cooperantes que predizem a sensibilidade à droga intervenção independente da linhagem tumoral. O acoplamento de escalável in silico e plataformas de linha de células de câncer biológicos de alto rendimento para a identificação de co-eventos no cancro proporciona alvos combinatórias racionais para abordagens letais sintéticos com um elevado potencial de antecipar-se a emergência de resistência.

citação: Tabchy A, Eltonsy N, Housman dE, Mills GB (2013) identificação sistemática dos Drivers Combinatória e Metas em linhas celulares de cancro. PLoS ONE 8 (4): e60339. doi: 10.1371 /journal.pone.0060339

Autor: Mark Isalan, Centro de Regulação Genômica, Espanha |

Recebido: 25 de outubro de 2012; Aceito: 25 de fevereiro de 2013; Publicação: 05 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tabchy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) U54 CA112970 a GBM (https://www.nih.gov/), um subsídio Komen Promise (KG08109903) para GBM e concessão Komen Proteomics Discovery (FAS0703849) para AT e GBM (http : //ww5.komen.org/), um programa do 01 concessão Entertainment Industry Foundation SU2C-AACR-DT0209 para GBM (https://www.standup2cancer.org/) e apoio da GSK para GBM (http: //www.gsk.com/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. GBM recebeu pesquisa patrocinada da GSK para determinar marcadores moleculares prevendo resposta a inibidores da via PI3K. GBM tem o apoio da Exelixis, Celgene, Wyeth e Astra Zeneca para determinar a resposta aos medicamentos que não estão envolvidos neste estudo. GBM está no Conselho Consultivo de oncologia da Astra Zeneca. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Os outros autores declaram que não há interesses concorrentes.

Introdução

Um dos principais desafios emergentes na esteira do tsunami de dados gerados pelos esforços para caracterizar tumores no nível molecular (por exemplo, o Cancer Genome Atlas [ ,,,0],TCGA] (https://www.cancergenome.nih.gov) e International Cancer Genome Consortium [ICGC] (https://www.icgc.org)) é como aproveitar os dados e traduzi-lo em melhores resultados clínicos, por identificar a base molecular do câncer em pacientes individuais e, posteriormente, usando essas lesões moleculares como alvos para intervenção eficaz. Ao mesmo tempo, a redução dos custos de sequenciação que conduzem à

democratização

de testes moleculares já está resultando em muitos pacientes que têm os seus tumores digitado a um nível molecular. Os esforços de caracterização do tumor não são mais a limitação de taxa; sim como interpretar e “agir” sobre os dados é agora o principal fator limitante. Estes desafios devem ser superados antes de emergir avanços tecnológicos na caracterização do tumor pode entregar impacto clínico máximo. Um passo fundamental no processo é a identificação de biomarcadores que predizem a resposta ao tratamento e a análise de aberrações moleculares condução acionáveis ​​de ruído. Estes desafios podem ser resolvidos através da implementação de algoritmos que ajudam a analisar os dados, em paralelo ao estabelecimento de sistemas modelo humanizado de grande escala para a descoberta alvo alto rendimento e de validação que também irá informar uma droga desenvolvimento acelerado e processo de ensaio clínico. biomarcadores preditivos robustos para a medicina molecular combinatória são urgentemente necessários para mudar a paisagem ensaio clínico a partir do estado atual de baixa eficácia terapêutica em grandes ensaios clínicos e populações não selecionadas, de alta eficácia pequenos ensaios clínicos enriquecido para populações-alvo. Esta abordagem tem o potencial de fazer ensaios clínicos menor, mais rápido e mais barato, enquanto aumenta os benefícios para pacientes individuais.

Assim biomarcadores impulsionado muito simples intervenções tiveram sucesso limitado na clínica. sucessos iniciais com agentes terapêuticos alvo em tumores “viciado-oncogene” [1] – [4] (por exemplo, imatinib em doentes com LMC; inibidores BRAF em melanomas) ter sido temperada pela realização de uma série de limitações: (1) o surgimento de resistência devido à heterogeneidade câncer, com clones pré-existentes demonstrando variação no alvo molecular que leva a resistência clínica (selecção clonal); (2) a resistência inicial dos tumores, devido à co-mutação numa via de resistência; e (3) a resistência devido ao feedback homeostático loops que restabelecer o estado de equilíbrio da linha de base perturbado pela intervenção orientada [2] – [6]. Assim, parece que os biomarcadores e /ou intervenções individuais podem ter um potencial limitado para o sucesso na clínica. Da mesma forma que gerimos fatais infecções bacterianas ou virais (por exemplo, tuberculose, Vírus da Imunodeficiência Humana) com múltiplos antibióticos simultâneas [7] – [9], a terapia bem sucedida para o câncer, que tem toda a versatilidade e robustez do repertório eucariótica de respostas à sua disposição, provavelmente irá exigir várias intervenções direcionadas simultâneas para antecipar o aparecimento de resistência. Aqui propomos um quadro para a identificação racional dos vários drivers que cooperam para produzir o fenótipo câncer, e poderia, então, ser usado como alvos eficazes para intervenção terapêutica combinada.

linhas celulares de cancro de perto recapitular conhecido tumor-associado genética anormalidades fornecendo modelos para doenças humanas. Por exemplo, linhas celulares derivadas de cancro da mama têm sido mostrados para recapitular fielmente as características genómicas de tumores primários, com amplificação do gene HER2 correlacionando-se com sensibilidade trastuzumab, tanto in vitro como em pacientes [10], demonstrando que as correlações genótipo-resposta clinicamente observados são conservados em modelos de linhas de células cancerosas. Aqui nós realizar uma busca sistemática de co-eventos genômicas que são selecionados durante o início ou progressão do câncer, e se alvo juntos poderiam significativamente melhorar os resultados dos pacientes. Nós demonstramos um na plataforma silico para a identificação de motoristas de câncer de co-ocorrência e biomarcadores de resposta e sua aplicação como prova de conceito em um conjunto de linha de 669 células altamente caracterizado tratada com 37 novos agentes direcionados. biomarcadores preditivos identificados em um conjunto de linha de formação 141 células foram validados em um conjunto de linha de teste 359 da célula independente. Propomos que um gasoduto composto por uma robusta in silico plataforma de bioinformática acoplado a uma plataforma de linha de células de câncer de alto rendimento para a descoberta de genômica funcional e de validação poderia atuar como uma ponte entre os esforços de caracterização como o TCGA /ICGC em uma extremidade e as clínica /ensaios clínicos por outro.

dados Métodos Resumo

resposta drogas gIC50 para um total de 37 compostos alvo testado em 669 linhas de células que representam a diversidade genômica de tipos de câncer humano, especificamente 23 compostos testados em 310 células linhas (GSK conjunto), e 14 500 compostos testados em linhas celulares (McDermott conjunto) foram obtidos a partir de bases de dados públicas (Fig. 1) [11] – [13]. As curvas de resposta de drogas foram gerados e pontos de inflexão foram matematicamente determinado com base em modelos de alta ordem da curva polinomial e definiu sensível vs linhas de células resistentes para cada droga (Fig. S1 no arquivo S1). As linhas celulares foram genótipo principalmente SNP correspondido ao banco de dados Linha celular do Genoma do Câncer do Instituto Sanger para vincular dados de sensibilidade às drogas em linhas de células para dados de caracterização genômica disponíveis a partir Sanger [14], incluindo o estado de mutação do pleno exons que codificam sequenciamento de 64 genes de câncer comumente mutados (incluindo número de cópias), e copiar dados do número de Affymetrix SNP matriz 6.0 em 419 genes [14]. Um evento genómico foi definido como uma mutação e /ou um número de cópias aberração num determinado gene. Esperado e observado frequência co-evento foram gerados nas linhas de células sensíveis e resistentes e colegas de recursos genômicos que estavam em desequilíbrio capturado através de testes de significância multi-camadas estatística e biológica e validação cruzada produzindo eventos co-selecionados e mutuamente exclusivos altamente significativos, incluindo características genómicas e de linhagem na população linha de células e para cada fármaco (Fig. 2). Os biomarcadores genômicas descobertos em um treinamento linha 141 da célula definidos foram independentemente validados em uma sobreposição não-conjunto de teste independente de 359 linhas de células exibido em 14 dos compostos.

GSK conjunto é de 310 linhas de células, informação genômica disponíveis no 294. McDermott conjunto é de 500 linhas de células, informação genômica disponíveis no 366. as linhas 141 celulares comuns aos GSK e McDermott foram usados ​​como um conjunto de treinamento, informação genômica disponíveis no 139.

enredo do diferença entre as frequências (

Observado – prevista) Compra de todos os potenciais eventos genômicas duplas nas linhas de células 294. Com base em 262 genes distintos afectados, houve um total de 34,191 acontecimentos genómicos potenciais que envolvem dois genes. As diferenças negativas mais afastadas zero (cauda esquerda) são mutuamente exclusivas, eventos diferenças positivas mais afastadas zero (cauda direita) são eventos co-selecionados. Os eventos significativos da cauda esquerda e direita são encontrados na Tabela 3 e Tabela S5 no S3 Arquivo

Métodos

Declaração de Ética:. N /A.

linha celular Crescimento Ensaios de Inibição

Dados a partir de 23 compostos GSK testados em até 310 linhas celulares (variação linhas 187-273 celulares rastreados por drogas, média = 228 linhas de células por drogas) foram baixadas a partir de recursos fornecidos a partir de Greshock e colegas e Kim e seus colegas (GSK set) [11], [13], e dados de 14 compostos adicionais testados em até 500 linhas celulares (intervalo 244-500, média = 460 linhas de células) foram baixadas a partir de recursos fornecidos por McDermott e colegas (McDermott set) [12] (Fig. 1). Tanto o conjunto GSK e McDermott de linhas celulares representam o espectro diversificado de tipos de tumor no câncer humano, com 23 e 21 linhagens de câncer, respectivamente, de células epiteliais, mesenquimais e hematopoiéticas origens. Para o conjunto GSK, Wooster e colegas obtiveram um total de 311 linhas celulares de cancro originais de vários fornecedores (American Type Culture Collection; Programa Therapeutics Desenvolvimento, Instituto Nacional do Câncer; Centro de Recursos alemã de Material Biológico, e Colecção Europeia de Culturas de Células Animais), em seguida, cresceu para meios de cultura padrão recomendado pelo fornecedor; linhas celulares onde autenticados pelo SNP fingerprinting em Affymetrix 500 K ‘SNP Chip’, como descrito anteriormente [11]. Para o conjunto McDermott, linhas celulares de cancro humano foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC), a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), a coleção japonesa dos recursos biológicos de Investigação (JHSF), ou European Collection of Cell Cultures (ECACC) e cultivadas de acordo com protocolos padrão como descrito anteriormente [12]. ensaios de inibição de crescimento de linha celular foram realizadas como descrito anteriormente [11], [12]. Resumidamente, para o conjunto de GSK, o ponto médio da janela do crescimento (o gIC50) desce a meio caminho entre o número de células no momento da adição de composto (T = 0) e o crescimento de células de controlo tratadas com DMSO a 72 horas. O valor gIC50 (concentração de fármaco, nmol /L) é uma métrica para medir a inibição da proliferação nas células cancerosas. Do mesmo modo, no conjunto McDermott,

viabilidade celular

de cada linha de células a uma dada concentração do composto foi calculada como a fracção de células viáveis ​​de células não tratadas presentes após 72 horas de tratamento (razão). Nós enviamos aqui para gIC50 (GSK set) e viabilidade celular (conjunto McDermott) como Inibição do Crescimento (GI) valores. Em ambos os conjuntos, quanto menor o valor GI mais sensível é a linha de células a uma droga específica.

Curves resposta à droga e Determinação da Resistência vs linhas de células sensíveis

Nós sistematicamente identificados sensível vs células resistentes linhas para cada droga. A sensibilidade e a resistência não são propriedades intrínsecas das linhas de células, mas são definidos em relação a uma droga específica. Para cada droga, nós classificamos ordenada e plotados os valores de IG para a população linha celular. O conjunto GSK incluiu 310 linhas celulares. O conjunto McDermott incluiu 500 linhas celulares testados em 14 compostos: as 141 linhas de células que eram comuns aos conjuntos McDermott e GSK foram usados ​​como um conjunto de treinamento; as 359 linhas de células remanescente que não se sobrepõem (500-141 = 359) foram usados ​​como um conjunto de teste para validar os nossos resultados com os dados fornecidos por compostos 14 McDermott (Fig. 1). Com base na determinação do primeiro “ponto de inflexão”, que corresponde à área em que o gráfico desvia abruptamente na zona central plana da curva (Fig. S1 no ficheiro S1), a população linha de células foi dividido em dois grupos, o mais cedo parte da curva definiu as linhas sensíveis com baixos valores de GI (antes do ponto de inflexão), e a parte plana da curva e além de linhagens resistentes definidos com valores de IG mais elevadas (após o ponto de inflexão). Isso garante que as linhas celulares que são definidas como sensíveis têm baixos valores de GI e uma sensibilidade diferente, em seguida, o resto das linhas celulares testadas para essa droga. A parte central plana da curva contém linhas de células com valores de IG semelhantes, que corresponde à área de frequência do pico numa curva de distribuição normal quando a frequência é representada graficamente contra os valores de GI. Esta abordagem também garante a captura eficaz de pequenos subconjuntos de linhas celulares outlier com respostas marcadas devido à genótipos sensibilizadores de drogas de baixa frequência. A curva de resposta à droga foi modelado matematicamente como uma curva polinomial de ordem superior; o primeiro “ponto de inflexão” foi determinado graficamente como o primeiro exemplo de a maior mudança na inclinação (declive representa a primeira derivada) da curva de resposta à droga, ou seja, a primeira ocorrência do maior valor absoluto para a segunda derivada da curva ( primeiro extremo). pontos de inflexão foram determinados de forma independente para cada composto no conjunto GSK, e nos conjuntos de treinamento e teste para compostos no conjunto de McDermott, respectivamente. No conjunto de GSK, o valor mediano gIC50 no ponto de inflexão foi 659 nM, com uma gama de 16-3955 nM. No conjunto McDermott, foi utilizado como ponto de corte o ponto de inflexão ou um valor de GI de 0,78, o que deu a maior sensibilidade (IG menor): para o conjunto de treinamento, o corte médio foi de 0,69, com uma gama de 0,51-0,78; para o conjunto de teste, o corte médio foi de 0,74, com uma gama de 0,50 a 0,78.

impressão digital baseada em SNP usado como Endereço robusta para a linha celular referência cruzada

Para realizar genótipo correlações de resposta, nós ligados informação genômica (mutações e aberrações no número de cópias) em linhas de células de uma dados separados definidos para seus perfis de resposta (GI). Para evitar possíveis problemas com a nomeação de linhas celulares e de contaminação, foi utilizada a impressão digital única SNP de cada linha de células (GSK set) para referências cruzadas e correspondentes linhas celulares em bancos de dados. análise do genótipo do conjunto linha de células GSK 310 foi realizada por SNP fingerprinting em Affymetrix 500 K ‘SNP Chip’, como descrito anteriormente [11]. Resumidamente, as impressões digitais de SNP das linhas celulares foram comparadas entre si e com a impressão digital SNP gerado pela linha Cancer Project genoma da célula do Instituto Wellcome Trust Sanger, como descrito anteriormente, com as linhas celulares que possuem 80% de identidade considerada uma combinação genética. Havia 283/310 linhas de células geneticamente distintas no conjunto GSK. ensaios de viabilidade celular para 25 dos 37 compostos foram restritos às linhas de células geneticamente distintas. Um total de 256/310 linhas celulares foram encontrados a ter um jogo genótipo no banco de dados de Sanger. Das partidas genótipo, 233/256 também acompanhado por nome, e para aqueles que não se encontraram por nome (n = 23), a associação dos genótipos entre os nomes haviam sido registrados anteriormente (https://www.sanger.ac.uk /genetics/CGP/Genotyping/synlinestable.shtml). Para as 54 linhas de células restantes (310-256), 38 foram pareados por nome para o banco de dados Sanger, e 16 permaneceram sem igual (Tabela S1 S3 Arquivo). nomes linha celular foram analisados ​​manualmente. Foram tomadas novas medidas para assegurar a coerência entre nomes de linha celular e qualquer duplicação em casos eram de sintaxe ou de pontuação diferenças ocorreram entre os nomes ou apelidos. Para o conjunto de contagem 500 McDermott linhas celulares, as 141 linhas de células que eram comuns aos conjuntos McDermott e GSK como pareados por nome foram utilizadas como um conjunto de treino, e os restantes não sobrepostos 359 linhas de células foram utilizadas como um conjunto de teste. As linhas de células no conjunto de teste, onde uma associação genótipo a uma linha de células no conjunto de treino tinha sido previamente gravada foram removidos a partir do conjunto de teste; Adicionalmente, linhas de células dentro do teste definido quando uma associação genótipo tinha sido previamente gravada (duplicados internas) foram removidos com um representante da linha de células remanescente. Assim, 348 linhagens celulares distintas permaneceu no conjunto de teste. Um total de 216/348 linhas celulares foram pareados ao banco de dados Sanger, e 132 continua inigualável (Tabela S2 no S3 Arquivo). As características genômicas das linhas de células correspondentes no Projeto Sanger Cancer Genome foram baixadas (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/) para a GSK e McDermott define, respectivamente; um banco de dados com curadoria dos eventos genômicas em cada linha celular foi compilado (Tabela S3 no S3 arquivo para o conjunto e treinamento conjunto GSK, n = 310-16 = 294; Tabela S4 no arquivo S3 para o conjunto de teste, n = 216) com base em dados de sequenciamento para a resolução de pares de bases dos exons codificantes completas de 64 genes de câncer comumente mutados, e análise de todo o genoma de cópia ganho número e perda usando Affymetrix SNP 6,0 microarrays e o algoritmo de piquenique para prever segmentos número de cópias em 419 genes (incluindo os 64 genes acima), baixado a partir Sanger Projeto do Genoma do Câncer, Catálogo de somáticas mutações em Câncer (liberação v51 COSMIC) [14]. Um evento genómico foi definido como uma mutação (que codifica variante de sequência), e /ou um número de cópias aberração [a deleção homozigótica (número total de cópias = 0) ou uma amplificação (número = 8)] em um determinado gene . Os termos de evento genômica e mutação são utilizados indiferentemente no texto para representar uma aberração em um local genômica específica.

Identificar Genomic Co-eventos de relevância

Se os eventos genômicos (ou seja, mutações, número do exemplar aberrações) são distribuídos aleatoriamente na população de linhas celulares, e dois eventos co-ocorrem numa linha celular de forma independente uns dos outros e devido à sozinho factores fortuitos, e o seu co-ocorrência não colocar a célula em uma vantagem selectiva ou desvantagem, em seguida, a taxa de co-mutação previsto na população é o seguinte:

taxas de co-mutação observados foram comparados com as taxas de co-mutação previstos; Co-mutações que ocorrem

superior ou inferior a

previsto pelo acaso foram determinados em um nível de significância de P = 0,05 pelo teste do qui-quadrado de Pearson. Estes desvios da aleatoriedade são provavelmente devido a pressões seletivas. Especificamente, para identificar colegas de eventos que foram associados com a resposta à droga, que comparou previsto para frequências observadas para cada droga em subpopulações sensíveis e resistentes, respectivamente (teste do qui-quadrado). Quando co-mutações relevantes foram determinados em subpopulações sensíveis e resistentes, em adição ao teste do Qui-quadrado para a significância estatística, um rácio de frequências observadas em sensível contra linhas resistentes foi calculada (S /R) com uma mudança vezes maior do que 1,5 [ ,,,0],0,667-1,5] a ser utilizado como um segundo critério de selecção. Estas abordagens foram aplicadas ao treinamento e teste define respectivamente.

Análise de Dados e Clustering

software Cluster

foi usada para ajustar os dados GI antes de agrupamento hierárquico. Para cada um dos 37 compostos, valores de IG foram os primeiros mediana centrado então normalizado; este produz uma contagem de inibição de crescimento que é dimensionado um meio independente de potência de comparação de perfis de resposta entre os compostos. Os dados foram então agrupadas hierarquicamente utilizando a correlação de Pearson como uma métrica com base na distância média entre os nós. TreeView foi usado para visualização dos aglomerados resultantes. O Cluster e software Treeview estão disponíveis a partir do laboratório Eisen (https://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm) [15].

Análise Estatística

O teste do qui-quadrado de Pearson ( para colegas de eventos) e teste exato de Fisher (para eventos individuais) foram usadas para atribuir valores de dois lados P no intervalo de confiança de 95% para descrever as correlações entre mutações genéticas /número aberrações de cópia e de sensibilidade às drogas. Para a determinação dos acontecimentos genómicos individuais estatisticamente significativa, com apenas alguns testes executados, este obviada a necessidade de se corrigir para as comparações múltiplas. (. Tabela S5 em arquivo S3 e Fig 2) quando o espaço de dois colegas de eventos foi determinada nas linhas de células 310, um limite de correção de vários testes Benjamini-Hochberg com taxa de descoberta de falsas (FDR) de 5% foi aplicado; mais de 92% dos resultados permaneceu significativa após a correção. Mesmo que por razões teóricas que se aplicam a mais rigorosa correção de testes múltiplos, a correção de Bonferroni altamente conservador, para o espaço não filtrada total de todos os observados 6871 duplos co-eventos, com 6871 testes executados, 65% dos resultados permaneceu significativa após a correção foi aplicado. Mais importante, as nossas previsões biomarcador para-eventos co individuais e foram independentemente validados em um conjunto de teste não-superposição independente de 359 linhas celulares testados em 14 compostos que compõem o McDermott definido.

Resultados

Unsupervised Clustering of Drug Response em linhas celulares Recapitulates Caminho alvos de medicamentos específicos e Drivers

em primeiro lugar, determinado se o agrupamento não supervisionado da sensibilidade de 310 linhas de células cancerígenas humanas a 37 medicamentos direcionados poderia recapitular mecanismos de droga conhecidos de ação e também o molecular base de resposta em linhas celulares altamente caracterizados. Isto é visualizado na Fig. 3 para uma visão global da resposta de linha de células da droga (e Fig. S2 no arquivo S1). As Figs. S3, S4 em S1 Arquivo visualizar as imagens de clustering para a GSK (23 drogas) e os conjuntos McDermott (14 drogas) separadamente; a análise independente reduz o ruído introduzido por meio da análise de 37 compostos e a fusão de dois conjuntos de dados independentes com diferentes abordagens obtendo-se assim um agrupamento mais apertado das classes alvo funcionais. Com efeito, os fármacos agrupadas no eixo vertical de acordo com o seu alvo molecular principal conhecida. Por exemplo, um conjunto de IGF1R alvo drogas estruturalmente divergentes agrupados em estreita proximidade na Fig. 3 e fig. S3 no arquivo S1, com um coeficiente de correlação de 0,78 para o subgrupo IGF1R representado. agrupamento hierárquico também recapitulou alvos de drogas dentro de percursos, definindo assim as intervenções específicas caminho que pode efetivamente modulam as vias oncogênicas aberrantes. Isto foi evidente no agrupamento apertado das drogas que têm como alvo a via PI3K /AKT /mTOR, na Fig. 3 e fig. S3 no ficheiro S1, como GSK2126458 [PI3K], GSK690693 [AKT], Temsirolímus [mTOR], TGX-221 [PI3K-beta], IC8