Abstract

Apesar dos progressos em terapias loco-regionais e sistêmicos, a sobrevida do paciente de cancro do pulmão continua a ser um desafio. As tirosina quinases receptoras são frequentemente implicado na patogénese do cancro do pulmão, e algumas estratégias de inibição da tirosina quinase têm sido eficazes clinicamente. A tirosina quinase do receptor EphB4 foi recentemente emergiu como um alvo potencial em diversos outros tipos de cancro. Procurou-se estudar sistematicamente o papel de EphB4 no câncer de pulmão. Aqui, demonstramos que EphB4 é sobre-expresso de 3 vezes em tumores de pulmão, em comparação com tecidos normais, emparelhados e frequentemente exibe gene Número de cópia aumenta no cancro do pulmão. Também mostram que a sobre-expressão de EphB4 promove a proliferação celular, a formação de colónias, e a motilidade, enquanto que a inibição de EphB4 reduz a viabilidade celular

In vitro

, interrompe o crescimento de tumores estabelecidos em modelos de xenoenxerto de ratinho quando usada como uma estratégia-alvo única , e causa regressão quase completa de tumores estabelecidos, quando usado em combinação com paclitaxel. Tomados em conjunto, estes dados sugerem um papel importante para EphB4 como um potencial novo alvo terapêutico no cancro do pulmão. Os ensaios clínicos que investigam a eficácia de terapias anti-EphB4, bem como terapia de combinação envolvendo inibição EphB4 pode ser justificado

Citation:. Ferguson BD, Liu R, Rolle CE, Tan Y-HC, Krasnoperov V, Kanteti R, et ai. (2013) O EphB4 receptor da tirosina quinase promove Lung Cancer Crescimento: A Novel Potencial Terapêutico Target. PLoS ONE 8 (7): e67668. doi: 10.1371 /journal.pone.0067668

editor: Todd W. Miller, Dartmouth, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de fevereiro de 2013; Aceito: 21 de maio de 2013; Publicação: 02 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ferguson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado em parte pelo NIH /NICHD T32HD009007, “Formação Pós-graduação em Crescimento e Desenvolvimento” (BDF), ASCO Award Translational (EEV), NIH /NCI R01 CA 129501 05 (RS), e Cancer Research Foundation Janice Cordeiro McArdle (RS ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. PSG é o co-fundador e diretor do Vasgene Therapeutics, Inc. VK é um funcionário de Vasgene Therapeutics, Inc. Existem patentes e produtos em desenvolvimento, mas não os produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores. Os demais autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

Apesar de numerosos alvos de drogas têm sido estudados extensivamente, a sobrevida global de câncer de pulmão melhorou apenas minimamente ao longo das últimas quatro décadas [1 ]. Uma característica comum de cancro do pulmão é uma aberração no qual uma ou mais tirosina quinases receptoras (RTKs), tais como o TEM, EGFR, e ALK, são geralmente sobre-expresso, amplificado, mutado ou [2] – [4]. A família Eph é a maior família de RTK, que compreende catorze receptores de mamífero que interagem com ligandos de mamíferos, oito ou efrinas. receptores Eph e ligandos efrina são organizados funcionalmente e estruturalmente em A- e B-classes [5]. receptores Eph são relativamente semelhantes em todas as classes; No entanto, os ligandos ligados à membrana efrina-B são únicas na medida em que possuem domínios extracelulares que activam os receptores, bem como domínios intracelulares que se pensa sinalizar a jusante dentro de uma célula adjacente [6]. Há alguns promiscuidade entre as interacções do receptor e do ligando; uma das interações receptor-ligante mais específicos, no entanto, está entre EphB4 e ephrin-B2 [7].

Classicamente, receptores Eph têm sido os principais jogadores em biologia do desenvolvimento dadas as suas funções na orientação axônio, vasculogénese, e desenvolvimento neural [8]. No entanto, vários membros da família de receptor Eph também demonstraram desempenhar um papel no cancro. Temos demonstrado recentemente que EphA2 é sobre-expresso em cancro do pulmão e abriga uma mutação de ganho de função de ponto de em alguns carcinomas de células escamosas, e inibição EphA2, além de rapamicina exposição em células de câncer de pulmão reduzida a sua proliferação

in vitro

[9]. EphB4 também tem sido relatada a desempenhar um papel oncogénica em cancros da cabeça e pescoço [10], [11], da próstata [12], [13], os outros órgãos geniturinário [14] – [19], da mama [20], mesotélio [21], esôfago [22], a pele [23], e intestino grosso [24], [25]. mutações EphB4, recentemente, também foram relatados no câncer de pulmão [26], [27], embora o seu significado é actualmente desconhecida. No entanto, não tem sido sistematicamente estudado em câncer de pulmão e seu potencial papel na doença, portanto, continua a ser uma questão importante.

Aqui, mostramos que EphB4 é um importante alvo terapêutico no cancro do pulmão, uma vez que é abundante e muitas vezes demonstra o aumento do número de cópias do gene. Além disso, knockdown ou inibição de EphB4 atenua o crescimento do câncer de células

in vitro

e

in vivo

, enquanto introdução de tipo selvagem EphB4 proporciona um ganho de função nas células tumorais. Tomados em conjunto, estes dados identificar EphB4 como motorista potencialmente importante na patogênese do câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Os tecidos tumorais foram documentadas, juntamente com as características do paciente quando disponível, com consentimento informado por escrito e de acordo com o protocolo da Universidade de Chicago Institutional Review Board-aprovado. Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade da Califórnia do Sul e realizada de acordo com os regulamentos Animal Welfare Act.

Reagentes e anticorpos

Todos os iniciadores foram projetados usando Primer3Plus [28] e comprado de Tecnologias de DNA integrados (Coralville IA). Os anticorpos anti-EphB4 (# 265 para IB e # 131 para IHC), anticorpo anti-ephrin-B2 (# 2B5) e soro humano albumina conjugada EphB4 solúvel (sEphB4-HSA), foram generosamente fornecidos pelo Laboratório Gill, Universidade of Southern California. proteína quimérica /Fc Efrina-B2 foi adquirido a R D (Minneapolis MN). Anti-ß-actina de anticorpo foi adquirido a partir de Sigma (St. Louis, MO). AZ12489875-002 foi uma oferta generosa da AstraZeneca. SN-38 foi adquirido de Tocris Bioscience (Bristol UK).

Cultura de Células

A549, H358, H522, H661, H1703, H1993, H2170, SW1573, BEAS-2B, H69, H82 , H184, H249, H345, H446, H526, H2171, e de células PC3 linhas foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas VA. as linhas celulares foram autenticado pela ATCC e são rotineiramente testados para a presença de micoplasma. Todas as linhas celulares eram mantida a 37 ° C e 5% de CO2 em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% de penicilina /estreptomicina, 2% de bicarbonato de sódio, 1% de piruvato de sódio, 1% de tampão HEPES, e 1% de L-glutamina .

recolha de tecidos

cancro do pulmão humano paciente tecidos de arquivo foram obtidos a partir da Universidade de Chicago Tissue Human Resource Center.

imunohistoquímica

tecido do cancro do pulmão de parafina cortes foram desparafinados em xileno, re-hidratadas por meio de soluções de etanol graduadas para a água destilada, e lavou-se em solução salina tamponada com Tris (TBS). a recuperação de antígenos foi realizada por secções de aquecimento em tampão citrato (pH 6) durante 15 minutos em um forno de microondas. A actividade da peroxidase endógena foi extinta por incubação em 3% H

2O

2 em metanol durante 5 minutos. locais de ligação não específicos foram bloqueados com bloco de proteína (Dako, Carpinteria CA) durante 20 minutos. As secções foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com o anticorpo primário anti-EphB4 (anti-ratinho; # 131) a uma concentração de 40 ug /mL, em seguida, incubadas durante 30 minutos com IgG anti-ratinho de cabra conjugado com um polímero marcado com HRP (Bio SB, Santa Barbara CA). As lâminas foram então desenvolvidos durante 5 minutos com cromogénio 3-3′-diaminobenzidina, contrastadas com hematoxilina, e lamínulas. Os controlos negativos foram realizados substituindo o anticorpo primário com imunoglobulinas de ratinho não imunes. seções de câncer de cólon e de tecido cerebral serviram como controlos positivos para a coloração EphB4 [25], [29].

A expressão tecidual para cada amostra foi quantificada por classificação manual em um 0/1 + /2 + /3 + escala , bem como por um telemóvel Imaging System (Automated ACIS; Clarient, Aliso Viejo CA), que quantifica a intensidade da coloração com base na relação de castanho para azul pixels por unidade de área. ACIS software calcula a intensidade média para cada região analisada e calcula a densidade óptica integrada (IOD), que é directamente proporcional à concentração das moléculas de EphB4 ligada ao anticorpo de acordo com a Lei de Beer-Lambert [30]. Portanto, IOD é um proxy para o teor de antigénio, e foi normalizada para toda a área medida pelo cálculo IOD /10? M

2. No geral, a classificação manual e análise ACIS foram usados ​​como métodos de expressão de quantificação paralelas e foram encontrados para ter uma correlação de r

2 = 0,75 (Spearman de correlação, p 0,0001; Figura S1). Como as tendências de expressão foram semelhantes em ambos os métodos, principalmente dados ACIS são relatados aqui. padrões de expressão utilizando o mesmo anticorpo anti-EphB4 foram semelhantes em amostras de tecido fresco congelado (Figura S2).

Immunoblotting

lisados ​​de células inteiras foram coletados por meio de M-PER reagente extração de proteínas de mamíferos (Pierce , Rockford IL), suplementado com 1,8 × inibidor de protease (Pierce) e 1,8 × Halt inibidor de fosfatase (Pierce). A concentração de proteína foi estimada utilizando um espectrofotómetro Nanodrop (Thermo, Wilmington DE), e 100 ug de proteína foram carregados num gel de 7,5% e sujeitas a SDS-PAGE em 80-120V durante 1-2 horas. As proteínas foram transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno, em um aparelho de transferência semi-seco, a 25V, durante 1 h, lavou-se rapidamente, e as membranas foram bloqueadas com albumina de soro bovino a 5% (BSA) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após uma lavagem de 5 minutos, as membranas foram expostas durante 1 hora à temperatura ambiente com o anticorpo primário anti-EphB4 (anti-ratinho; # 265) ou anti-efrina-B2 anticorpo primário (anti-ratinho; # 2B5) a uma concentração de 0,5 ug /ml em 2,5% BSA /0,05% de Tween-20. As membranas foram então lavadas três vezes durante 10 minutos e incubou-se como acima em anticorpo secundário anti-rato conjugada com peroxidase de rábano (HRP) a uma diluição 1:5000 durante 1 hora. Após outra lavagem, as membranas foram incubadas em solução de quimioluminescência aumentada (Bio-Rad, Hercules CA), e fotografados utilizando um sistema de imagem Bio-Rad QuantityOne. β-actina foi sondada de forma semelhante como um controlo de carga. A linha celular PC3 cancro da próstata foi usado como um controlo positivo para a expressão de EphB4 [19].

Citometria de Fluxo

As células foram lavadas uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois dissociados com PBS /0,2% de EDTA a 37 ° C durante cerca de 5 minutos. Após a neutralização de EDTA com meios de cultura, as células foram centrifugadas a 1000 rpm durante 5 minutos. As células foram então lavadas com PBS frio /0,5% de BSA, seguido por incubação com soro de cabra normal a 10% em gelo durante 30 minutos, e, em seguida, com anticorpos primários diluídos em soro normal de cabra em gelo durante 1 hora. As células foram subsequentemente lavadas com PBS frio e incubaram-se com anticorpos secundários conjugados com fluorocromo-se em gelo durante 30 minutos. Após uma lavagem final com PBS frio, núcleos celulares foram coradas com DAPI e analisados ​​com um citômetro de fluxo (LSR II, BD Biosciences, Franklin Lakes NJ).

Quantitative PCR

A fim de determinar gene de EphB4 do número de cópias de ADN em tecido, PCR em tempo real quantitativo foi realizada utilizando um instrumento Applied Biosystems StepOne Plus (Foster City CA). As misturas reaccionais continham rápida SYBR Green Master Mix (2X; Applied Biosystems), o ADN genómico, para a frente e reversa iniciadores de qPCR (mostrado na Tabela S1), e água de grau de biologia molecular para o total de 25 ul por reacção. qPCR utilizando iniciadores LINE-1 foi realizada em paralelo para servir como uma referência de número de cópias do gene em relação ao qual a normalizar os valores de fluorescência em bruto, e as reacções contendo várias diluições de controlo de ADN genómico (Promega, Madison, WI) foram utilizados para construir uma curva padrão para extrapolar concentrações e de DNA de tecidos verificar que estas concentrações eram da faixa de detecção linear do instrumento.

linhas celulares siRNA Knockdown

Para o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), as células foram semeadas usando antibióticos forma -livre em placas de 96 poços a uma densidade de 2,0 x 10

4 células por poço (para os ensaios de viabilidade de células, oito ou mais repetições por ensaio) ou placas de 6 poços a uma densidade de 5,0 x 10

5 células por poço (para recolha de lisado de células inteiras) e deixadas a crescer até 30-50% de confluência. As células foram transfectadas utilizando o reagente de transfecção Oligofectamine (Life Technologies, Carlsbad CA) de acordo com o seu protocolo padrão. FBS foi adicionado à concentração final de 10% após 4 horas. As células transfectadas e não transfectadas simuladas serviram como controlos. knockdown da proteína foi confirmada por imunotransferência (Figura S3).

Para o cancro do pulmão de pequenas células (SCLC) linhas de células, as células foram plaqueadas utilizando meios Opti-MEM em placas de 6 poços a uma densidade de 5 x 10

5 células por poço (três repetições por condição). As células foram transfectadas com 100 nM de controle não-alvo siRNA ou siRNA (Santa Cruz)-alvo EphB4 usando Oligofectamine reagente de transfecção de acordo com o seu protocolo padrão. Após incubação durante a noite, as células foram recolhidas por centrifugação e ressuspensas em meio completo. Mock-transfectadas e células transfectadas com ARNsi de controlo serviram como controlos. knockdown da proteína foi confirmada por imunotransferência.

Expressão de Construções de EphB4 em linhas celulares

de tipo selvagem clone de ADNc de EphB4 no vector pCMV6-XL6 (Origene, Rockville MD) foi utilizada como um mamífero vector de expressão. Para a transfecção transiente, as células foram plaqueadas em meio isento de antibiótico tanto em placas de 96 poços a uma densidade de 2,0 x 10

4 células por poço (para os ensaios de viabilidade de células, oito repetições por ensaio) ou placas de 10 cm para uma densidade de 3,0 x 10

6 células por placa (para a recolha de lisado de células inteiras) e deixadas a crescer até cerca de 50-75% de confluência (para permitir um crescimento exponencial ao longo das 72 horas seguintes). As células foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 de reagente de transfecção (Life Technologies) de acordo com o seu protocolo padrão. Os complexos foram removidos após 4-6 horas e substituído com meio isento de antibiótico fresco após lavagem com PBS. (apenas o reagente de transfecção), as células não transfectadas e transfectadas por simulação serviram como controlos. a expressão da proteína foi confirmada por immunoblotting (Figura S4)

estabelecimento de linhas celulares que expressam EphB4 estáveis ​​

de tipo selvagem de comprimento total cDNA EphB4 (número de acesso GenBank NM_004444; OriGene, Rockville MD). foi clonado em pcDNA3.1 com um marcador myc C-terminal no quadro. Este vector e o vector de controlo vazio pcDNA3.1 foram transfectados individualmente em células H661 utilizando Biot (Bioland, Paramount CA) de acordo com o protocolo do fabricante. A seguir à transfecção, o meio de cultura foi mudado para a forma final do crescimento (RPMI1640 suplementado com 10% FBS) contendo 300 ug /ml de G418. Uma semana mais tarde, as células sobreviventes foram tripsinizadas e plaqueadas em placas de 96 poços, com diluições graduais. A concentração de G418 no meio de cultura foi reduzida para 200 ug /ml a partir deste ponto. Colónias isoladas surgiram duas semanas mais tarde e foram examinados por imunotransferência utilizando um anticorpo anti-myc (9E10 clone, ATCC). Colónias com expressão EphB4-Myc exógeno foram então expandida.

viabilidade celular Ensaios

Para linhas de células NSCLC, após transfecção de siRNA ou plasmídeos em células ou tratamento de células com sEphB4-HSA em 96- se placas tal como descrito acima, as células foram deixadas a crescer até que o ponto de tempo desejado, altura em que o meio foi removido, as células foram lavadas uma vez com PBS, e meio fresco de crescimento 100 ul foi adicionado a cada poço. A seguir à adição de 5 ul de uma solução de sal de sódio 0,028% de resazurina (peso /volume; Sigma), as placas foram incubadas a 37 ° C protegida da luz durante 2-5 horas e a fluorescência foi medida utilizando um leitor de placas de fluorescência (530 /590nm excitação /emissão). Para efrina-B2 /ensaios de estimulação de Fc, 5 × 10

4 células /poço foram semeadas em placas de 24 poços, em jejum durante a noite, e foram estimuladas com 1 ug /ml de Efrina-B2 /Fc durante 0, 24, 48 ou 72 horas. As células foram lavadas duas vezes com 1 x PBS, coradas com uma solução de Azul de Tripano (0,4%; Sigma)., E manualmente contados por microscopia de luz

Para as linhas de células SCLC, as células foram colocadas em placas em triplicado a uma densidade de 1 × 10

5 células /poço e tratados com 0,5 ug /ml de efrina-B2 /Fc ou as concentrações indicadas de AZ12489875-002. Para células transfectadas com ARNsi, as células foram colhidas 24 horas após a transfecção, ressuspensas em meio completo, colocadas em placas em triplicado a uma densidade de 1 x 10

5 células /cavidade, e deixadas sem tratamento ou tratada com 200 nM de SN-38 para 72 horas a 37 ° C. Para efrina-B2 /ensaios de estimulação de Fc, 5 × 10

4 células /poço foram semeadas em placas de 24 poços, jejuadas durante a noite e estimuladas com 0,5 ug /ml de Efrina-B2 /Fc durante 48 horas. A viabilidade celular foi determinada pela adição de 10 ul de 5ng /ml, MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio; Sigma) durante as últimas 2-4 horas de cultura. sais insolúveis de formazan foram dissolvidos pela adição de 50 ul de uma solução de isopropanol acidificada. A absorvância foi lida a 570 nm dentro de 15 minutos de paragem da reacção utilizando um leitor de placas de absorção.

topoisomerase I Ensaio de Actividade

H446 e H526 células foram deixadas sem estímulo ou estimulada por 15 minutos com 50 ng /ml de HGF ou efrina-B2 /Fc, em seguida, lavada duas vezes com PBS gelado. Os extractos nucleares foram preparados como anteriormente descrito [31]. Resumidamente, as células foram recolhidas por centrifugação e lavadas uma vez com TEMP arrefecido com gelo (Tris-HCl a 10 (pH 7,5), EDTA 1 mM, MgCl 4 mM de

2, 0,5 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF)). As células foram subsequentemente suspensos em 1 ml de TEMP frio durante 10 minutos e depois centrifugada a 1500 ×

g

durante 10 minutos. pastilhas nucleares foram ressuspendidos em 20 ul TEP (Tris-HCl a 10 (pH 7,5), EDTA 1 mM, PMSF 0,5 mM) mais 20 uL de NaCl a 1 M, colocadas em gelo durante pelo menos 30 m, e, em seguida, centrifugou-se a 15.000 ×

g Compra de 15 minutos.

Top1

actividade enzimática em extractos nucleares foi medida utilizando um ensaio de relaxamento do ADN (TopoGen, laranja FL) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 100 ng de ADN de plasmídeo super-enrolado numa mistura reaccional de 20 ul (com Tris-HCl a 10 (pH 7,9), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, 0,1% de BSA, espermidina 0,1 mM, glicerol a 5%) foi incubada a 37 ° C durante 30 minutos com (1:4) extractos nucleares puras e diluídas em série, humana recombinante purificada

Top1 (controlo positivo), ou diluente de ensaio (controlo negativo). As reacções foram terminadas por adição de 5 uL 5 x tampão de carga (5% de SDS, 0,3% de azul de bromofenol). As amostras foram resolvidas num gel de agarose a 1% e trabalhada como acima.

Formação agar mole Colony Ensaio

Para avaliar o potencial tumorigénico das células de EphB4 do tipo selvagem, 1 × 10

4 células viáveis ​​por poço foram plaqueadas em agar mole em placas de 6 poços. Em resumo, a camada de base foi preparada por mistura de volumes iguais de ágar estéril a 1,2% (arrefecido a 40 ° C) e 2 × meio RPMI 1640 para se obter uma solução final de 0,6% de agar em 1 × meio RPMI1640. Para a camada superior, o agar foi diluída até 0,8% em água destilada, arrefecida a 40 ° C, e, em seguida, misturada em proporções iguais com 2 × meio RPMI1640. As células foram imediatamente adicionados à mistura para originar uma solução final de 0,4% de agar em 1 × meio RPMI1640. As células cresceram durante 4 semanas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2, no ponto em que as colónias viáveis ​​foram fotografadas e contadas utilizando o software ImageJ.

Ensaios de cicatrização de feridas

H661 EphB4 células clonais estáveis ​​de tipo selvagem vazio-vector e foram semeadas em placas de 6 poços e foram cultivadas até 100% confluentes, em seguida, tratada com 1 ug /ml de efrina-B2 /Fc. Um zero reto foi feita através da camada celular utilizando uma ponta de pipeta de 1 ml. As células foram então suavemente lavadas com 1 x PBS para remover os restos celulares, e o meio foi substituído. As fotografias foram tiradas da região ferida em 0, 4, 7, 23 e 28 horas e analisadas por software TScratch (CSELab, ETH Zurich, Suíça).

In vivo

Tumor Crescimento

2 × 10

6 A549 ou H1993 ou 4 × 10

6 células H446 foram injectados nos flancos do macho de 10-12 semanas de idade, os ratinhos Balb /C atímicos (Harlan Laboratories, CA Placentia ) e deixou-se estabelecer os tumores primários cerca de 75 mm

3 em volume. injecções do flanco foram seleccionados ao longo de um modelo ortotópico devido à sua utilização bem estabelecida em estudos do cancro do pulmão, bem como a sua facilidade de medições tumorais não-invasivos [32]. O crescimento do tumor foi medida três vezes por semana, e o volume foi calculado utilizando 0,52 × a × b

2 (derivado a partir do cálculo do volume de um esferóide, V = 4/3 π · · um

2 · b, onde a é o raio do eixo menor e b é o raio do eixo principal; Ref. 33), onde a é a dimensão mais longa e b é a dimensão mais curta da massa palpável. Seis dias após o implante, os ratinhos com xenoenxertos A549 foram divididas aleatoriamente em quatro grupos (seis ratinhos por grupo), e foi iniciado o tratamento: PBS (controlo), o paclitaxel (20 mg /kg semanalmente), sEphB4-HSA (20 mg /kg três vezes por semana), ou paclitaxel mais sEphB4-HSA. Os ratinhos com xenoenxertos H1993 ou H446 foram divididos em dois grupos (seis ratinhos por grupo), e foi iniciado o tratamento: PBS (controlo) ou sEphB4-HSA (50 mg /kg três vezes por semana). Todos os tratamentos foram administrados por via intraperitoneal. Os animais foram finalmente sacrificados e os tumores foram colhidos no final da experiência.

Imunofluorescência

Os tecidos colhidos a partir de xenoenxertos A549 rato foram congelados e embebidos em composto OCT. 5-10 uM secções foram fixadas em paraformaldeído a 4%, lavadas em PBS, e incubou-se em anti-Ki-67 (BD Biosciences), anti-CD31 (BD Biosciences), anti-fosforilado S6 (S235 /S236 primário; Cell Signaling, Danvers MA), anti-Akt fosforilada [S473 (Ref 34).; Cell Signaling], ou anti-fosforilado Src (Y416; Cell Signaling) anticorpo durante a noite a 4 ° C. Para imunof luorescência, as secções foram lavadas em PBS e incubadas com anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor (Life Technologies). Um ensaio de rotulagem dUTP nick-fim mediada por TdT (TUNEL) (Promega, Madison, WI) também foi realizado para avaliar a apoptose. DAPI foi utilizado como um corante de contraste nuclear e serviu como um controlo contra o qual as intensidades dos marcadores celulares foram normalizados. As imagens foram capturadas com uma Nikon Eclipse 80i microscópio de fluorescência e o sistema de séries de imagens Meta Morph. Para imuno-histoquímica, as secções foram primeiro incubadas em anticorpo secundário conjugado com biotina, seguido de avidina conjugada com HRP, em seguida, 3,3′-diaminobenzidina (Vector Labs reagente, Burlingame CA). Hematoxilina foi utilizado como um corante de contraste nuclear. As imagens foram capturadas usando um microscópio Olympus BX51 e do sistema Imagem-Pro Plus 6.0.

Estatísticas

Para as análises de coloração imuno-histoquímica, ingresse

10 valores ACIS para tumor contra tecidos pulmonares normais pareados foram comparados usando um teste t emparelhado de duas caudas para a coorte geral do paciente, bem como dentro subtipos individuais. Cada pontuação intensidade ACIS representa a média de até três repetições para um determinado paciente determinado usando núcleos de tecido separados dentro do mesmo microarray tumor. O grau de semelhança entre ACIS e pontuação patológica manual foi determinada utilizando uma correlação Spearman de duas caudas. dados de sobrevivência são representados usando curvas de Kaplan-Meier com base em imuno-histoquímica de pontuação intensidade (alta versus baixa usando uma nota de corte de 500 em ACIS, que representa a intensidade média geral) e sobre a designação corrida.

Para ensaios de viabilidade celular, replicar pontos de dados foram avaliados e comparados quer para células transfectadas por simulação em tempo combinados (para as células transfectadas com ARNsi) ou a células de controlo com o tempo (para células tratadas com sEphB4-HSA). Para comparar tratamentos em pares, foi utilizado o teste t de um estudante. Outras comparações dos dois grupos foram feitas utilizando um teste t de Student, e aqueles de três ou mais grupos foram feitas utilizando ANOVA de uma via. Para avaliar a variabilidade entre um conjunto de condições de tratamento com vários pontos de tempo, utilizou-se ANOVA de duas vias. A menos que indicado de outra forma, as barras de erro usado para mostrar os dados de viabilidade celular representam o erro padrão da diferença normalizados para a percentagem média versus os valores de controlo. Para

in vivo

ensaios de crescimento, a significância estatística de diferenças no crescimento do tumor em cada ponto de tempo para cada condição foi determinada por meio do teste t quer um aluno para amostras não pareadas ou one-way ANOVA para amostras entre os quatro grupos de tratamento. Para determinar a significância estatística de uma mudança no volume médio do tumor para um braço de tratamento individual, foi utilizado o teste t de um estudante. Todos os cálculos estatísticos foram realizados utilizando software Prism (GraphPad, La Jolla CA) ou o pacote estatístico SAS (Cary NC).

Resultados

EphB4 é abundante e tem um aumento do número de cópia do gene no câncer de pulmão

em análises de pares de 89 amostras normais e tumorais correspondentes em pacientes com câncer de pulmão, encontramos EphB4 a ser significativamente sobre-expressos em comparação com tecidos normais emparelhados em adenocarcinoma (n = 41; 4,3 vezes diferença média), carcinoma de grandes células (n = 15; 2,9 vezes diferença média), carcinoma de pequenas células (n = 13; 2,4 vezes diferença média), e carcinoma de células escamosas (n = 10; 2,7 vezes significa diferença) subtipos. Em geral, os tumores foram encontrados para expressar EphB4 3,2 vezes mais fortemente do que tecidos normais emparelhados (Figura 1). EphB4 em tecido pulmonar normal adjacente é mostrado na Figura S5.

Um

. imagens de imunohistoquímica representativos de expressão EphB4 em vários subtipos de câncer de pulmão. pontuação patológica é indicado acima colunas; painel mais à direita é uma vista de poder superior que da correspondente 3+ exibir imagens padrões de coloração subcelulares. Observe a coloração das membranas pronunciado em carcinoma de grandes células.

B

. padrões de expressão EphB4 em vários subtipos de câncer de pulmão com raça e distribuição palco. pontos individuais representam escores médios ACIS em um único paciente por correspondentes tecidos normais e tumorais. O número total de doentes dentro de cada análise é apresentada abaixo dos gráficos. Somente os pacientes com tumor emparelhados e tecidos normais foram incluídos nas análises. As barras horizontais representam as médias ACIS em todos os pacientes em um determinado conjunto. distribuições de raça e estágio clínico para cada subtipo eo conjunto geral são exibidas abaixo de cada gráfico.

Nós também determinada expressão linha de células NSCLC de proteína EphB4 via análise de immunoblot (Figura 2A). Seis das oito linhagens de células NSCLC (A549, H358, H522, H1703, H1993, SW1573) expressou EphB4 de forma substancial, uma (H661) demonstraram baixa expressão EphB4, e um (H2170) carecia de expressão EphB4. O ligando EphB4 ephrin-B2 foi expressa em um nível consistentemente baixa em todas as linhas celulares testadas. A expressão de EphB4 em um painel de oito linhas de células SCLC foi examinada por imunotransferência (Figura 2B) e citometria de fluxo (Figura 2C). Quatro linhas de células SCLC (H82, H249, H446, H2171) expressou EphB4 por análise de imunotransferência, enquanto as células H69 e H526 não expressou EphB4. A expressão de superfície de EphB4 por análise de citometria de fluxo em grande parte validado os resultados immunoblot.

A-B

. a expressão da proteína EphB4 em painéis de NSCLC e linhas de células SCLC por immunoblotting. Efrina-B2 expressão também foi avaliado em linhas celulares de NSCLC. BEAS-2B, uma linha de células imortalizada, pulmão, não-canceroso aqui utilizada como um controlo; a linha celular PC3 cancro da próstata foi incluído como um controlo positivo. B-actina e GAPDH foram utilizados como controlos de carga.

C

. expressão de EphB4 num painel de linhas de células SCLC avaliadas por citometria de fluxo usando anticorpos específicos de EphB4 (vermelho). IgG normal de rato foi usado como controlo negativo (azul). positividade EphB4 expresso em percentagem do total de células é mostrada no lado direito de cada painel.

Para determinar o número de cópias do gene EphB4 em amostras de tecidos, foi realizada análise de qPCR e descobriu que vários tecidos demonstrou aumento do gene EphB4 número de cópias. Seis, nove e 23 por cento de adenocarcinoma, carcinoma de pequenas células e tecidos de carcinoma de células escamosas, respectivamente, foram encontrados para conter mais de três cópias do gene EphB4, com 14% dos tecidos de carcinoma de células escamosas com mais de 10 cópias (Figura S6) . Não há linhas de células testadas foram encontrados para demonstrar número de cópias do gene ganhos.

Expression EphB4 e Prognosticação em Câncer de Pulmão

Um resumo das características clínicas dos tecidos dos pacientes utilizados neste estudo é mostrada na Tabela S2. A sobrevivência dos pacientes foi fortemente positivamente correlacionada com a expressão de EphB4 do tumor, como aqueles com elevada expressão de EphB4 têm uma sobrevivência média três vezes mais tempo do que aqueles com baixa expressão (51 meses versus 17 meses, p = 0,021; Figura 3A). pacientes caucasianos também foram encontrados para expressar EphB4 significativamente mais fortemente do que os pacientes afro-americanos (p = 0,019; dados não mostrados); no entanto, isso não se traduziu em uma diferença na sobrevida estratificada por raça (p = 0,92; Figura 3B). Não houve associação significativa entre a expressão EphB4 e outras características do paciente, como sexo, tabagismo e idade no momento do diagnóstico, seja na coorte geral do paciente ou quando estratificada por subtipo de câncer de pulmão.

O eixo das ordenadas em cada gráfico representa a fração de pacientes vivos.

A

. Sobrevida estratificada por expressão EphB4. pontuações ACIS acima e abaixo de 500 foram escolhidos para a estratificação com base na pontuação média da coorte geral. As setas representam sobrevida média (50% dos pacientes vivos) em meses.

B

. Sobrevida estratificada por raça.

EphB4 Modulation afeta o crescimento celular

in vitro

células de câncer de pulmão foram transitoriamente transfectadas com siRNA ou tratados com sEphB4-HSA-dirigido EphB4 em cultura para se determinar a viabilidade celular seria afectada. sEphB4-HSA é um fragmento de proteína monomérica que compreende o domínio extracelular de EphB4 e conjugado com albumina do soro humano que pode ligar ao ligando ef rina-B2 e portanto antagonizar a activação do receptor EphB4 através da ruptura da interacção entre o receptor EphB4 e ligando ef rina-B2 [35], [36]. Na linha celular A549, a viabilidade após a exposição ao sEphB4-HSA foi reduzida em aproximadamente 17% com a concentração mais baixa e por 40%, com as maiores concentrações de sEphB4-HSA após 96 horas (Figura 4A). Na linhagem de células H522, um efeito semelhante foi observado na dose mais elevada após 96 horas (de redução ~58%), enquanto as duas concentrações inferiores, inicialmente, reduziu a viabilidade em comparação com células de controlo, mas teve um efeito diminuído em pontos de tempo mais tardios (Figura 4A) .

A

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B

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C

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B

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C

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B

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C

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B

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