Sumário

genes WNT5A, um membro da família WNT de glicoproteínas modificadas com lípidos segregados, é um regulador crítico de uma série de processos de desenvolvimento, incluindo a formação de membros, a morfogénese do pulmão, alongamento intestinal e desenvolvimento da glândula mamária. genes WNT5A expressão alterada tem sido associada com um certo número de cancros. Interessantemente, em certos tipos de cancros, tais como malignidades hematológicas e carcinoma colorrectal, genes WNT5A é inactivado e exerce uma função supressora de tumor, enquanto em outros cancros, tais como melanoma e carcinoma gástrico, genes WNT5A é sobre-expressa e promove a progressão do tumor. O mecanismo pelo qual os genes WNT5A atinge estes actividades distintos em cancros é mal compreendida. Aqui, nós fornecemos evidências de que o

gene genes WNT5A

produz duas isoformas de proteínas, genes WNT5A-longa (genes WNT5A-L) e WNT5A de curto (WNT5A-S). a sequenciação do terminal amino e um anticorpo específico genes WNT5A-G demonstram que as isoformas maduros e secretadas são distintos, com genes WNT5A-G levando um período adicional de 18 aminoácidos N-terminais. A análise bioquímica indica que ambas as proteínas purificadas são semelhantes no que diz respeito à sua estabilidade, a hidrofobicidade e a actividade de sinalização Wnt /β-catenina. No entanto, a modulação destes dois

WNT5A

isoformas, quer através da expressão ectópica ou knockdown, demonstra que exercem actividades distintos em linhas celulares de cancro: enquanto genes WNT5A-L inibe a proliferação de linhas de células de tumor, genes WNT5A-S promove o seu crescimento . Finalmente, mostra-se que a expressão destas duas isoformas WNT5A é alterada nos cancros da mama e carcinomas do colo do útero, assim como nos tumores mais agressivos de neuroblastoma. Nestes tipos de câncer, genes WNT5A-L é frequentemente regulada para baixo, enquanto WNT5A-S é encontrado sobre-expresso em uma fração significativa de tumores. Ao todo, o nosso estudo fornece evidências de que as actividades distintas de genes WNT5A no cancro podem ser atribuídos à produção de dois

genes WNT5A

isoformas.

Citation: Bauer M, Bénard J, Gaasterland T, Willert K, Cappellen D (2013)

genes WNT5A

Codifica duas isoformas com funções distintas em cancros. PLoS ONE 8 (11): e80526. doi: 10.1371 /journal.pone.0080526

editor: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de julho de 2013; Aceito: 14 de outubro de 2013; Publicação: 18 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Bauer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações da Association pour la Recherche sur le Câncer (DC), o Institut National du Cancer (JB), Société Française des Cânceres de l’Enfant (JB), a Rede de Câncer (DC e MB) do tecido conectivo Europeu e pelo California Institute for Regenerative Medicine (CIRM, RB1-01406, KW). MB foi premiado com bolsas de estudo do Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche e de CIRM (TG2-01154). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O

gene genes WNT5A

codifica um dos 19 membros da família ligando WNT. Através da ligação a FZD (Frizzled) [1], ROR1 /2 (receptor de tirosina cinase semelhante Orphan Receptors) [2,3] ou RYK (do tipo receptor tirosina-quinase) [4] e receptores Lrp5 /6 (lipoproteína de baixa densidade do Receptor relacionados com proteína) co-receptores [5,6], proteínas Wnt modular a via de sinalização Wnt /β-catenina canónica, bem como um número de vias não-canónica β-catenina independente [7,8]. WNT vias desempenham papéis importantes durante o desenvolvimento embrionário e adulto homeostase tecidos através do controlo do crescimento celular, a proliferação, sobrevivência, adesão e migração. Alterações na sinalização WNT são frequentemente associadas à oncogênese [7-9]. Notavelmente, foram mostrados expressão aberrante de certos WNTs, inativação de mutações dos APC e tumorais Axin supressores e mutações ativadoras oncogênicos de β-catenina (CTNNB1) contribuir para a transformação das células através de desregulamentação dos genes, tais como

c-MYC

e

CCND1

(ciclina D1). silenciamento epigenético de genes que codificam antagonistas WNT, como o chamariz solúvel receptores SFRP (Secretado Frizzled proteína relacionada) ou DKK, também leva a desregulação da via e tem sido observado em vários tipos de câncer [7]. Um estudo recente abrangente de câncer colorretal descobriu que mais de 94% dos cancros carregam mutações em um ou mais componentes de sinalização Wnt [10].

Entre os componentes de sinalização Wnt implicados na oncogênese, genes WNT5A é particularmente interessante: ele atua tanto como uma oncoproteína e um supressor de tumor. Em melanomas e carcinomas gástricos e pancreáticos,

genes WNT5A

é recorrentemente overexpressed e exerce uma função pró-oncogênicos, promovendo a proliferação e /ou invasão e metástase [11-16]. Em contraste,

camundongos heterozigotos Wnt5a

estão predispostos a desenvolver linfoma de células B através da perda da função Wnt5a, e

genes WNT5A

inativação gênica por deleções somáticos ou hipermetilação é frequente na leucemia humana, linfoma e carcinoma colorectal [17-20]. Além disso, genes WNT5A inibe a proliferação de células de leucemia, linfoma e carcinoma colorectal, demonstrando sua função supressora de tumor nestes cancros [17,19,20]. Finalmente, e outros mostraram que

genes WNT5A

expressão é regulada negativamente em carcinomas da mama humanos e desempenha um papel supressor de tumores por inibição da proliferação e /ou metástases [21-24]. Diferenças no repertório receptor WNT, e, portanto, nas vias de sinalização desencadeadas por genes WNT5A [3,12-14,17,21,22,25-27], poderia explicar essas atividades opostas de genes WNT5A no câncer. Aqui, nós exploramos um mecanismo alternativo pelo qual genes WNT5A poderia exercer estas actividades distintas, nomeadamente através da expressão e produção de isoformas WNT5A distintas. Especificamente, verificou-se que um grupo amino-terminal truncado exposições genes WNT5A isoformas actividade enquanto que a proteína de comprimento completo genes WNT5A exibe actividades supressora de tumor-indutor de tumores.

Resultados

O

gene genes WNT5A

codifica duas isoformas da proteína

Para determinar se

genes WNT5A

codifica várias isoformas da proteína, foram analisadas sequências depositados em bancos de dados e procurou possíveis transcritos alternativos. Nós encontramos o

gene genes WNT5A

produz pelo menos 3 possível

WNT5A

transcrições de alternativa transcricional começar sites. Uma transcrição inicia no exon 1 [19,20,28] e está previsto para codificar uma proteína de precursor de 380 genes WNT5A amino-ácido, daqui em diante referidos como genes WNT5A-G (comprida) (Figuras 1A, B e Figuras S1A e S1B). Os outros dois transcritos iniciam 718 e 578 nucleótidos a montante do exão 2, num exão 1β alternativa (Figura 1a; Figuras S1A e S1B). Ambas as transcrições iniciou-1p exão são previstos para codificar um ácido 365 ou 360 aminoácidos (dependendo da utilização de codão de iniciação na posição 16 ou 21 em relação ao codão de iniciação de genes WNT5A-G) proteína precursora, denominada WNT5A-S (curto), e faltam os primeiros 15 aminoácidos ou 20 do terminal N, em comparação com o G-genes WNT5A precursor ([29]; Figuras 1A, B e Figuras S1A e S1B).

A. Estrutura do transcritos alternativos humana

genes WNT5A

gene e. caixas numeradas indicam os exons, com as regiões 5 ‘e 3’ não traduzidas (UTR) nas regiões cinza e codificação em preto. nt: nucleotídeos, kb: base quilo. Azuis e vermelhos flechas e as linhas pontilhadas indicam, respectivamente, as posições dos diferentes locais de iniciação da transcrição do exão 1 e o exão e 1β splicing do exão 1 e transcritos iniciou-1p exão. Azul e vermelho estrelas indicam os codões de iniciação de tradução para as isoformas genes WNT5A-L-S e genes WNT5A localizados no exão 1 e o exão 2, respectivamente. setas do parafuso de relâmpago azuis e vermelhos indicam a posição das sequências alvo de

genes WNT5A-L

e

WNT5A-S

específica curto interferindo RNA (siRNA). B. alinhamento de sequências de aminoácidos múltiplo do terminal N das proteínas precursoras genes WNT5A. O azul M denota o códon de iniciação mais provável de genes WNT5A-L enquanto o Ms vermelho denotam as mais provável começar códons de genes WNT5A-S. As setas cinzentas indicam as posições dos locais de clivagem do péptido de sinal em ambas as isoformas como previsto por SignalP 4.1 (https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). setas azuis e vermelhos indicam a posição dos primeiros aminoácidos observados do genes WNT5A-L madura e proteínas de genes WNT5A-S, respectivamente, e, portanto, a posição do local de clivagem péptido sinal observado para cada isoforma. C. Detecção de isoformas purificadas WNT5A. Painel esquerdo: Imuno-blot para genes WNT5A demonstra que ambas as isoformas são de peso molecular semelhante (

≈43kDa). Painel direito: Coomassie gel corado mostra que os preparativos WNT5A purificadas são puros com proteínas contaminantes em grande parte indetectáveis. D. Um anticorpo anti-ratinho Wnt5a detecta ambas as isoformas (painel esquerdo), enquanto um anticorpo específico genes WNT5A-L anti-coelho (painel da direita) detecta a genes WNT5A-G, mas não a genes WNT5A-S isoforma.

E. Triton X-114

separação de fase demonstra que ambas as isoformas genes WNT5A partição para a fase hidrofóbica /orgânica. WNT5A proteínas foram detectadas por análise de imuno-blot com um anticorpo anti-Wnt5a. F. A incubação das isoformas WNT5A purificada a 37 ° C durante os tempos indicados indica que a sua

em

vitro

estabilidade é similar. proteínas WNT5A foram detectadas como em E e intensidades das bandas foram quantificados usando software ImageJ.

A estrutura geral exon-intron do humano

gene genes WNT5A

é altamente conservada em outros vertebrados, incluindo rato, frango e peixe-zebra (Figura S2A). O

gene genes WNT5A

é dividido em 5 exons conservados. O comprimento, a sequência e locais de splicing nos códons em todo exons 2 – 5 são altamente conservadas. A região não traduzida do exão 1 é mais divergiram, mas o local de splicing é conservada. Este arranjo exon-intron também é conservado no

WNT5B

gene intimamente relacionados, como anotado em genomas de mamíferos. Curiosamente, o 1β exão alternativo, que é incorporado no primeiro intrão, também está presente nessas vertebrados. Em camundongos, 1β exão é detectada em transcrições Wnt5a alternativas e ações de homologia significativa com a sequência humana. Num alinhamento par a par, o elemento que abrange a região reguladora a montante e o exão 1 β são 95% conservada entre rato e humano (Figura S2B). Nas aves (galinha e Finch zebra), este exão alternativo não foi anotado, mas a presença de uma sequência altamente conservada, com um dador de união na extremidade 3 ‘indica que esta 1β exão está presente. O alinhamento par a par entre frango e passarinho de zebra deste elemento demonstra a conservação de 96%. Além disso, duas sequências curtas dentro destes elementos são altamente conservados entre mamíferos (rato e humano) e aves (galinha e Finch zebra) (Figura 2B). Peixes (peixes-zebra e stickleback) também conter um elemento altamente conservadas dentro desta região. Embora este elemento não tem sido anotada como um exão em qualquer base de dados, a conservação elevada (74%) sugere a presença de um exão adicional em peixes (Figura 2B). Juntos, o elevado grau de conservação da sequência observado genómico sugere que os transcritos alternativos Wnt5a, semelhantes aos descritos aqui, estão presentes em várias espécies de vertebrados. Finalmente, o alinhamento dos aminoácidos do terminal amino da mostra humanos, de ratinho e de Wnt5a galinha que começam codão M21 (posição em relação ao codão de iniciação de genes WNT5A-G) é completamente conservada (Figura 1B), sugerindo que WNT5A-S inicia nesta posição.

Ambas as proteínas WNT5A bloquear Wnt3a-activação de β-catenina /actividade de transcrição TCF-impulsionado em células HEK 293 (TOP-luciferase, A.) e MDA-MB-231 (repórter GFP-TOPO, B.). As células foram tratadas com Wnt3a purificada e uma concentração crescente de genes WNT5A durante 24 horas (A) ou 48 horas (B). C. Após a transfecção, ambas as isoformas WNT5A interferir com endógena (MDA-MB-231, painel esquerdo) e (HeLa, painel da direita) β-catenina /TCF-transcrição accionada em MDA-MB-231 (painel da esquerda) e induzida por Wnt1 As células HeLa (painel direito). As células foram transfectadas com vectores de controlo, WNT5A-L ou de expressão de genes WNT5A-S por si só, ou em conjunto com um vector de expressão Wnt1 e ensaiadas quanto à actividade β-catenina /TCF-driven TOP-luciferase repórter. Um vector de expressão que codifica uma forma dominante negativa de TCF4 (ΔNTCF4) foi usada para interferir com a actividade repórter endógeno em células MDA-MB-231. D. Ambos WNT5A isoformas promover a fosforilação DVL. células L (painel da esquerda) e de células C2C12 (painel direito) foram tratados com as isoformas WNT5A (10 nM, 2 horas) e os lisados ​​de células inteiras foram imuno-a hibridar com os anticorpos indicados. Ambas as isoformas WNT5A, bem como Wnt3a (10 nM, 2 horas), conduziu a um desvio de mobilidade das proteínas DVL1 e Dvl2, sugerindo que as proteínas DVL são pós-translacionalmente modificado por fosforilação em resposta a ambos canónica (Wnt3a) e não canónicas Wnt (genes WNT5A) de sinalização. Apenas Wnt3a induzida acumulação da proteína β-catenina. Nota: p-catenina em resposta a acumulação Wnt3a em células C2C12 não é detectável nestes lisados ​​de células inteiras, porque estas células contêm grandes quantidades de membrana /adherens junção associada β-catenina

Como é o caso. para proteínas secretadas mais, os precursores de Wnt são clivados no terminal amino para remover a sequência de sinal produzindo desse modo o polipéptido maduro. Um peptídeo sinal algoritmo de previsão de clivagem (

SignalP 4.1 viajantes – https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) prevê que ambos os precursores WNT5A produzir proteínas, tanto de 343 aminoácidos (começar com QVVIEA … ) ou 338 aminoácidos (começar com ANSWWS …). O último local de clivagem previsto tem o maior número de pontos de clivagem (Y-score de 0,625 para WNT5A-S [começam em M21] e 0,246 para genes WNT5A-L). No entanto, a sequenciação amino-terminal de ratinho Wnt5a indicou que a clivagem ocorreu sequência de sinal a uma posição de 24 resíduos a jusante do local previsto [3]. Além disso, uma vez que a diferença de aminoácido 15 na sequência N-terminal de genes WNT5A-L e precursores genes WNT5A-S pode influenciar a posição de clivagem do péptido de sinal, que determinada experimentalmente a identidade do terminal amino das proteínas maduras.

Para identificar a posição de clivagem do péptido de sinal e o primeiro aminoácido das proteínas maduras, que purificado WNT5A ambas as isoformas. Utilizando um sistema de expressão de CHO previamente desenvolvidos [30], que sobre-expressa de forma independente cada isoforma genes WNT5A e purificou-los a partir do meio condicionado (CM), de acordo com protocolos publicados [3,31]. Ambas as isoformas WNT5A foram segregadas para o CM nos níveis iguais (dados não mostrados), e foram purificados até à homogeneidade próximo (~ 95% pura, conforme avaliado por coloração com Coomassie, a Figura 1C). a sequenciação amino-terminal mostrou que a proteína purificada genes WNT5A-G para iniciar um aminoácido a jusante do local de clivagem do péptido de sinal previsto, gerando, assim, uma proteína de 337 ácidos de amino de partida com a sequência NSWWS … (Figura 1B; Figura S1B e S1C). A proteína secretada genes WNT5A-S faltava um ácido adicional amino-terminal de 18 amino para gerar uma proteína de 319 aminoácidos que começa com a sequência de IIGAQ … (Figura 1B; Figura S1B e S1C). Portanto, as duas isoformas gerar proteínas com sequências amino-terminais distintas. O terminal amino genes WNT5A-S que corresponde de rato Wnt5a, que foi previamente identificado por sequenciação peptídica amino-terminal [3]. Curiosamente, o algoritmo de clivagem do péptido de sinal não previu esta posição como um local provável da clivagem da sequência de sinal para ambos os genes WNT5A-L ou genes WNT5A-S (Y-score de 0,16 por genes WNT5A-S e 0,113 de genes WNT5A-L).

para confirmar a composição do terminal amino distinta de ambas as isoformas WNT5A maduros, que gerado um anticorpo dirigido para o ácido 18-amino genes WNT5A específicas de L (NSWWSLGMNNPVQMSEVY). Em imuno-blots, o anticorpo específico genes WNT5A-L-reconhecidas apenas genes WNT5A-L e não genes WNT5A-S (Figura 1D). Isso demonstra que o exão 1 e exão 1β-iniciado

WNT5A

transcrições produzir proteínas WNT5A distintas que diferem em seus terminais amino. O mecanismo pelo qual estes dois precursores são diferencialmente processado para produzir proteínas maduras distintos é actualmente incerto, no entanto, especula-se que as diferenças nos terminais amino influenciar a escolha da máquina de processamento para clivar as proteínas em posições distintas. Mais estudos são necessários para responder a estas perguntas.

proteínas WNT são altamente hidrofóbico, uma propriedade conferida pela ligação covalente de pelo menos uma molécula de lipídio a um resíduo conservado [31,32]. Esta modificação é importante para o processamento adequado e secreção [32,33]. Além disso, como revelado pela estrutura do co-cristal de Wnt-FZD, o agrupamento lipídico é crítico para a ligação ao receptor [34]. Para avaliar se as duas isoformas WNT5A diferiam nas suas propriedades hidrofóbicas, e, portanto, nas suas modificações lipídicas, utilizou-se a propriedade de separação de fase do detergente Triton X-114. Não se observou diferença entre as duas isoformas, uma vez que ambos repartiu-se igualmente a fase orgânica (Figura 1E), sugerindo que ambas as isoformas são igualmente modificadas. Para testar se as duas isoformas diferem na sua estabilidade, que cada proteína incubadas a 37 ° C durante até 60 horas. detecção imuno-blot indicou que ambas as proteínas degradadas a taxas iguais (Figura 1F). Portanto, as duas isoformas WNT5A se comportam de modo semelhante no que diz respeito ao seu

In vitro

estabilidade e hidrofobicidade. É, no entanto, possível que cada isoforma tem propriedades bioquímicas distintas de um

In vivo

configuração, uma possibilidade que não foram abordados.

Efeitos de genes WNT5A-L e WNT5A-S isoformas de sinalização vias

Vários WNT vias de sinalização têm sido descritas e proposto. A via mais vulgarmente estudada e melhor estabelecida, muitas vezes referida como a via de WNT canónica, envolve β-catenina como um mediador central. Outras vias não canónicos, que actuam independentemente de β-catenina, são mal compreendidos. No mínimo, estas duas vias são pensados ​​para compartilhar os seguintes componentes: ligantes WNT, receptores FZD e Dishevelled (DVL) transdutores de sinais. Embora genes WNT5A está predominantemente associado com a sinalização de Wnt não-canónica, que também foi encontrado para activar a sinalização canónica β-catenina em certas condições de [3]. Nós investigamos se as isoformas WNT5A diferencialmente impactar a via de sinalização /TCF β-catenina. Para este fim, foram geradas duas linhagens de células, HEK 293 e MDA-MB-231, que leva um sistema repórter específica WNT /β-catenina. Este sistema repórter consiste de um elemento de resposta de WNT composta por 7 multimerizada TCF locais de ligação (designado por cima para TCF óptima Promotor [35,36]), que regula a expressão de um gene repórter, quer células de luciferase para células HEK 293 (HEK293- TOP-luciferase, Figura 2a; a Figura S3A) ou GFP em células MDA-MB-231 (MDA-MB-231-TOP-GFP, Figura 2B; Figura S3B). Estas células repórter são potentemente activado por Wnt3a (Figura 2A e B), uma proteína WNT comumente utilizado para estimular a via de sinalização canónica. Em contraste, nem a isoforma genes WNT5A activado ou consistentemente modulada a actividade basal dessas repórteres (Figura S3A e S3B), indicando que estes sistemas celulares não fornecem o meio apropriado para ligar genes WNT5A sinalização para a via β-catenina canónica.

ensaios baseados em células sensíveis e robustos para a sinalização WNT não-canônico são escassos. No entanto, a sinalização de Wnt não-canónica foi mostrado para antagonizar a sinalização de Wnt /β-catenina, uma actividade que pode ser ensaiada utilizando o sistema TOP-repórter de [3]. Verificou-se que ambas as isoformas WNT5A inibir a activação do repórter induzido por Wnt3a de um modo dependente da dose (Figura 2 A e B). Estes resultados mostram que, apesar da diferença na sua terminais amino, ambas as proteínas WNT5A potentemente antagonizar a sinalização /β-catenina WNT. efeitos inibidores semelhantes de genes WNT5A-L-S e WNT5A isoformas no repórter WNT /β-catenina-driven foram observadas quando as células foram transfectadas com vectores de expressão (Figura 2C), em vez de tratado com purificada genes WNT5A-L e proteínas de genes WNT5A-S. Assim, nestes ensaios, as isoformas WNT5A exibem actividades biológicas similares quando entregue como proteínas purificadas ou genes transfectados.

sinalização WNT, canônica e não canônica, leva à hiperfosforilação de proteínas DVL, moléculas que atuam imediatamente a jusante dos receptores FZD sinalização. Esta modificação pós-traducional de proteínas DVL pode ser facilmente detectado por um desvio da mobilidade electroforética [37-39]. Nós descobrimos que o tratamento de duas linhas de células (células L do rato e da linha celular C2C12 de rato mioblastos) quer com a isoforma genes WNT5A, bem como Wnt3a, induz uma mudança de mobilidade de proteínas DVL, conforme detectado por imuno-blotting para DVL1 e Dvl2 (Figura 2D). No entanto, de acordo com as distintas actividades de Wnt3a e isoformas WNT5A sobre a sinalização de Wnt /β-catenina (Figuras 2A, 2B; Figura S3A, S3B), única Wnt3a, mas não isoformas WNT5A, acumulação induzida da proteína β-catenina, como evidenciado em células L. Esta acumulação de proteína β-catenina não é aparente em células C2C12, que já expressam elevados níveis de β-catenina (Figura 2D). Tomados em conjunto, os nossos dados indicam que as duas isoformas WNT5A exibem actividades biológicas idênticas na Wnt-base celular estabelecida ensaios de sinalização.

Expressão de isoformas WNT5A em linhas celulares de cancro e tecidos normais

Estudos anteriores de expressão genes WNT5A já não discriminados entre as duas isoformas descritos aqui. Por isso, nós medimos os seus níveis de transcrição em linhas celulares de cancro e em tecidos normais por realizar RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) com iniciadores específicos para isoformas (ver Tabela S1 e S1 Figura). Esta análise revelou que a expressão destas isoformas é altamente variável entre as linhas celulares de cancro individuais. Por exemplo, enquanto MDA-MB-231 (derivada de um carcinoma da mama) e SH-SY5Y (derivada de um neuroblastoma) expressar predominantemente

genes WNT5A-L

, células HeLa (derivadas de um carcinoma de colo do útero) expressar predominantemente

genes WNT5A-S

(Figura 3A). Outras linhas de células, incluindo MCF-7 (derivada de um carcinoma da mama) ou IMR-32 (derivado a partir de um neuroblastoma) expressar a níveis extremamente baixos de ambos os genes WNT5A isoforma (Figura S4A). Embora menos quantitativa, análise de gel de ponto final Os produtos de RT-PCR obtidos a partir de linhas de células representativas confirmaram os dados de qRT-PCR (Figura S4A). A seguir, analisaram os níveis de transcrição de isoformas WNT5A em tecidos adultos normais. Detectamos

genes WNT5A-L expressão

em quase todos os tecidos, excepto o tecido adiposo. Em contraste, foi detectada

WNT5A-S

expressão apenas na placenta, e, em menor medida, na traqueia e no intestino delgado (Figura S4B).

. expressão da isoforma genes WNT5A em três linhas de células de cancro. os níveis de transcrição de

WNT5A

isoformas foram determinados em células MDA-MB-231 (carcinoma da mama), HeLa (carcinoma de colo do útero), e SH-SY5Y (neuroblastoma) por qRT-PCR e normalizada por

EF1-α

mRNA (normalização pela

GAPDH

mRNA e

18S rRNA

produziu resultados semelhantes). razões da média (

WNT5A

isoformas /

EF1-α) ± SEM a partir de medições independentes são mostrados. B. Efeitos da expressão ectópica de genes WNT5A-L e WNT5A-S isoformas em proliferação. As linhas celulares indicadas foram transduzidas com vectores de expressão codificando genes WNT5A-G (linha azul), genes WNT5A-S (linha vermelha) ou não WNT (linha preta) e os números de células foram determinadas aos 3 e 6 dias. Genes WNT5A-S aumenta enquanto genes WNT5A-G diminui as taxas proliferativa. Os dados (média ± EPM de determinações em triplicado) a partir de uma experiência representativa são mostrados. Cada experiência foi realizada pelo menos três vezes independentes. C. isoforma siRNAs específicos reduzir a expressão de cada isoforma genes WNT5A. A eficiência de genes WNT5A-L e genes WNT5A-S isoforma knockdown (KD) foi avaliada em células MDA-MB-231, HeLa e SH-SY5Y transfectadas com ARNsi de controlo e

genes WNT5A

ARNsi específicos de isoforma (KD).

genes WNT5A

isoformas níveis de transcrição foram medidos por RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) e normalizados pela

EF1-α

mRNA (normalização pela

GAPDH

mRNA e

18S rRNA

produziu resultados semelhantes). D. Efeitos de knockdown de siRNA-mediada (KD) de genes WNT5A-L e WNT5A-S isoformas em proliferação. As células foram transfectadas com ARNsi específicos para genes WNT5A-G (linha azul) ou genes WNT5A-S (linha vermelha) e os números de células foram determinadas aos 3 e 6 dias. Um siRNA mexidos serviu como controle (linha preta). A co-transdução de células com um vector de expressão de genes WNT5A-S resgata o efeito do siARN WNT5A-S-específico (linha tracejada vermelha). Os dados (média ± EPM de determinações em triplicado) a partir de uma experiência representativa são mostrados. Cada experiência foi realizada pelo menos três vezes independentes. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; ***

P Art 0,005; ****

P Art 0,001. regulação E. diferencial de

AXIN2

e

CDK8

expressão por knockdown específicos de isoformas de genes WNT5A. níveis de transcrição de

AXIN2 Comprar e MDA-MB-231 (carcinoma da mama

CDK8

foram determinados por análise RT-PCR quantitativo (normalizada pela

EF1-α

mRNA) no controle ), HeLa (carcinoma de colo do útero) e SH-SY5Y (neuroblastoma) células, e em resposta a siRNA mediada knock-down (KD) de genes WNT5A-L ou genes WNT5A-S. A média de proporções ± SEM a partir de medições independentes são mostrados.

genes WNT5A-S promove e genes WNT5A-L suprime o crescimento de linhas celulares de cancro

Para estudar as funções das isoformas WNT5A, nós manipulados a sua expressão em várias linhas de células, incluindo células MDA-MB-231, HeLa e SH-SY5Y, e analisadas as consequências fenotipicas (Figura 3B-D; a figura S5). Desde sinalização atividades de proteínas Wnt purificadas são de curta duração [30] ensaios biológicos e geralmente requerem longos períodos de estimulação, utilizamos transfecção de

WNT

genes em vez de aplicação de proteínas purificadas. A expressão ectópica de genes WNT5A-L reduziu substancialmente o número de células nestas linhas celulares (Figura 3B). Não se observou qualquer evidência de aumento da morte celular (dados não mostrados), indicando que genes WNT5A-L actua para inibir a proliferação celular. Em contraste, a expressão ectópica de genes WNT5A-S promoveu a proliferação de células SH-SY5Y (Figura 3B) MDA-MB-231, HeLa e

Usando os siRNAs específicos de isoforma (ver Figura S1; S2 Tabela)., Nós expressão interrompido de cada isoforma genes WNT5A (Figura 3C). Os ARNsi foram capazes de knockdown especificamente os seus objectivos até 80% conforme determinado por qRT-PCR (Figura 3C). Importante, cada isoforma genes WNT5A foi selectivamente inibida pelo siARN correspondentes sem afectar os níveis de outra isoforma. Consistente com a proliferação efeitos promotores de expressão ectópica genes WNT5A-S, knockdown de genes WNT5A-S reduzido número de células (Figura 3D). Mesmo em células que expressam níveis baixos de genes WNT5A-S, tais como MDA-MB-231 (Figura 3A), o knockdown da isoforma genes WNT5A-S produzido um efeito inibitório forte (Figura 3D). A inibição celular resultante de genes WNT5A-S siARN foi resgatado em todas as linhas celulares testadas por co-transdução com um vector de genes WNT5A-S desprovido da sequência alvo ARNsi (Figura 3D, KD genes WNT5A-S + resgate). Estes dados demonstram que resgatar os efeitos do presente siARN são devidos a WNT5A S-knock-down, em vez de não-específicos efeitos fora do alvo. Além disso, genes WNT5A-S knockdown aumento da morte de células nas três linhas celulares (Figura S5a) e a actividade da caspase induzida em células MDA-MB-231 e HeLa (Figura S5B). No entanto, a redução ≥3 vezes no número de células (Figura 3D) excedeu o aumento modesto observados na morte celular (Figura S5A), sugerindo que os genes WNT5A-S knockdown proliferação principalmente prejudicada. Em contraste, knockdown de genes WNT5A-G não tiveram nenhum efeito sobre a proliferação celular (Figura 3D), morte celular ou actividade de caspase 3 nas linhas de células (Figura 3D; Figura S5A, B). Tomados em conjunto, estas experiências demonstram que as isoformas WNT5A endogenamente e ectopicamente expressas exercer efeitos distintos em linhas de células da mama, colo do útero e do tumor de neuroblastoma, com genes WNT5A-S e genes WNT5A promovendo-L inibição da proliferação celular. Uma vez que não observar as actividades de sinalização distintas para genes WNT5A-L e genes WNT5A-S no WNT /β-catenina e ensaios de fosforilação DVL (Figura 2), especula-se que estes promotores de crescimento e inibir atividades de genes WNT5A são independentes da via de sinalização WNT canônica .

Na tentativa de identificar um mecanismo pelo qual isoformas WNT5A exercem efeitos diferenciais sobre a proliferação, nós analisamos a expressão de vários genes WNT regulada conhecidos. Descobrimos que a expressão de dois genes,

AXIN2

e

CDK8

, ambos os quais foram implicados em vários aspectos da sinalização de Wnt [7,40,41], foram diferencialmente regulados por isoform- knockdown específica de genes WNT5A. Knockdown de genes WNT5A-L, mas não genes WNT5A-S, levou a uma diminuição na

expressão AXIN2

em 3 linhas celulares testadas (MDA-MB-231, HeLa e SH-SY5Y, Figura 3E). Em contraste, knockdown de WNT5A-S, mas não genes WNT5A-L, levou a um aumento na

expressão CDK8

em 2 de 3 linhas de células (MDA-MB-231 e HeLa) e uma diminuição no SH- SY5Y (Figura 3E). Estes dados oferece uma potencial ligação molecular entre as observados efeitos diferenciais de isoformas WNT5A na proliferação e regulação do gene e indica que cada isoforma genes WNT5A colide com a expressão do gene de um modo distinto. Mais estudos exaustivos, tais como análise de transcriptoma, serão necessários para identificar e definir as vias que medeiam estes efeitos diferenciais.

A sub-regulação de genes WNT5A-L e a sobre-expressão da isoforma de genes WNT5A-S em cancros

Para determinar se o respectivo pró e funções anti-proliferativas dos genes WNT5A-S e genes WNT5A-G isoformas são relevantes para a oncogénese, analisamos os seus níveis de expressão por qRT-PCR em amostras de tumor primário da mama e carcinomas do colo do útero e neuroblastomas. Em comparação com tecidos normais da mama,

genes WNT5A-L

foi regulada para baixo ≥3 vezes em 46% (14 de 30) dos carcinomas da mama (

P

= 0,04) (Figura 4A) .

genes WNT5A-S

não foi detectada em tecido mamário normal e sobre-expressos em um pequeno subconjunto dos cancros da mama (4 de 30, 13%, n. S.) (Figura 4A). Em condições normais do epitélio do colo uterino, tanto

genes WNT5A-L

e

WNT5A-S

foram expressas,

genes WNT5A-L ser a isoforma predominante

(Figura 4B). Na comparação com o colo do útero normal,

genes WNT5A-L

foi regulada para baixo ≥3 vezes em 53% (8 de 15) dos carcinomas colo uterino (

P

= 0,047). Em contraste,

genes WNT5A-S

foi regulado para cima ≥4 vezes em 40% (6 de 15) desses tumores (

P

= 0,045) (Figura 4B). Neuroblastomas, cancro infantil do sistema nervoso simpático, podem ser classificadas em tumores de baixo e de alto risco, com 90% e 30% de sobrevivência, respectivamente. Metade do neuroblastomas alto risco são fatais dentro de 2 anos a partir do diagnóstico [42]. neuroblastomas de alto risco apresentaram baixa

genes WNT5A-L expressão

com mais frequência do que os tumores de baixo risco (55% -22 de 40- versus 21% -8 de 37-,

P

= 0,004), assim sugerindo que os genes WNT5A-G infra-regulação correlaciona com neuroblastoma de alto risco. 0,01;