Abstract

Até o momento, feocromocitomas malignos e paragangliomas (feo /pGLS) não podem ser efetivamente curado e, portanto, novas estratégias de tratamento são urgentemente necessários. A lovastatina tem sido demonstrado eficaz para induzir apoptose em células de ratinho Pheo (MPC) e as células derivadas do tecido de tumor de rato mais agressivos (MTT), que foi acompanhada pela diminuição da fosforilação de jogadores via da cinase activada por mitogénio (MAPK). A via de MAPK desempenha um papel em numerosos tumores agressivos e tem sido associado com um subgrupo de Pheos /pGLS, incluindo

K-RAS-

,

RET

, e

NF1

tumores -mutated. O nosso objectivo era determinar se a sinalização MAPK pode também desempenhar um papel na agressivos, succinato desidrogenase (SDH) B derivadas de mutação feo /pGLS. Expressão de perfis e análise de Western blot indicou que os aspectos específicos de sinalização MAPK-activo são em Pheos SDHB /pGLS, sugerindo que a inibição por meio de tratamento com estatina pode ser benéfica. Além disso, buscou-se avaliar se o efeito anti-proliferativo da lovastatina no MPC e MTT diferiu daquela exercida por fluvastatina, simvastatina, atorvastatina, pravastatina ou rosuvastatina. A sinvastatina e fluvastatina diminuição da proliferação de células de forma mais eficaz e as células MTT mais agressivos apareceu mais sensível a este respeito. A inibição da fosforilação MAPK1 e 3 após o tratamento com fluvastatina, simvastatina, lovastatina e foi confirmada por Western blot. Aumento dos níveis de CASP-3 e PARP clivagem confirmou a indução de apoptose após o tratamento. A uma concentração suficientemente baixa para não afectar a proliferação celular, migração espontânea da MPC e MTT foi significativamente inibida no prazo de 24 horas de tratamento. Em conclusão, as estatinas lipofílicas podem apresentar uma opção terapêutica promissora para o tratamento de paragangliomas humanos agressivos através da indução de apoptose e inibindo a disseminação do tumor

Citation:. Fliedner SMJ, Engel T, Lendvai NK, Shankavaram U, Nolting S, Wesley R , et ai. (2014) Potencial Anti-Câncer de MAPK Pathway Inibição em Paragangliomas-efeito das estatinas diferentes em células de camundongo Feocromocitoma. PLoS ONE 9 (5): e97712. doi: 10.1371 /journal.pone.0097712

editor: Benjamin Edward rico, Dana-Farber Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 10 Janeiro, 2014; Aceito: 22 de abril de 2014; Publicado em: 20 de maio de 2014

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. O financiamento foi fornecido pelos intramurais Programas de Pesquisa do Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano e do Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano , National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA e do Departamento de Medicina 1º, Centro Médico da Universidade Schleswig-Holstein, Lübeck, Alemanha. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

recentemente, lovastatina tem sido sugerido como opção terapêutica potencial promissor no tratamento de RET, NF1, e TMEM127 catecolaminas produzir tumores derivados de mutação supra-renais e extra-adrenais cromafins celulares (feocromocitomas (Pheos) e paragangliomas (pGLS), respectivamente ) [1]. No entanto, o risco para doença metastática nestes tumores é relativamente baixa e, portanto, a ressecção do tumor é quase sempre curativa. Em contraste, o risco de feo malignos /pGLS é particularmente elevado no caso de succinato desidrogenase B (SDHB) mutações genéticas [2], [3], e novas estratégias de tratamento são urgentemente necessários para essa condição.

Um recente New England Journal of Medicine artigo relatou diminuição da mortalidade relacionada ao câncer em pacientes que foram prescritos estatinas anteriores ao diagnóstico [4]. De acordo com isto, numerosos

in vitro

e

In vivo

estudos demonstraram efeitos anti-câncer de lovastatina e outras estatinas isoladamente ou como parte de um regime de tratamento combinado para tumores agressivos (revisto em [ ,,,0],5] – [7]). A concentrações mais elevadas do que são necessários para a redução dos níveis de colesterol, as estatinas têm sido mostrados para inibir a via do mevalonato grave o suficiente para inibir a síntese de isoprenóides, que actuam como âncoras de membrana necessários para o bom funcionamento de certas proteínas [8]. Os efeitos anti-cancro de estatinas têm sido principalmente associada com a inibição de Ras-prenilação (i.e. farnesilação ou geranilgeranilação), que, entre outros efeitos, interrompe a activação de jogadores a jusante na via de MAPK [9], [10]. Sobre-activação da via do mevalonato, incluindo MAPK-sinalização tem sido mostrado para ser suficiente para a transformação das células [11]. sinalização MAPK excessiva suporta inibição da apoptose, proliferação e migração e é uma característica chave de muitos tipos de câncer (resumido em [12], [13]). Em caso de feo /pGLS, atividade da via MAPK elevada é aparente em

H-RAS

,

K-RAS

,

TMEM127

,

RET

,

NF1

e, possivelmente,

Max

tumores relacionados com mutação [14] – [22]

para o nosso conhecimento, atualmente nenhuma evidência para o aumento da sinalização de MAPK em SDHB derivado. pGLS foi apresentado. Em células de pacientes com síndrome de Cowden-like e SDHB ou variantes do gene D, no entanto, o aumento dos níveis de MAPK 1 e 3 fosforilação foram observados [23]. Na presença de uma via de MAPK activa, as estatinas podem oferecer um tratamento promissor opção ou co-tratamento para pGLS malignas actualmente fatais.

A extensão dos efeitos anti-cancro tem demonstrado variar em função do modelo e tipo de estatina utilizado [24] – [30]. Assim, avaliamos qual dos sete estatinas atualmente disponíveis pode ser mais eficaz para o tratamento FEO /PGL.

Materiais e Métodos

A fluvastatina, pravastatina, lovastatina e sinvastatina foram todos obtidos a partir de Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI); atorvastatina e rosuvastatina foram obtidos a partir de Enzo Life Sciences, Inc. (Farmingdale, NY).

cultura celular

tumor de murganho derivadas de tecido de células (MTT) foram recentemente desenvolvidos no nosso laboratório [31 ]. Todos os estudos com animais necessários para o desenvolvimento e caracterização de células MTT foram conduzidos de acordo com os princípios e procedimentos descritos no Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Utilização de Animais, e aprovada pelo

Eunice Kennedy Shriver National

Instituto de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano animal Care e Use Committee (número de protocolo ASP # 06-028). células MTT são de propriedade do NIH. células do rato feocromocitoma (MPC 4 /30PRR) foram uma oferta generosa do Dr. Tischler, TUFTS, Boston. As células foram mantidas em DMEM (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY), suplementado com 10% de soro inactivado por calor cavalo (Hyclone Logan, UT), soro bovino fetal a 5% (Gibco), HEPES (Gibco) e penicilina ( 10000 unidades /ml) /estreptomicina (100000 ng /mL) (Gibco) numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 a 37 ° C. O meio foi mudado a cada dois dias e as células foram passadas quando 80-90% de confluência foi atingido. Todas as estatinas foram comparadas com a concentração apropriada de veículo (DMSO). Quando as estatinas foram combinadas para avaliar potenciais efeitos aditivos, 25 uM de 2 estatinas diferentes foram comparados com 50 uM de cada um dos estatinas individuais.

Os ensaios de proliferação

As células foram semeadas em colagénio revestido 96- bem placas (BD Biosciences, San Jose, CA) a 10.000 células por cavidade, e deixadas a aderir durante 24 h. Em seguida, o meio foi trocado com concentrações de 6,25, 12,5, 25, e 50 uM de as diferentes estatinas, dissolvido em meio suplementado. Depois de 0, 24, 48, e 72 h de tratamento, a proliferação celular foi avaliada com o Kit de Proliferação de Células II (XTT) (Roche Applied ciência; Indianapolis, IN) de acordo com o manual do produto. Depois de quatro horas de incubação, as placas foram medidas a 490 nm com comprimentos de onda de referência de 650 nm num leitor de microplacas (Victor

3 1420 contador multilabel, Perkin Elmer, Waltham, MA). Todas as experiências foram realizadas em quadruplicado e repetido pelo menos duas vezes.

ensaios de migração celular espontâneas

As células foram semeadas a 60000 células por poço para avaliação da migração espontânea em um dispositivo xCELLigence DP (Roche Diagnostics, Mannheim , Alemanha) como relatado anteriormente [32]. A migração espontânea foi registada durante 24 horas na presença de 5 uM fluvastatina, lovastatina, simvastatina e sozinho, ou em combinação com 100 jiM de trans, trans farnesol (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA).

via MAPK gene de enriquecimento em pGLS SDHB

Os dados expressão foi extraída de dados de microarranjos anteriormente apresentados em 45 amostras de feo pseudohypoxic /pGLS, incluindo 18 SDHB, 8 SDHD cabeça e pescoço (HN), 6 abdominal SDHD e torácica (AT) e 13 amostras BVS comparado a medula supra-renal normais [33]. Tal como relatado, a análise de predição de microarray identificou 6937 genes como característica para um dos diferentes subgrupos de Pheos pseudohypoxic /pGLS. Estes foram mapeados em uma lista de 254 MAPK genes da via (Kyoto Encyclopedia of Genes e Genome Caminho). Predominante sobre-expressão em amostras SDHB comparação com medula normal foi confirmada por análise de variância e intervalos foram baseadas na estatística de gama studentized, método de “Honest Significant Difference” de Tukey.

Declaração de Ética

coleta de tecido foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do

Eunice Kennedy Shriver

Institutos Nacionais de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente.

tumor humano tecido

tecido FEO /PGL foi imediatamente congelado após a ressecção. As informações do paciente e do tumor para cada amostra são apresentadas na Tabela 1. As amostras congeladas foram homogeneizadas em gelo no tecido Proteína Reagente de Extracção (Thermo Fisher Scientific Inc., Lafayette, CO, EUA) com 0,1% de inibidor de fosfatase (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , MA, EUA) e um inibidor de protease completo Mini-comprimido por 10 ml de solução (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA). Os homogenatos foram centrifugados a 10000 x g durante 5 minutos a 4 ° C. O sobrenadante foi usado como extracto de proteína.

de colheita celular

As células foram semeadas em placas de colagénio revestida [34] a 600.000 células /ml e deixadas a aderir durante um mínimo de 18 h antes que a mídia foi alterado para soluções de estatina 25 m ou controle de DMSO. soluções de tratamento foram renovados após 24 h. Após 48 h de tratamento, as células foram recolhidas com um polícia de borracha e lavadas 3 vezes em PBS gelado por centrifugação a 500 x g. As células foram recolhidas a 1500 x g, dissolveu-se em 0,1% cholamidopropyldimethylammoniopropanesulfate, contendo um inibidor de protease completo Mini-comprimido por 7 ml de solução (Roche Applied Science) e 0,5% de Fosfatase Inhibitor Cocktail 2 (Sigma-Aldrich Co.). As amostras foram sonicadas durante 2 minutos em gelo e, subsequentemente, centrifugadas a 10000 × g durante 10 min, 4 ° C. O sobrenadante foi usado como extrato de proteína.

Western blot

Para estimar concentrações de proteínas foi utilizado o Quant-iT Kit de ensaio de proteína (Invitrogen, Life Technologies Corporation). quantidades iguais de proteínas de extractos de tumores em tampão de gel de página de amostra LDS (Thermo Fisher Scientific) ou extractos de células em tampão de Lämmli foram carregadas em 4-20% Critério TGX géis pré-moldados (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) ou 12 fundido lado % de gel, separado por electroforese em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio, e transferidos para membranas de PVDF (Immobilon-P, Millipore Corporation EMD, Billerica, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas em leite em pó magro a 5% em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) com 0,01-0,05% de Tween 20 (Sigma-Aldrich Co.) durante 1 hora. Os anticorpos foram dissolvidos em 5% de albumina de soro bovino ou leite em pó a 5% sem gordura em Tris-salino tamponado (pH 7,6) com 0,01-0,05% de Tween 20. As membranas foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C ou durante 1 hora a temperatura do quarto. Os anticorpos primários foram clivados de coelho anti-caspase-3-, de coelho anti-p44 /p42 MAPK, de coelho anti-fosfo-p44 /p42 MAPK, de coelho anti-PARP, de coelho anti-GAPDH (Cell Signaling, Technology Inc.), anti-murganho -β-actina (Sigma-Aldrich). Os anticorpos secundários foram burro ligada a HRP anti-coelho (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EUA), anticorpo de cabra anti-coelho e de cabra anti-ratinho (DAKO tanto North America, Inc., Carpinteria, CA). As membranas foram incubadas em Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) e exposto a um filme de alto desempenho Quimioluminescência (GE Healthcare) ou incubadas em Amersham ECL Primeiro Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) e visualizados num sistema ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories). As membranas foram retirados com Restaurar PLUS Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific) antes de re-bloqueio e incubação com outro anticorpo secundário.

A análise estatística

Foi utilizada uma abordagem em duas fases para avaliar a eficácia anti-proliferativo de cada fármaco para diminuir a viabilidade celular. No primeiro passo, cada um dos 6 drogas foi comparada separadamente ao veículo para cada nível de duração do tratamento, a dose e o tipo de célula. Os dados utilizados para estas análises foram os (replicados) as proporções dos valores bem droga dividida pela média do conjunto de valores associados controlo de DMSO. Estas proporções, de 2 a 4 experiências independentes, foram analisados ​​utilizando uma de duas vias de efeitos fixos ANOVA. Os valores de p resultantes foram Bonferroni corrigida, multiplicando-por 24, o número de configurações de duração, a dose e o tipo de célula para uma determinada droga. Em seguida, as drogas que diminuíram significativamente a proliferação global foram seleccionados e as durações e as doses mais eficazes para cada droga em cada tipo de células foram avaliadas: por um modelo ANOVA inicial, seguido de classificação com base na pós-ANOVA significa, seguida por Student-Newman- Keuls (SNK) testes post hoc para determinar o que significa diferiram significativamente. Os desempenhos globais das 3 drogas com melhores resultados foram comparados usando um 4-way ANOVA (fatores: drogas, duração, dose e tipo de célula); novamente SNK post hoc foram realizadas para determinar quais os fármacos foram geral significativamente diferente.

O efeito das estatinas combinados em comparação com cada indivíduo estatina foi avaliada de uma forma análoga. Os dados são apresentados como a média e o erro padrão (com base na ANOVA e o método de delta) de pelo menos duas experiências independentes. Os cálculos estatísticos foram realizados em Stata (Release 12, StataCorp., College Station, Texas, EUA).

Resultados

Evidência para MAPK de sinalização no feo SDHB /pGLS

como demonstrado anteriormente, a lovastatina exercido um efeito anti-proliferativo forte em células de PCP e de MTT, que foi associada com um decréscimo de 3 (pMAPK1 /3) níveis de fosfo-MAPK 1 e [1]. Para avaliar se o tratamento com estatinas pode ser benéfico para pacientes com pGLS metastáticos, avaliamos se pMAPK1 /3 estava presente nas pGLS agressivos SDHB derivados e outros feo hereditário /pGLS (Fig. 1A). As informações do paciente e do tumor para cada amostra são apresentados na Tabela 1. Entre os Pheos /pGLS humanos os níveis pMAPK1 /3 foram altamente variáveis. Embora os níveis médios pMAPK1 /3 eram comparativamente baixa em tumores SDHB em relação a outras amostras testadas, a fosforilação foi evidente em 4 de seis amostras SDHB. Não há diferença entre pGLS SDHB primárias e SDHB-metástases era evidente.

A. Western blot de pMAPK1 /3, o total MAPK1 /3, e GAPDH na feo /pGLS humanos. As informações do paciente e do tumor para cada amostra são apresentados na Tabela 1. Abreviaturas: B) SDHB, D) SDHD, N) NF1, H) medula supra-renal normais. B. Heatmap mostrando a expressão de 21 MAPK genes da via em feo pseudohypoxic /pGLS. A expressão destes genes foi 21 significativamente elevados em comparação com SDHB medula normal (p 0,002). Cada amostra foi atribuído um número. O identificador da amostra correspondente do artigo original [33] é dada na Tabela S1. As informações do paciente e link para os dados depositados são dadas no artigo original.

Além disso, avaliamos o perfil de expressão de mRNA de genes via MAPK em feo pseudohypoxic /pGLS. Mapeamento de 254 MAPK genes da via para 6937 genes previamente identificados de interesse [33] revelou um jogo de 85 genes. agrupamento hierárquico desses 85 genes revelados dois conjuntos de genes, um dos quais continha 21 genes que pareciam ser mais altamente expresso em SDHB e SDHD-AT feo /pGLS comparado a medula normal, adrenal e SDHD-HN e BVS feo /pGLS (Fig. 1B). Um olhar mais atento a estes 21 genes revelou geral expressão aumentada nas amostras SDHB comparado a medula supra-renal normal (p 0,002) (Fig. 1B) e uma análise de variância dos genes individuais com post-hoc confirmou significativamente maior expressão de MAPK12, CACNB3 , CACNG7, MAP4K2, MAP3K9, e MAPK6 em Pheos SDHB /pGLS que medula supra-renal normal (p≤0.02). Assim, certos aspectos de sinalização MAPK parecem estar activado nas mais agressivas SDHB derivados feo /pGLS, por isso alvo desta via pode ser uma abordagem de tratamento nova e promissora.

Comparação de

in vitro

eficácias de diferentes estatinas

Para determinar a eficiência de diferentes estatinas sobre feo /pGLS, foram utilizados dois modelos de mouse; linhas de células MTT e MPC. Nenhuma evidência para a disfunção ou subunidade mutação succinato desidrogenase é esperado em células MPC ou MTT, no entanto atualmente há melhor in-vitro modelo existe para estudar o efeito de novas opções terapêuticas para feo /pGLS. viabilidade celular relativa diminuiu com o aumento da duração do tratamento e a concentração das diferentes estatinas para MPC e MTT. Duração de três dias de tratamento com a maior concentração de 50 uM foi o mais eficaz para todas as estatinas (Fig. 2) e mostrou um efeito significativamente maior em comparação com a mesma dose e estatina no segundo dia de tratamento (SNK p≤0.029 para todos estatinas, exceto a pravastatina, que foi ineficaz).

a percentagem significativa resultados de todos os estatinas para todas as doses de tratamento nos diferentes durações de tratamento para MPC (a) e MTT (B). A percentagem de resultados significativos foi aumentado em comparação com MTT MPC após 48 e 72 h, sugerindo que MTT são mais sensíveis ao tratamento com estatina.

A ocorrência de forma significativa diminuição da viabilidade em relação ao veículo em comparação com a dose aumentada e duração do tratamento e estes efeitos foram mais pronunciados do que para MTT MPC, indicando uma maior susceptibilidade de o tipo de célula mais agressiva para o tratamento com estatinas (Fig. 2).

o efeito anti-proliferativo das seis estatinas diferiam significativamente (p 0,0001). A lovastatina, sinvastatina, fluvastatina e demonstrou maior inibição de proliferação (Fig. 3). A comparação directa das suas eficácias anti-proliferativas revelou maior potência da sinvastatina e fluvastatina em comparação com lovastatina (p = 0,033; simvastatina de lovastatina vs SNK p = 0,043, vs. fluvastatina lovastatina SNK p = 0,031).

MPC ( a-F) e de MTT (L-K) foram tratados com ▪ 6,25 uM, ▴ 12,50 uM, ▾ 25,00 uM, e ⧫ 50,00 uM de atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, rosuvastatina e simvastatina para 24, 48, e 72 horas.

Além de estabelecer que estatina é mais eficaz na inibição da proliferação celular em MPC e MTT, exploramos se a combinação de dois estatinas diferentes pode aumentar a eficácia. Curiosamente, os quatro combinações mais eficazes todas incluiu sinvastatina: sinvastatina /lovastatina, sinvastatina /fluvastatina, simvastatina /atorvastatina e sinvastatina /rosuvastatina. No entanto, nenhuma destas combinações diminuição da viabilidade em relação de forma mais eficaz do que as três mais eficazes estatinas, fluvastatina, simvastatina e lovastatina isoladamente (Fig. 4).

viabilidade Relativa de MPC (A) e de MTT (B) pelo as doses e durações indicada para os tratamentos combinados mais eficazes, incluindo a sinvastatina em relação a sinvastatina isoladamente.

Western blot revelou que os três estatinas mais eficazes tudo fosforilação MAPK inibida às 48 h do tratamento com 25? M (Fig . 5A). Além disso, fluvastatina, simvastatina, lovastatina e o aumento dos níveis do produto de clivagem de CASP-3 e PARP, indicando um aumento da apoptose (Fig. 5B).

. exibição de Western blot diminuição dos níveis de pMAPK1 /3 em tratados vs. MPC não tratada e MTT em relação ao total de MAPK1 /3 e GAPDH. B. de Western blot mostrando diminuição dos níveis de PARP intacta (faixas superiores) e aumento dos níveis de PARP clivada (bandas inferiores) em tratados vs não tratado MPC e MTT. Em conformidade, clivado CASP-3 foi elevada em células tratadas, indicando apoptose. As células foram tratadas com 25? M da estatina indicada por 48 horas.

Proliferação de nem MPC nem MTT foi impactado por 6,25 mM de qualquer estatina testado após 24 ou 48 h. No entanto, a migração de células espontânea de MPC e MTT foi severamente inibida por tratamento com 5 uM de fluvastatina, simvastatina, lovastatina e (fig. 6). capacidade migratória foi parcialmente resgatado por adição de 100 M trans farnesol, trans.

MPC (A) e MTT (B) foram semeadas em veículo (CTR), fluvastatina 5? M (Fluva), 5 mM sinvastatina (Simva ), 5 mM lovastatina (Lova) com ou sem 100 M farnesol trans, trans (FOH) e migração espontânea foi registrada para 24.

Discussão

Até o momento, nenhum tratamento curativo foi estabelecida para feo metastáticos /pGLS. No entanto, várias novas estratégias terapêuticas têm sido recentemente testada em organismos modelo [35] – [38], incluindo lovastatina [1]. Anteriormente, as estatinas têm sido relatados para diminuir a proliferação, a sobrevivência, a progressão do ciclo celular, e a migração de outras células, incluindo modelos de cancro agressivos, entre outros através de MAPK inibição da via [10], [25] – [27], [29], [30 ], [39] – [41]. No entanto, atualmente evidências de que o tratamento com estatinas será potente do tipo mais agressivo de feo /pGLS, ou seja, aqueles com mutações SDHB [42], está faltando.

Nossos dados indicam que MAPK1 /3 fosforilação está presente em alguns SDHB-pGLS, incluindo metástases. De acordo um estudo anterior mostrou aumento MAPK1 /3 fosforilação em lymphoblastoids imortalizadas de pacientes com Cowden-like variantes síndrome e da linha germinativa SDHB ou SDHD genes ou mutações [23]. Além disso, vários genes de vias de MAPK pareceu ser mais altamente expresso em SDHB-pGLS que na medula supra-renal normais. A função exata e potencial envolvimento dos genes identificados em SDHB-mutação tumorigênese mediada continuam a ser avaliada.

Em conclusão, pelo menos, um subconjunto de pacientes com pGLS agressivos que mostram MAPK1 /3 fosforilação podem se beneficiar do tratamento com estatina. Nossos dados indicam que este grupo de doentes não pode ser restringida a se agrupar 2 pacientes PGL. Determinação da MAPK1 /3 fosforilação em uma base caso a caso em pGLS metastáticas pode ser útil para a estimativa de um potencial benefício do tratamento com estatina.

Em um estudo com base microarray publicado anteriormente comparando feo /pGLS com diferentes origens genéticas, tumores SDHX derivados apresentaram diminuição MAPK gene da via de expressão em relação ao RET, NF1, TMEM127 e feo esporádico /pGLS [21]. A discrepância entre este resultado e os nossos dados pode ser devido ao facto de que, em relação a Ret, NF1, TMEM127, e certos esporádicos feo /pGLS, a sobre-regulação de genes de sinalização MAPK pode ser marginal na SDHB feo /pGLS, e assim não é detectável na ausência de tecido de controlo normal. Nossos dados de microarranjos revelou opor padrões de expressão em SDHB e pGLS SDHD-HN em relação à MAPK genes de sinalização; agrupamento assim essas amostras podem obscurecer a sobre-expressão de genes relacionados com a MAPK em Pheos SDHB /pGLS em comparação com outros feo /pGLS. Aqui apresentamos vários genes de sinalização MAPK que são em relação ao medula supra-renal normais up-regulamentados. Assim, conclui-se que o tratamento com estatinas, por si só ou combinado com outros regimes terapêuticos pode ser benéfico em certos derivados de SDHB feo /pGLS

Actualmente, sete estatinas são diferentes no mercado que -. Em adição ao seu colesterol – características abaixamento foram mostrados para interferir com diversas vias de cancro relevantes [43], [44]. As suas acções farmacológicas e impacto sobre a expressão de genes têm sido mostrados para diferir [43], [45], [46] e, portanto, dependendo das células a ser tratada, o medicamento mais eficaz tem de ser determinado. Aqui mostra-se que no caso da MPC e o MTT, o estatinas lipofílicas fluvastatina, simvastatina, lovastatina e reduziu consideravelmente a proliferação celular, com sinvastatina e fluvastatina mostrando efeitos ligeiramente mais fortes. A pravastatina foi demonstrado ser ineficaz em vários modelos de cancro [47], [48], que pode ser devido às suas características hidrofílicas e a ausência de transportadores adequados nas células tumorais. Em outros estudos que compararam os efeitos de várias estatinas, simvastatina ou fluvastatina pareceu mais eficaz do que a lovastatina [24], [30]. Para estudos adicionais, poderá considerar-se ao fato de que as características farmacocinéticas de fluvastatina tem sido relatada como sendo preferível para aqueles de simvastatina e lovastatina [45].

Interessantemente, as células MTT mais agressivos parecia ser mais sensíveis ao tratamento com estatina, o que indica que as células mais agressivos podem ser mais receptivos para os efeitos anti-proliferativos das estatinas. A diferença no mecanismo render MTT continua a ser mais susceptíveis de ser elucidados.

A concentração máxima registada estatina no sangue humano após administração por via oral (12,3 ^ M) [49] era na gama de a nossa terceira maior concentração (12,5 mM) , que diminuíram significativamente a proliferação celular em MPC e MTT a 48 ou 72 horas de tratamento com fluvastatina, lovastatina e simvastatina. Holstein et ai. informou que até 415 mg /m

2 por via oral a cada seis horas durante quatro dias foram bem toleradas por pacientes com doenças malignas graves [49]. No entanto, os níveis de estatina no sangue não aumentam de uma forma linear, e, assim, a administração oral pode não ser a melhor opção para atingir concentrações elevadas do tecido. técnicas de administração óptimas para alcançar as concentrações segmentados terá de ser determinada. efeitos negligenciáveis ​​de estatinas em células normais comparativamente com as células cancerosas têm sido relatada [24], [50].

A concentrações não tóxicas, podem ser obtidas com a administração oral, as estatinas têm sido referido como exibindo um outro efeito anti-cancro , a inibição da migração celular e invasão [9], [47], [51]. Por esta razão, nós testamos a consequência das estatinas eficazes, lovastatina, sinvastatina e fluvastatina sobre motilidade celular espontânea do MPC e MTT a 5? M. Os nossos ensaios de proliferação não mostrou qualquer redução na proliferação em 6,5? M em 24 horas de tratamento. A lovastatina, fluvastatina, simvastatina e inibiu eficazmente a migração da MPC e MTT no prazo de 24 horas. A migração de inibição pareceu ser, pelo menos, parcialmente dependente da depleção de farnesilo, uma vez que a presença de ácido trans, trans farnesol capacidade migratória, em parte, salvado. No entanto, até mesmo uma concentração relativamente elevada de 100? M Ácido trans, trans farnesol não inteiramente inverter o efeito anti-migratório das três estatinas. Assim, não podem ser excluídos os efeitos independentes da farnesilação de estatinas em MPC e MTT. Num estudo anterior, pirofosfato de geranilgeranilo tem sido demonstrado ser mais eficaz em reverter o efeito de que as estatinas farnesilpirofosfato [24]. Além disso, os efeitos dependentes de estatina não-mevalonato pathway sobre as células cancerosas, também têm sido descritos [43].

Uma vez que a administração oral das estatinas não produz concentrações tão elevadas como usado aqui para alcançar os melhores efeitos anti-proliferativos em in vitro, a administração combinada de outras drogas parece ser uma estratégia promissora. O sunitinib e sorafenib inibidores multiquinase também afectar a via da MAPK e foi demonstrado ser eficaz no pGLS metastático progressivo [52], [53]. o tratamento com sunitinib demonstrou efeitos clínicos benéficos em 8 dos 17 pacientes com pGLS metastáticos progressivas. Curiosamente, 6 dos respondentes realizada SDHB-mutações. No entanto, como a maioria das drogas anti-neoplásicas, os efeitos colaterais dos inibidores de multiquinase pode ser grave e nove dos 17 pacientes tratados com sunitinib tiveram de interromper o tratamento ou diminuir a dose eventualmente.

Um efeito sinérgico de fluvastatina e sorafenib tem sido apresentada para células de melanoma in vitro [54]. Este tem o potencial de reduzir concentrações de inibidor multiquinase, que podem aliviar a gravidade dos efeitos secundários enquanto desempenho anti-tumoral é mantida. No entanto, mais estudos são obrigados a determinar se a combinação de inibidores multiquinase com estatinas podem ter efeitos aditivos em pGLS agressivos. Como relatado anteriormente, a inibição combinada da via PI3K /AKT e mTORC1 sinalização /2 foi sugerida como regime terapêutico promissor para certas pGLS [1].

Em conclusão, as estatinas podem ser um benefício por si só ou em combinação com outra terapêutica regimes em pacientes com feo agressivos /pGLS que mostram atividade da via MAPK.

informação de apoio

Tabela S1.

números de amostra da Figura 1A com o chip identificadores e identificadores de amostra Shankavaram Fliedner et ai. Neoplasia 2013 15: 435-447. As informações do paciente e link para dados de microarranjos depositados são dadas no artigo original

doi:. 10.1371 /journal.pone.0097712.s001

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Reconhecimentos

Gostaríamos gostaria de agradecer ao Dr. Tischler e Dr. Martiniova para fornecer células MPC e MTT, respectivamente. Somos gratos também ao Dr. Perwitz, Ms. Maushagen, e Ms. Resch para fornecer aconselhamento especializado e anticorpos. Além disso, gostaríamos de expressar a nossa gratidão ao Prof. Aherrahrou e Dr. Perwitz, para a partilha generosa de seus equipamentos.