Abstract

Dado que a exposição prolongada ao estrogênio e aumento da atividade da telomerase são associados com carcinogênese endometrial, o nosso objectivo foi avaliar a interação entre a via MAPK e indução de estrogénio da actividade da telomerase em células de câncer de endométrio. Estradiol (E2) a actividade da telomerase e induzida a expressão de ARNm da hTERT no receptor de estrogénio (ER) -α, linha celular de cancro do endométrio positivo Ishikawa. UO126, um inibidor altamente selectivo de MEK1 /MEK2, inibiu a actividade de telomerase e a expressão de ARNm da hTERT induzida por E2. Resultados semelhantes também foram encontrados após a transfecção com ARNsi de ERK 1/2-específica. O tratamento com E2 resultou na rápida fosforilação da p44 /42 MAPK e aumento da atividade MAPK que foi abolido por UO126. O promotor de hTERT contém dois elementos de resposta a estrogénios (eres), e ensaios de luciferase demonstrar que estes EREs são activados por E2. A exposição a UO126 ou ERK siARN 1/2-específica, em combinação com E2 contrariado o efeito estimulador de E2 sobre a actividade de luciferase a partir destes EREs. Estes achados sugerem que E2-indução da atividade da telomerase é mediada pela via da MAPK em células de cancro do endométrio humano

Citation:. Zhou C, Steplowski TA, Dickens HK, Malloy KM, Gehrig PA, Boggess JF, et al . (2013) Estrogênio Indução de telomerase atividade por meio de regulamento do Protein Mitógeno-quinase ativada (MAPK) Dependente em células de cancro do endométrio humano. PLoS ONE 8 (2): e55730. doi: 10.1371 /journal.pone.0055730

editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Itália |

Recebido: 06 de novembro de 2012; Aceito: 29 de dezembro de 2012; Publicação: 07 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi generosamente apoiado pela Fundação V para Pesquisa do Câncer e do Fundo Steelman (Bae-Jump VL e Gehrig PA). O projeto descrito foi apoiada também por (1) Award Número KL2RR025746 (UNC clínica translacional Ciência Award-K12 Scholars Program) do Centro Nacional de Investigação Recursos (Bae-Jump VL) e (2) Award Número 1K23CA143154-01A1 (NIH /NCI K23 Mentored paciente-Oriented Grant Research Desenvolvimento de Carreira). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer endometrial é o tumor maligno mais mais comum em mulheres nos Estados Unidos [1]. Endógeno e exógeno exposição estrogênio são os principais fatores de risco para o desenvolvimento de tipo I endometrial cancros; no entanto, a ligação molecular entre estrogênio e carcinogênese endometrial permanece mal compreendido. Nossos trabalhos anteriores demonstraram que a regulação de estrogênio de telomerase podem potencialmente desempenhar um papel na transformação maligna do endométrio [2].

Os telómeros são estruturas especializadas da extremidade distal de cromossomas e função na proteção do cromossomo, posicionamento e replicação. Com o envelhecimento, os telómeros humanos inevitavelmente submetidos a redução progressiva em células somáticas normais através da perda dependente da sequência de replicação nas extremidades terminais do ADN. O encurtamento progressivo dos telômeros, eventualmente, resulta em instabilidade cromossômica, levando a senescência celular. A telomerase é uma transcriptase inversa sintetiza ADN que ribonucleoproteína telomérica em extremidades cromossómicas. Este enzima reconhece a cadeia rica em G de uma sequência do telómero de repetição existentes e sintetiza uma nova cópia da sequência de repetição na ausência de uma cadeia de ADN complementar, com um segmento da sua componente de RNA interna que serve como um modelo de [3], [4 ]. Assim, a telomerase é constituído por um molde de ARN (ARN da telomerase humana, hTR) e a proteína hTERT catalítico que possui actividade de transcriptase reversa (telomerase humana transcriptase reversa hTERT) [5] – [7]. A expressão de hTERT é observado em níveis elevados em células de cancro da telomerase-positiva, mas não em células de telomerase-negativo, e é considerado o determinante limitante da taxa de actividade da telomerase [7], [8].

Mais 85% dos carcinomas endometriais humanas expressam actividade de telomerase [9] – [12], e o nível de actividade de telomerase tem sido correlacionada com a doença em fase avançada e com metástases nos linfonodos pélvica [12]. O endométrio humano é um tecido dinâmico exclusivamente, consistindo de glândulas epiteliais e do tecido conjuntivo que sofre padrões complexos de proliferação, secreção, e colapso ao longo dos anos reprodutivos. Durante o ciclo menstrual, as células epiteliais do endométrio são regulados pela hormônios sexuais estrogênio e progesterona, e carcionogenesis endometrial é pensado para ser associado com a exposição prolongada ao estrogênio, sem oposição pela progesterona. No endométrio normal, a expressão da telomerase está correlacionado com a proliferação celular, está tipicamente localizada nas células epiteliais glandulares, e que é regulado de forma hormonalmente-driven, menstrual dependente da fase de [13], [14]. O aumento da actividade de telomerase é observada na fase proliferativa quando os níveis de estrogénio são máxima seguida por níveis próximos ausente na fase secretora em que os níveis de progesterona são elevadas [13]. Tal evidência sugere uma relação entre os níveis de esteróides sexuais, a modulação da actividade da telomerase e o desenvolvimento de cancro do endométrio.

A região do promotor de hTERT foi clonada e caracterizada e contém dois elementos de resposta ao estrogénio putativos (EREs), implicando uma ligação directa entre estrogênio e regulação telomerase [2], [15] – [18]. Temos encontrado anteriormente que a atividade da telomerase e mRNA hTERT foram aumentados em resposta ao estrogênio em um receptor α-(ERa) forma dependente de estrógeno em linhas celulares de cancro do endométrio [2]. Além disso, demonstramos ligação do estrogénio complexado com ERa para as EREs encontrados dentro do promotor hTERT, indicativo de um possível mecanismo subjacente entre indução telomerase ea transformação maligna das células hormono-dependentes endometriais [2].

Mitogen- proteína-quinases activadas (MAPK) são uma importante família de proteínas quinases envolvidas na transmissão de sinais a partir da membrana celular para o núcleo. É bem conhecido que a p44 /42 MAPK via de sinalização é activado por estímulos mitogénicos de factores de crescimento e hormonas esteróides sexuais, tais como estrogénios, progesterona, e factor de crescimento epidérmico (EGF) no cancro da mama humano, células de cancro do ovário e do endométrio, entre outros [ ,,,0],19] – [21]. A fim de obter insights sobre os mecanismos moleculares que controlam a regulação da atividade da telomerase pelo estrogênio, que examinaram a relação entre a via de MAPK e atividade da telomerase induzida por estrogénio em células de cancro do endométrio humanos.

Materiais e Métodos

Cultura de células e Reagentes

A regulação da expressão da telomerase foi investigada em (HEC-1B) linhas celulares de cancro do endométrio humano ER-positivo (Ishikawa) e ER-negativos [22], [23]. Estas linhas celulares foram fornecidos como presente pelo Dr. Bruce Lessey (Centro de Medicina da Mulher, Greenville, SC). Como descrito anteriormente, induzida por estrogénio ERE cloranfenicol acetiltransferase actividade (CAT) foi determinada em cada uma destas linhas celulares para confirmar o estado ER funcional [24]. células de Ishikawa e HEC-1B foram cultivadas em MEM suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS), 100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina na presença de CO% 5

2 a 37 ° C. As linhas celulares de cancro do endométrio foram cultivadas em meio isento de vermelho de fenol com 0,5%

Chemicals and plasmídeo

Todos repórter hTERT carvão-dextrano tratado com SBF durante 1 dia antes do tratamento com estrogénio ou U0126. plasmídeos de luciferase do promotor foram fornecidos pelo Dr. I. Horikawa (Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, MD). estradiol 17-β (E2) foi adquirido da Sigma (St. Louis, MO). UO126 foi adquirido de Calbiochem (La Jolla, CA). A p42 anti-fosforilada /44 e anti-44 não fosforilado p42 /anticorpos foram de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). O anticorpo anti-actina foi β da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os quimioluminescência aumentada ocidentais reagentes de detecção blot foram de Amersham (Arlington Heights, IL). Todos os outros produtos químicos eram da Sigma (St. Louis, MO).

E2 e Tratamento U0126

As células foram semeadas a 4 x 10

5 células por balão de cultura T25 ou 1,5 × 10

5 células por poço de uma placa de 12 poços, contendo quer 5 ml ou 1,2 ml de meio regulares, respectivamente. O meio foi em seguida mudado para meio isento de vermelho de fenol com 0,5% de FBS despojado de incubação a 37 ° C durante a noite. Imediatamente antes do tratamento, o meio em placas de cultura foi aspirado, triplamente lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e substituído com meio fresco. E2 dissolvido em álcool etílico ou U0126 dissolvido em DMSO foi posteriormente adicionada a cada poço. Simultaneamente, foi adicionada a mesma quantidade de álcool etílico ou DMSO para os poços de controlo.

A telomerase Ensaio de Actividade

a actividade de telomerase foi medida utilizando um protocolo de repetição telomérica de amplificação à base de PCR (TRAP) (TRAP kit de detecção de telomerase -eze, Oncor, Gaithersburg, MA). Resumidamente, os sedimentos celulares foram lisados, homogeneizada com 105 uL de 1 × CHAPS gelada, colocados em gelo durante 30 minutos, e centrifugou-se a 13000 g durante 21 min a 4 ° C. O sobrenadante resultante foi em seguida transferido para um novo tubo e armazenado a -80 ° C. Uma amostra do extracto foi feita e, em seguida, a concentração de proteína foi determinada usando o kit BCA (Bio-Rad, Hercules, CA). Entre 0,25 e 05 ug de proteína, colocada numa mistura reaccional de 50 ul, foi usado para o ensaio TRAP. Após 30 min de incubação a 30 ° C, foram realizados 27 ciclos de amplificação por PCR (30 min a 94 ° C, seguido de 30 min a 59 ° C). Os produtos de PCR foram então analisados ​​por electroforese em géis de 10% não desnaturantes de poliacrilamida. Os geles foram analisados ​​e quantificados utilizando o sistema de imagiologia com fósforo com software Imagequant (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA). Cada experiência foi realizada duas vezes.

em tempo real de RT-PCR para hTERT

O ARN total foi isolado utilizando o kit de RNAqueous (Ambion, Austin, TX) e adicionalmente purificado utilizando o kit DNA-free (Ambion, Austin, TX). A transcrição reversa e as reacções de PCR foram realizadas utilizando o kit de um-passo TaqMan ouro de RT-PCR no sistema de detecção ABI Prism Sequence 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). A transcrição reversa foi levada a cabo a 48 ° C durante 30 min. As condições de PCR consistiram em um passo de 10 min a 95 ° C e 40 ciclos entre 95 ° C durante 15 s e 65 ° C durante 1 min. Um controlo do gene de arrumação, ácido P0 fosfoproteína ribossomal (RPLP0, também conhecido como 36B4), foi utilizado como um controlo interno para corrigir as diferenças na quantidade de ARN em cada amostra [25]. Os iniciadores e sondas fluorogénicas para hTERT e RPLP0 foram descritos anteriormente [25]. A curva padrão para hTERT foi gerado usando diluições de uma quantidade conhecida de ARNc sintetizados por

In vitro

transcrição de um fragmento clonado. O nível normalizado de hTERT em cada amostra foi estimado por uma razão entre o nível para o nível de hTERT RPLP0, como descrito anteriormente [25]. As experiências foram realizadas em duplicata e repetido duas vezes para a consistência.

Análise Western Blot

células Ishikawa foram plaqueadas a uma densidade de 3 x 10

5 células /poço em placas de seis poços. Após 24 horas, o meio foi aspirado e substituído com meio isento de soro. Após 24 horas, as células foram tratadas com E2, UO126 ou ambos em combinação para um mínimo de 15 minutos e um máximo de 24 horas. As chapas foram raspadas com tampão RIPA e os lisados ​​celulares foram preparados em tampão de SDS a 2 ×. Os lisados ​​celulares foram separados por gel de SDS-PAGE 12% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi bloqueada durante 1 hora em TBS-T + leite seco magro a 5%, e, em seguida, incubadas com phosphophorylated-p44 /42 MAPK anticorpo monoclonal (1:2000) ou pan-p44 /42 MAPK anticorpo policlonal (1:1000) durante a noite a 4 ° C (Cell Signaling, Beverly, MA). A membrana foi então lavada com TBS-T e incubadas com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase durante 1 hora. A ligação do anticorpo foi detectada utilizando um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL). intensidades líquidas da banda foram quantificados utilizando um sistema digital BioImaging Millipore (Bedford, MA). Cada experimento foi realizado duas vezes.

In Vitro

Kinase Assay

Atividade da atividade p44 /42 quinase foi medida

in vitro

usando o p44 /42 kit de ensaio de cinase MAP (Cell Signaling, Danvers, MA). Resumidamente, as células de Ishikawa foram plaqueadas a uma densidade de 3 x 10

5 células /poço em placas de seis poços. Seguindo E2 e tratamento UO126, as placas foram lavadas 4 vezes com PBS gelado, e 0,5 mL de tampão de lise arrefecido em gelo 1 mM PMSF foi adicionado a cada poço. As células foram raspadas, sonicada e centrifugada a 10000 g durante 10 min a 4 ° C. O sobrenadante resultante foi incubado com 15 uL de ressuspenso fosfo-p44 /42 MAP cinase imobilizada (Thr202 /Tyr204) anticorpo monoclonal, durante 12 h a 4 ° C. O complexo imune foi lavada com tampão de lise de 5 vezes e uma vez com tampão de quinase sem substrato. Imunoprecipitada MAPK foi então incubado durante 30 min a 30 ° C em tampão de quinase com proteína de fusão Elk1 2 ug e 200 uM de ATP. A reacção da cinase foi parada pela adição de 25 ul de 3 × tampão de SDS. Elk1 foi separada por electroforese em gel de SDS-PAGE, e foi, em seguida, incubadas com o anticorpo, a 4 ° C durante a noite anti-fosfo-Elk1 (Ser 308). Elk1 foi detectado com ECL como descrito para a análise Western Blot. Cada experiência foi realizada duas vezes.

ensaio da luciferase

transfecção transitória de plasmídeos repórter da luciferase foi realizada utilizando o Reagente de Transfecção TransFast (Promega, Madison, WI). Resumidamente, 8 × 10

4 de células Ishikawa foram semeadas em placas de 24 poços durante a noite e transfectadas com plasmídeos de luciferase do promotor (0,5 ug /poço). O pRL-SV40 (2 ng /poço) contendo luciferase de Renilla reniformis foi co-transfectada em cada transfecção, como um controlo interno para normalizar a actividade transcricional do promotor hTERT plasmídeos. O ensaio de luciferase foi então realizada utilizando o Sistema de Ensaio de Luciferase Reporter duplo (Promega, Madison, WI) de acordo com protocolos fornecidos pelo fabricante. Todas as experiências foram realizadas em triplicado para cada plasmídeo, e cada experiência foi realizada duas vezes.

ERK 1/2 siARN ensaio

ERK 1/2 pequeno ARN interferente (siRNA) foi adquirido a Cell Signaling tecnologia (Danvers, MA). De acordo com as instruções do fabricante, as células Ishikawa foram plaqueadas em placas de 6 poços ou placas de 12 poços numa concentração de células recomendadas. Após 24 horas, as transfecções foram realizadas em confluência de aproximadamente 60%, utilizando o reagente de transfecção (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Para cada reacção de transfecção, 100 nM de ERK 1/2 ou ARNsi de controlo foi utilizado para a preparação de complexos de siRNA-transfecção à temperatura ambiente durante 15 min. As transfecções foram realizadas em 0,5 (12-well plate) ou 1,5 mL (placa de 6 poços) meio isento de soro, durante 8 h. Após a incubação, os complexos de transfecção foram removidos e substituídos com os seus meios de comunicação correspondentes. Em cada experiência, foram incluídos controlos não tratados que receberam o reagente de transfecção. A eficiência de transfecção (80% -90%) foi determinado por microscópio de fluorescência em células transfectadas siRNA não específicos marcada com f luoresceina e por análise de transferência de Western. As células foram utilizadas para análise de Western blot, ensaio TRAP, atividade lucifersae e PCR em tempo real em 36-48 horas após transfecção.

Resultados

O efeito da E2 no mRNA hTERT e da atividade da telomerase em Ishikawa células

na linha celular Ishikawa, E2 foi encontrado para aumentar a actividade da telomerase de uma forma dependente da dose, tal como avaliado pelo ensaio TRAP (Figura 1A). O aumento da actividade era tanto dependente da concentração de E2 e duração do tempo de exposição. Quando 0,1-10 mM de E2 foi adicionado, a atividade da telomerase foi regulado para cima, às 12 horas, o que persistiu até, pelo menos, 72 horas após o tratamento. O tratamento de células com 1-10 uM de E2 para a actividade da telomerase máxima induzida superior a 48 horas. Nenhum efeito de E2 sobre a actividade de telomerase foi detectado na linha celular de cancro do endométrio negativo ERa (HEC-1B), sob as mesmas condições de tratamento (dados não mostrados).

As células foram tratadas com diferentes concentrações de E2 (0,1 -10 uM) durante 48 h ou tratados com 1 uM de E2 de maneira tempo-curso (a). a actividade de telomerase foi determinada pelo ensaio TRAP. expressão de ARN de hTERT foi avaliada por em tempo real de RT-PCR (B). Os dados são apresentados como médias ± DP de amostras duplicadas de, pelo menos duas experiências independentes. (ITAS = telomerase ensaio padrão interno, C = controlo).

Para compreender o mecanismo subjacente à indução da actividade de telomerase, que quantificados por ensaio em tempo real de RT-PCR, o nível de expressão de ARNm da hTERT sob as mesmas condições. O gene hTERT codifica a subunidade catalítica da telomerase e é geralmente o determinante limitante da taxa de actividade da telomerase enzimática. E2 aumentou a expressão de ARNm da hTERT de um modo dependente da dose (1-10 uM). Esta sobre-regulação de actividade foi observada dentro de 6 horas após o tratamento com E2 e indução máxima da expressão de ARNm da hTERT foi observada em 48 h. -E2 induzida a expressão de ARNm da hTERT permaneceu elevada durante mais de 72 horas (Figura 1B). Estes resultados sugerem que a regulação da atividade da telomerase por E2 pode ocorrer ao nível da transcrição em células de câncer de endométrio.

O efeito da UO126 sobre a atividade da telomerase e expressão de mRNA hTERT nas células Ishikawa

Para endereço o papel da via de MAPK em actividade de telomerase induzida E2 em células de Ishikawa, que inicialmente avaliada a capacidade de UO126, um inibidor de MEK1 e MEK2 específico, para inibir directamente a actividade da telomerase. Nas células de Ishikawa, UO126 inibiu a actividade da telomerase de uma forma dependente da dose (0,1-10? M), como demonstrado pelo ensaio TRAP (Figura 2A e 2B). Em paralelo, UO126 diminuição da expressão de ARNm da hTERT de um modo dependente da dose, como quantificado pelo tempo real de RT-PCR (Figura 2C). Estes resultados demonstram que UO126 é suficiente para inibir a actividade da telomerase e o ARNm da hTERT de transcrição em células de cancro do endométrio.

As células Ishikawa foram tratados com UO126 a várias concentrações (0,1-10 uM) durante 24 h. a actividade de telomerase foi avaliado pelo ensaio TRAP (A e B) a expressão de hTERT foi avaliada pelo tempo real de RT-PCR (C). (C = controle).

O efeito da UO126 sobre a atividade da telomerase induzida por E2 e expressão do mRNA hTERT nas células Ishikawa

Para investigar o impacto da UO126 sobre a atividade da telomerase induzida E2 e a expressão de ARNm da hTERT, as células foram tratadas com 10? M de UO126, 1 uM de E2, ou uma combinação de ambos (10 uM UO126 + 1 uM E2) durante 24 horas, e a actividade da telomerase e a expressão de hTERT foi subsequentemente determinada. Como mostrado na Figura 3, E2 induziu um aumento da actividade de telomerase e a expressão de ARNm da hTERT de cerca de 2-3 vezes a dos controlos, e estes efeitos estimuladores foram praticamente abolida na presença de UO126 (10 uM). Estes dados sugerem que a função do inibidor de MEK, UO126, ocorre não só ao nível da própria enzima telomerase, mas também ao nível da transcrição do gene hTERT.

As células foram tratadas com 10 uM UO126 ( L), 1 uM de E2 ou ambos em combinação, durante 24 h. (A) A actividade de telomerase foi avaliado pelo ensaio TRAP. actividade (B) A telomerase representada em gráfico de utilizar TPG (produto total gerado) que corresponde à actividade da telomerase relativa. TPG é calculada a partir da razão da banda do produto armadilha para a banda interna padrão de ensaio da telomerase. expressão (C) ARNm da hTERT foi determinada pelo tempo real de RT-PCR. (C = controle).

O efeito da UO126 sobre a ativação induzida por E2 de p44 /42

A fim de avaliar a interacção entre E2 e da via MAPK, foi utilizado um anticorpo da MAPK p44 /42-específica fosforilado para identificar a fosforilação da tirosina induzida por E2 destas cinases na linha celular Ishikawa. Em condições privadas de soro, observamos um baixo nível basal de formas de tirosina-fosforilada de p44 /42. A seguir ao tratamento com 1 uM E2, fosforilação de p44 /42, foi rapidamente induzida e atingiu indução máxima 30 minutos após o tratamento. O nível de fosforilação de p44 /42 permaneceu elevada durante cerca de 60 min (Figura 4A). O nível total de proteína p44 /42 MAPK permaneceu constante ao longo destas experiências, conforme determinado por meio de um anticorpo não-fosforilada em p44 /42 para as mesmas membranas celulares. A incubação com 10 ^ M UO126 bloqueou completamente a fosforilação induzida por E2 de p44 /42 (Figura 4B e 4C).

As células foram tratadas com 1 uM de E2, 10 uM UO126 (L) ou uma combinação de ambos para um mínimo de 15 minutos e um máximo de 24 horas. Fosforilação de p42 /44 foi determinada por análise de transferência de Western. actividade de MAPK foi avaliada por ensaio de imunoprecipitação de Elk1. E2 fosforilação induzida de P42 /44 (A) e a actividade de MAPK, de forma dependente do tempo (D). UO126 inibiu a fosforilação de p42 /44 MAPK e actividade induzida por E2 (B, C e E). (C = controlo).

Para confirmar que o aumento da fosforilação de p44 /42 representada a actividade enzimática da proteína, medimos a actividade p44 /42-quinase por meio de um ensaio de cinase complexa imunitária em que Elk1 servido como o substrato. O factor de transcrição Elk1 é um alvo a jusante bem conhecido de p44 /42 e considerada um marcador de actividade de MAPK. Observou-se um aumento mensurável na actividade de p44 /42, após a estimulação de E2, com um pico máximo a 30 min. A actividade de p44 /42 quinase foi proporcional ao grau de fosforilação de p44 /42. UO126 também diminuiu a /42 actividade de quinase p44 induzida por E2 (Figura 4D e 4E). Estes dados confirmam uma relação entre E2 e de sinalização da via de MAPK na linha celular Ishikawa.

O efeito de E2 e UO126 na actividade do promotor hTERT

Com base no nosso trabalho anterior em linhas celulares de cancro do endométrio [2], a actividade de transcrição do promotor de hTERT pode ser mediada pela ligação a ERa EREs localizados sobre este promotor. A sequência de promotor reguladora do gene hTERT contém dois EREs putativos na sequência de flancos 5 ‘: a uma distai em -2777 /-2755 e um proximal em -979 /-956, que se sobrepõe a um local de ligação de Sp1 [16], [ ,,,0],17]. Para determinar se UO126 está envolvido na regulação da actividade do promotor de hTERT induzida por E2, foi realizada uma série de transfecções transientes com plasmídeos repórter da luciferase contendo os diferentes comprimentos da região promotora a 5 ‘do gene hTERT. Em resumo, as células de Ishikawa foram transfectadas com dois repórteres ERE-responsivas, uma das quais continha ambos os sítios ERE, e outro que continha apenas o sítio proximal ERE /Sp1 (Figura 5A). Como mostrado na Figura 5B, E2 aumento da actividade de luciferase a partir de ambos os repórteres de aproximadamente 2,5 a 3 vezes o do controlo. UO126 bloqueou eficazmente a actividade de luciferase a partir destes repórteres na presença de E2 (Figura 5B). Estes resultados sugerem que a via da MAPK está envolvida na E2 /ERa-activação dos EREs no promotor hTERT; e, assim, esta via pode ser crítico na mediação da actividade transcricional de hTERT induzida por E2.

diagrama esquemático de plasmídeos de luciferase do promotor de hTERT que mostram dois locais de ligação ao promotor-núcleo do ERE e (A). As células Ishikawa foram transfectadas com plasmídeos de luciferase do promotor de hTERT e a actividade de luciferase foi ensaiada após exposição a 1 uM E2 ou 10 uM UO126 (L) durante 36 h. Os dados são apresentados como médias ± DP de amostras duplicadas de, pelo menos duas experiências independentes. (C = controle).

Os efeitos da ERK1 /2-específica siRNA em combinação com E2 sobre a atividade da telomerase, expressão hTERT e atividade do promotor hTERT nas células Ishikawa

A fim de verificar o envolvimento da via MAPK na indução da actividade da telomerase E2, foram examinados os efeitos de transfecção com ERK 2/1-específica siARN em combinação com E2 a actividade da telomerase, a expressão da hTERT e a actividade do promotor hTERT na linha celular Ishikawa. ERK1 /2 de siRNA-específica reduzida da fosforilação p42 /44 induzida por estrogénio em 48 horas, conforme determinado por análise de transferência de Western (Figura 6A). Por quantificação densitométrica normalizados para controlar proteína eIF4E, E2 aumento da fosforilação de p42 /44, de 29%, e E2 na presença de ERK1 /2 de siRNA específica diminuiu a fosforilação de p42 /44, de 79%. a actividade de telomerase e a expressão de hTERT foram ensaiadas pelo ensaio TRAP e em tempo real de RT-PCR em 48 horas (Figura 6B e 6C). Semelhante ao tratamento com U0126, induzida por um aumento da actividade da telomerase E2 e a expressão de ARNm da hTERT de cerca de 2-3 vezes a dos controlos, e estes efeitos estimuladores foram praticamente abolida na presença de ERK siARN 1/2-específica. Lucifersae actividade foi ensaiada após as células foram transfectadas com 2 de siRNA ERK1 /durante 24 h, seguida por transfecção com o plasmídeo de luciferase do promotor hTERT (P3915) e, em seguida, o tratamento com estrogénio 1 uM durante 36 horas (Figura 6D). Como encontrado para UO126, transfecção com um siRNA de ERK bloqueou eficazmente a actividade /2-específica da luciferase a partir do promotor P3915 na presença de E2. Estes resultados fornecem evidências adicionais da inter-relação entre a via de MAPK e indução E2-mediada da atividade transcricional hTERT.

As células foram ou transfectadas com ERK1 /2 siRNA ou controle negativo (Neg) durante 8 horas e em seguida, tratada com 1 uM de estrogénio durante 36-48 hr. O efeito da transfecção com um siRNA de ERK /2-specfic sobre a fosforilação de p42 /p44 induzida por estrogénio foi avaliada por transferência de Western em 48 horas (Figura 6A). a actividade de telomerase e a expressão de hTERT foram ensaiadas pelo ensaio TRAP e em tempo real de RT-PCR em 48 horas (Figura 6B e 6C). Lucifersae actividade foi ensaiada após as células foram transfectadas com 2 de siRNA ERK1 /durante 24 h, seguida por transfecção com o plasmídeo de luciferase do promotor hTERT (P3915) e, em seguida, o tratamento com estrogénio 1 uM durante 36 horas (Figura 6D). (ITAS = padrão interno ensaio de telomerase, C = controle).

Discussão

Temos demonstrado anteriormente que a E2 induz a atividade da telomerase e expressão de mRNA hTERT em linhas celulares de cancro do endométrio ER-positivos , potencialmente através de ligação do estrogénio complexado com ERa para EREs encontrados dentro do promotor hTERT. No presente estudo, nós quisemos provocar o mecanismo molecular subjacente envolvido na regulação da actividade da telomerase e a expressão de ARNm da hTERT induzida por E2 na linha celular Ishikawa ERa-positiva. Dada a relação bem estabelecida entre ERa e da via de MAPK, parece lógico que esta via pode ser envolvido na indução da telomerase por E2.

O tratamento com UO126, um inibidor altamente selectivo da ambos MEK1 e MEK2, a actividade da telomerase e inibiu a expressão de ARNm da hTERT nas células de Ishikawa. Além disso, U0126 bloquearam completamente a actividade de telomerase E2-estimulado e a expressão de ARNm da hTERT. Resultados semelhantes também foram encontrados após transfecção com ERK 1/2 espec�ico siRNA. O tratamento com E2 resultou na rápida fosforilação de p44 /42 MAPK e aumento da atividade funcional MAPK, e este efeito pode ser abolida através da adição de UO126. Os ensaios de luciferase demonstram que a exposição ao UO126 ERK ou um ARNsi /2-específica contrariado o efeito estimulador do tratamento de E2 em EREs localizados no promotor hTERT. Assim, fornecem evidências de que E2 induz a actividade de telomerase e a expressão de ARNm da hTERT em ERa-positivos células de cancro do endométrio que é dependente da sinalização através da via de MAPK. Para nosso conhecimento, apenas um outro estudo tem implicado um papel cooperativo para MAPK na regulação da hTERT com a ER, e esta foi especificamente para ERP em linhas de células pancreáticas humanas [26].

Uma variedade de estudos têm mostrado que a resposta de genes-alvo para estrogénio depende de vários factores importantes, incluindo a natureza do receptor de estrogénio, o ligando e de célula contexto, o promotor do gene alvo e factores de transcrição específicos, bem como agentes que afectam a activação da proteína cinase e a fosforilação da proteína [2] , [16], [27] – [29]. O promotor hTERT humano contém um elemento imperfeita resposta de estrogênio (ERE) e um meio período site ERE /SP1. Nós e outros descobriram que a expressão do gene hTERT induzida por estrogénio e a actividade da telomerase podem resultar da ligação directa de dois a ERa ERE sítios localizados na região promotora do gene hTERT [2], [15] – [17]. Além EREs, esta região possui sequências de consenso para a ligação de factores de transcrição, tais como Sp1, Ap2, AP4, c-Myc, NF-1 e E-box [8], [29] – [31]. Tem sido demonstrado que a activação de E2 do promotor hTERT núcleo pode ser completamente eliminado, quando os sítios de c-Myc está abolida pelas mutações [16]. E2 também foi encontrada para ativar de forma significativa o promotor de c-Myc em ensaios de luciferase usando c-Myc plasmídeos repórter promotor-[16]. Com base nesta evidência culminou, pode ser postulado que o estrogénio pode mediar a actividade de transcrição de hTERT através EREs directamente ligação ERa no promotor hTERT ou, em alternativa, por E2-activação dos factores de transcrição que interagem com este promotor, ou, mais provavelmente através de uma combinação de ambos mecanismos.

A cascata de sinalização MAPK regula uma variedade de actividades celulares, incluindo crescimento celular, diferenciação, sobrevivência e morte celular. Esta via é pensado para ser essencial na regulação da ERa transcrição, incluindo um novo mecanismo pelo qual ERa e ERK2 co-localize nos locais de ligação à cromatina e colaborar na regulação da estimulação hormonal da proliferação [32], [33]. sinalização do receptor de estrogénio e a activação da via de MAPK, também têm sido implicados no desenvolvimento e progressão de cancros hormonalmente-motoras, tais como cancro da mama e cancro do endométrio. A progesterona tem sido encontrado para inibir a activação induzida por estrogénio da actividade da telomerase na mama e linhas celulares de cancro do endométrio [34], e a via da MAPK foi demonstrado ser parcialmente responsável por este efeito antagonista. Tamoxifeno, uma terapia adjuvante comum para câncer de mama, tem propriedades similares ao estrogênio no tecido uterino e está associada a um risco aumentado de cancro do endométrio. O tratamento de células de cancro do endométrio com tamoxifeno foi mostrado para levar à indução da actividade de telomerase, que pode ser bloqueado por um inibidor de MEK. locais de ligação SP1 e ETS motivos membro da família têm sido encontrados no promotor hTERT flanqueante 5 ‘sequência de [30], [35] – [37], e estes representam factores de transcrição potenciais que são orientadas pela via da MAPK e podem ser induzidas através estrogénio e progesterona sinalização.