Sumário
FBP1, frutose-1,6-bisfosfatase-1, uma enzima reguladora da gluconeogénese, catalisa a hidrólise de frutose-1,6-bisfosfato a frutose-6-fosfato e fosfato inorgânico. O mecanismo que funciona para antagonizar a glicólise e foi inactivada através epigeneticamente NF-kappaB pathway no cancro gástrico foi avaliado. No entanto, o seu papel na carcinogênese fígado ainda permanece desconhecido. Aqui, foi investigada a expressão e de metilação do DNA de FBP1 em HCC primário e tumor do cólon. FBP1 foi modesto expressa em 80% (8/10) de carcinoma hepatocelular humano, 66,7% (09/06) linhas celulares de cancro do fígado e 100% linhas (6/6) de células de cancro do cólon, mas foi mais elevada em tecidos não tumorais adjacentes emparelhados e linhas de células imortalizadas normais, que estava bem correlacionado com o seu estado de metilação do promotor. A metilação foi ainda detectado em HCC primárias, tecidos de tumor gástrico e do cólon, mas nenhum ou, ocasionalmente, em tecidos não tumorais adjacentes emparelhados. análise de metilação detalhada dos 29 locais CpG em uma região promotora 327 pb por sequenciamento genômico bisulfite confirmou a sua metilação. FBP1 silenciamento pode ser invertida por tratamento químico desmetilação com 5-aza-2′-desoxicitidina (AZA), indicando silenciamento epigenético directa. Restaurando a expressão FBP1 em células expressas baixo crescimento celular e colônia capacidade formação significativamente inibido através da indução de G2-M parada do ciclo celular fase. Além disso, os efeitos observados coincidiu com um aumento de espécies de oxigénio reactivas (ROS) de geração. Em resumo, a inativação epigenética de FBP1 também é comum no fígado humano e câncer de cólon. FBP1 parece ser um supressor de tumor funcional envolvido na carcinogénese do fígado e do cólon
citação:. Chen M, Zhang J, Li N, Qian Z, Zhu H, Li Q, et ai. (2011) Promotor Hipermetilação Mediated regulação negativa do FBP1 em hepatocelular humano Carcinoma e cancro do cólon. PLoS ONE 6 (10): e25564. doi: 10.1371 /journal.pone.0025564
editor: Xin-yuan Guan, The University of Hong Kong, China
Recebido: 13 de junho de 2011; Aceito: 05 de setembro de 2011; Publicação: 19 de outubro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Ciência e Tecnologia Maior Projeto especial da China Eleventh Plano Quinquenal (No. 2008ZX1002-004), a Fundação de Pesquisa Grant chinesa Básico do Estado (2007CB512904), Xangai Sci e programa de Pesquisa tech (08JC1403900), eo programa de Melhor Medical líder acadêmico de Shanghai (08GWD19). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o carcinoma hepatocelular (HCC) continua a ser a terceira causa principal de morte por cancro em todo o mundo e a segunda malignidade mais comum na China. A patogênese molecular de HCC permanece em grande parte desconhecido. Foi levantada a hipótese de que o desenvolvimento e progressão da HCC são a consequência de eventos genéticos e epigenéticos cumulativos. CpG hipermetilação actua como um mecanismo alternativo para a inactivação do gene, e que é agora reconhecido como um mecanismo importante na iniciação e progressão do tumor, incluindo cancro do fígado [1], [2]. É importante e intrigante para identificar novos genes silenciados por hipermetilação do promotor em cancro do fígado porque gene supressor de tumor aberrante (TSG) hipermetilação é ao mesmo tempo um mecanismo e um biomarcador para a tumorigénese [3].
FBP1, frutose-1, 6-bisfosfatase 1, uma enzima reguladora da gluconeogénese, catalisa a hidrólise de frutose-1,6-bisfosfato a frutose-6-fosfato e fosfato inorgânico. deficiência de difosfatase de frutose-1,6- está associada com hipoglicemia e acidose metabólica. Foi relatado [4] que FBP1 que funciona para antagonizar a glicólise foi regulada negativamente através de NF-kappaB pathway em Ras transformadas células NIH3T3. funções de NF-kappaB a jusante de Ras para promover a regulação negativa de FBP1 epigenética. Inibição de NF-kappaB invertida promotor mediada por metilação FBP1 regulação negativa. Além disso, o promotor metilação do FBP1 era relevante para carcinogênese gástrica, por exemplo, sexo, estágios TNM e taxa de sobrevivência foram significativamente associados com FBP1 promotor metilação. Além disso, foi estudado [5] que a metilação do promotor FBP1 contribui para a diminuição da expressão de FBPase no cancro da mama. Quando as amostras de tecido não-malignas e malignas do mesmo paciente foram comparadas uma correlação entre o aumento da FBPase metilação do promotor e uma diminuição dos níveis de ARNm da FBPase foi observada. No entanto, não há resultados são mostrados para FBP1 inativação epigenética na carcinogênese hepática.
espécies reativas de oxigênio (ROS), moléculas quimicamente reativas contendo oxigênio, incluindo íons de oxigênio e peróxidos, são os principais mediadores do estresse oxidativo celular e desregulação redox envolvido na iniciação e progressão do câncer. é agora amplamente aceito que constitutivamente níveis elevados de estresse oxidativo celular e dependência de-apoptótica anti-ROS sinalização mitogênica e em células cancerosas estão envolvidas na carcinogénese. Paradoxalmente, para além de ser envolvido em proliferativo, anti-apoptótica, metastático, e sinalização angiogénico, ROS também podem exercer efeitos citotóxicos e funções pró-apoptóticos que iria limitar a tumorigenicidade e progressão maligna [6], [7]. FBP1 é uma proteína multifuncional que é, para além da sua função na gluconeogénese, envolvidos na produção de ROS após o tratamento com MMS ou em células com idade cronológica [8]. Na ausência de células sobrevivem ao tratamento FBP1 MMS melhor e mesmo proliferar após o tratamento a longo prazo. Isto poderia ser o resultado de uma redução da produção de ROS observada no mutante ΔFBP1 em resposta ao tratamento methylmethane sulfonato Agente de alquilação (MMS) e envelhecimento. Falta de FBP1 melhorou sobrevivência de células envelhecidas em meio completo e resultou em uma indução atrasada da produção de ROS. A sobre-expressão de FBP1 reduzida a capacidade de formar colónias, mesmo de culturas não tratadas, tempo de vida encurtada e aumentou a indução do promotor RNR2 após o tratamento MMS.
Aqui, demonstramos que foram submetidos FBP1 promotor silenciamento CpG associados a hipermetilação em humanos fígado e câncer de cólon. A análise das linhas de células de câncer de fígado e cólon e tecidos mostrou que FBP1 hipermetilação foi um evento comum no fígado humano e câncer de cólon. Também mostrou que FBP1 funciona como um TSG para suprimir o crescimento de células de cancro através da indução de G2-M paragem do ciclo celular de fase e um aumento nos níveis de produção de ROS. As mudanças epigenéticas na homeostase redox celular e níveis de ROS afetará a viabilidade através da modulação redox da abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial levando a liberação de citocromo C, apoptossomo montagem e ativação de caspases executoras, o que é favorável para quimioterápicos de câncer ROS-dirigidas.
Materiais e Métodos
linhas celulares de cancro, tecidos tumor primário e RNA DNA Extraction /Tablet
Nove linhas celulares de cancro de fígado humano (HepG2, Hep3B, Huh7, HCC-LM3, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-HEP1, MHCC-97H e MHCC-97L) foram utilizados para análise HCC. Um linhas de células de fígado humano normais imortalizadas L02 foi utilizado como controlo “normais” para a análise de HCC. Seis linhas celulares de cancro do cólon humano (HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo e RKO) foram utilizados para análise do cancro do cólon e tecidos adultos normais do cólon humano foram utilizadas como controlos “normais”. Todas as linhas celulares foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA., EUA). A menos que especificamente indicado, as células foram cultivadas em meio DMEM (Invitrogen, Carlsbad, Calif., EUA) suplementado com soro fetal bovino a 10%, a 37 ° C com 5% de CO
2 e 95% de humidade. Para desmetilação farmacológico, as células foram tratadas com 5 uM de 5-aza-2′-desoxicitidina (AZA) (Sigma, St. Louis, Missouri, EUA), durante 3 dias consecutivos. O meio de cultura foi mudado a cada 24 horas. Uma concentração equivalente de veículo (DMSO) foi usado como controle
HCCs primários foram obtidos a partir de pacientes com câncer de fígado em Huashan Hospital, no momento da cirurgia.; amostras tumorais não-emparelhados de doentes com cancro do fígado, também foram obtidos, pelo menos, 2 cm distantes do tumor. porções não-tumor foram cortadas a partir dos blocos congelados de tumor e as áreas tumorais seleccionadas células tumorais tinham mais de 80% tal como foi confirmado por histologia. gástrica humana, tecidos tumorais de cólon e tecidos do cólon adultos normais foram fornecidos pela chinesa Hospital Medicina de Zhejiang. Todos os pacientes deram consentimento informado para a obtenção das amostras de estudo.
O ARN total e o ADN genómico foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações totais de ADN e de ARN foram quantificados por NanoDrop 1000 (Nanodrop, Wilmington, Del., EUA).
em tempo real de RT-PCR
Uma reacção de transcrição reversa foi realizada utilizando 1 ug de um total de RNA com alta capacidade kit cDNA Transcrição reversa (Applied Biosystems, Foster City, Calif., EUA). Os níveis de expressão de mRNA FBP1 foram determinadas pelo Real-Time RT-PCR utilizando o kit SYBR Green Master Mix e ABI 7500 Real-Time RT-PCR System (Applied Biosystems, Foster City, Calif., EUA). Gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usada como um controlo interno da integridade do RNA. Em tempo real de RT-PCR foi realizada em triplicado. Os iniciadores utilizados para FBP1 foram:. FBP1-F 5′-ATCCCCTTGATGGATCTTCC-3 ‘e FBP1-R 5′-TCCAGCATGAAGCAGTTGAC-3’ (208 pb produto)
Bissulfito Tratamento de ADN e metilação-PCR específica
o ADN genómico foi tratado com bissulfito-Zymo DNA Modification Kit (Zymo Research, Orange, Califórnia., EUA) de acordo com o protocolo fornecido. metilação específicas de PCR (MSP) foi realizada durante 40 ciclos com uma temperatura de recozimento a 60 ° C. iniciadores específicos de metilação foram: FBP1 MF-5′-TGAAGATTTAAGTAGGCGGAGTC-3 ‘e 5′-MR FBP1-ATAAACACTAACCG CAAATACGAA-3′, e específicas unmethylation-iniciadores foram: FBP1-F 5’-GAAGATTTAAGTA GGTGGA GTTGTG-3 ‘e FBP1 -ur 5’-CTAACAAAAAAACTAACAAACCAAC-3 ‘
bissulfito Genomic Sequencing
DNA genômico tratados bissulfito foi amplificada utilizando sequenciamento genômico bisulfite iniciadores (BGS), FBP1-BF:. 5′-TGATTTTGGAGGAAATAGTTATAGTTTTT- 3 ‘e FBP1-BR: 5′-TAATACAACTAAACCAAACCAAAC-3’. Os produtos de PCR foram purificados com Illustra GFX ™ PCR e o kit de purificação em gel de banda (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Suécia) e clonado no vector pCR4-TOPO para sequenciação (Invitrogen). Pelo menos quatro colônias foram escolhidos aleatoriamente para a extração de plasmídeo e análise de sequenciação utilizando o ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit no seqüenciador ABI 3100 (Applied Biosystems).
Construção de FBP1 Expressando Vector
A FBP1 expressando vector foi construído por clonagem do FBP1 grelha de leitura aberta de comprimento completo em de mamífero pcDNA3.1 vector de expressão. A grelha de leitura aberta de comprimento completo FBP1 foi amplificado a partir de ADNc do estômago normais utilizando de alta fidelidade Pfu ADN polimerase (Invitrogen). Os iniciadores utilizados para a clonagem foram FBP1-CF: 5′-CGGAATTCCGATGGCTGACCAGGCGCCCTTCGA-3 ‘e FBP1-CR: 5′-GCAAGCTTCCTGGGCAGAGTGCTTCTCATACACC-3’ accomp- anied com os locais de corte duplo de enzima EcoRI e Hind III. A sequência e orientação da inserção foi confirmada por sequenciação de ADN.
Ensaio de formação de colónias
fígado células cancerosas humanas transientemente transfectadas com o vector pcDNA3.1 vazio ou pcDNA-FBP1 vetor de expressão foram utilizados para a ensaio de formação de colónia em monocamada para avaliar o crescimento celular in vitro. As células foram cultivadas durante a noite numa placa de 12 poços (5 x 10
5 células /poço) e transfectadas com vector pcDNA3.1 vazio ou pcDNA-FBP1 expressando vector utilizando FuGENE 6 (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha). Quarenta e oito horas mais tarde, os transfectantes foram novamente plaqueadas em triplicado e foram cultivadas durante 10~15 dias em meio contendo G418 DMEM completo (400 ug /ml). As colónias sobreviventes foram coradas com violeta genciana após a fixação metanol e colónias visíveis (≥ 50 células) foram contados. As experiências foram repetidas três vezes.
Crescimento celular Ensaio
de crescimento as células foram determinados por um ensaio de proliferação não radioactivo baseado na capacidade de células metabolicamente activas para converter 3- (4,5- dimetiltiazol-2-il) -5 (3-carboxymethonyphenol) -2 – (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS) (Promega, Madison, WI, EUA) em formazano. Células sobreviventes após selecção com G418 foram novamente plaqueadas numa placa de 96 poços com o número de células diferente e cultivadas em meio contendo G418 DMEM completo (400 ug /ml) durante mais 72 horas. A quantidade de formazano foi medida como a acima. A quantidade de formazan foi medida a 490 nm de absorvância após uma hora de incubação com CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagente seguindo as instruções fornecidas.
Análise do Ciclo Celular e Determinação da ROS Produção
células sobreviventes após a seleção G418 foram tripsinizadas, lavadas em solução salina tamponada com fosfato e fixadas em 70% de etanol-solução salina tamponada com fosfato arrefecido com gelo. Após a lavagem para fora etanol, as células fixadas foram tratadas com 0,01% de RNase (10 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, EUA) durante 10 min a 37 ° C e em seguida coradas com iodeto de propídio a 0,05% durante 20 min a 4 ° C no escuro. A distribuição do ciclo celular foi determinada utilizando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA, EUA) e analisadas com o software Modfit (Phoenix, San Diego, CA, EUA). As células que sofrem apoptose foram detectados como população sub-G1 por causa da perda de ADN fragmentado.
os níveis de ROS foram medidos usando 2′-7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA) (Invitrogen) em um ensaio de citometria de fluxo como descrito [9].
Análise Estatística
Os resultados foram expressos como média desvio ± padrão (SD). Student
t
teste foi utilizado para comparar as diferenças de expressão FBP1 sobre o efeito da formação de colónias e a proliferação celular. Todos os cálculos estatísticos foram feitos usando SPSS versão 11.0 para Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL). Valor de
P
. 0,05 foi tomado como significância estatística
Resultados
regulação negativa do FBP1 no fígado humano e de outros cancros digestivos
A expressão de FBP1 foi dramaticamente regulada negativamente em 66,7% (6/9) linhas celulares de cancro do fígado humano, incluindo HepG2, BEL-7402, SMMC-7721, SK-HEP1, MHCC-97H e MHCC-97L (Figura 1A), quando comparado com células normais do fígado humanos lo2. Da mesma forma, downregualtion de FBP1 também foi encontrada em 100% (6/6) linhas celulares de cancro do cólon humano HT29, incluindo, SW480, SW620, HCT116, LoVo e RKO (Figura 1A), quando comparado ao tecido adulto normal do cólon humano. A fim de saber se a regulação negativa da FBP1 deve ser atribuída a metilação do DNA, a expressão de FBP1 no fígado humano e linhas celulares de cancro do cólon antes e após o tratamento Aza foram determinadas pelo Real-Time RT-PCR. A expressão de FBP1 foi significativamente regulada positivamente em linhas celulares de cancro do fígado HepG2, BEL-7402, SMMC-7721, SK-HEP1, MHCC-97H e 97L MHCC-(09/06, 66,7%) após tratamento Aza (Figura 1B) e também em linhas celulares de cancro do cólon HT29, SW620, LoVo e RKO (06/04, 66,7%) (Figura 1B), o que indica que é provável FBP1 regulada negativamente por hipermetilação do promotor em cancro do fígado e do cólon humano.
(a) FBP1 expressão em linhas de células do fígado e do cancro do cólon humanas e os controlos normais foram determinados por real-Time RT-PCR. GAPDH foi utilizada para normalizar a quantidade molde. (B) a expressão FBP1 Relativa antes e depois do tratamento foram determinados por Aza em tempo real de RT-PCR. GAPDH foi utilizada para normalizar a quantidade molde. Foi mostrado como alterações médias dobra ± SD.
metilação do FBP1 Promotor no fígado humano e cólon
Na verdade, um típico ilhas CpG (CGI) foram encontrados em torno FBP1 exão 1 usando os critérios seguintes: teor de GC 55%, obs CpG /Exp CpG 0,65, e comprimento 500 pb (Figura 2A). O estado de metilação deste CGI nas células do fígado e cancerígenas do cólon humano foi determinada por MSP. Tal como mostrado na Figura 2B, a metilação do promotor FBP1 foi prontamente detectado em linhas celulares de cancro do fígado HepG2, HuH7, HCC-LM3, BEL-7402, SMMC-7721, SK-HEP1, MHCC-97H e MHCC-97L, e de cancro do cólon humano linhas de células HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo e RKO. Além disso, também revelou que BGS promotor FBP1 foi pesadamente metilado em células HepG2, Huh7, células BEL-7402 e T8 tecido tumoral, e não foi dedtected metilação em 8N tecido não-tumoral adjacente (Figura 2C).
(A ) estrutura esquemática do FBP1 CGI, com o exão 1 e região MSP e BGS indicado. Cada linha vertical curta representa um site de CpG. A posição dos iniciadores de MSP foram marcados como setas. O estado de metilação do FBP1 CGI foi analisada por MSP (B) e BGS (C). PCR específica de MSP-metilação =; USP = PCR específica para o Unmethylation. Para BGS em (C), cada círculo indica um sítio CpG e círculos preenchidos a preto representam metilados locais CpG. Uma fileira de círculos representa uma única colônia.
Downregulation e hipermetilação do promotor de FBP1 em tecidos tumorais humanas primárias
Para confirmar ainda mais a relevância da FBP1 promotor CGI hipermetilação na mediação de seu silenciamento em fígado humano, gástrico e cancro do cólon, a expressão FBP1 e metilação do promotor no carcinoma hepatocelular primário, tecidos de tumores gástricos e do cólon e tecidos não tumorais adjacentes foram analisados por real-Time RT-PCR e MSP, respectivamente. FBP1 expressão foi significativamente regulada negativamente em 80% (8/10) tecidos humanos tumorais de fígado, 100% (05/05) em gástrica e 80% (4/5) os tecidos de tumor do cólon (Figura 3A) quando comparado com tecidos não tumorais adjacentes . Além disso, a metilação do promotor foi frequentemente detectada usando MSP em amostras de tumor mas não em tecidos não tumorais (Figura 3B), indicando que a regulação negativa da FBP1 estava envolvido na carcinogénese do fígado humano e de outros cancros digestivos.
( A) A expressão de FBP1 em tecidos de fígado, gástricos e do cólon tumor e tecidos não tumorais adjacentes foram determinadas pelo tempo real de RT-PCR. 1~10 T /N: cancro do fígado, 11-15 T /N: câncer gástrico, 16~20 T /N: cancro do cólon. (B) O estado de metilação do promotor de FBP1 no primário do fígado, tecidos tumorais gástricas e cólon e tecidos não tumorais adjacentes foi detectada por MSP. Os resultados representativos foram mostrados. 1~3 T /N: cancro do fígado, 4~5 T /N: cancro do cólon, 6~9 T /N: câncer gástrico. “T” indica tecidos tumorais e “N” representa tecidos não tumorais adjacentes.
FBP1 superexpressão Redução câncer de células Colony Habilidades Formação e inibiu o crescimento de células hepáticas e do cancro do cólon
o efeito da expressão FBP1 exógena no crescimento de células de cancro do fígado humano foi investigada por um ensaio de formação de colónia em monocamada. Para investigar ainda mais o papel potencial de FBP1 em supressão tumoral, as células de cancro do fígado SMMC-7721 e do cancro do cólon SW480 foi transfectada com pcDNA-FBP1 vetor de expressão e a capacidade de formação de colónias de células foi examinada sob a selecção de G418. Em comparação com células de controlo transfectadas com o vector pcDNA3.1 vazio, células cancerosas transfectadas com pcDNA-FBP1 vector expressando mostrou diminuição da capacidade de formação de colónias (Figura 4B). Estes dados sugerem que FBP1 pode desempenhar um papel na supressão do tumor. Além disso, FBP1 níveis de expressão estável em células, incluindo aquelas SW480 e SMMC-7721 também foi confirmada por Real-Time RT-PCR como se mostra na Figura 4A.
(A) Nível de expressão na FBP1 SW480 transfectadas e SMMC- 7721 células foi confirmada por em tempo real de RT-PCR. (B) O efeito da expressão ectópica FBP1 sobre o crescimento de células de cancro do fígado foi investigado por ensaio de formação de colónia em monocamada. A formação de colónias digitalizados em placas de seis poços foi mostrado no painel .. (C) O crescimento das linhas de células de fígado e câncer de cólon (SW480 e SMMC-7721) com e sem expressão FBP1 foi determinada com ensaio de crescimento celular MTS. A expressão estável de FBP1 suprimiu o crescimento de células do fígado e do cólon. Os resultados foram apresentados como valores de SD ± média. Os valores de P foram calculados utilizando o teste t de Student (* p 0,05).
Quando pcDNA-FBP1 foi transfectado em células SW480 e SMMC-7721, a função de inibidor do crescimento de FBP1 nestas células foi confirmada por ensaio de crescimento celular MTS. PcDNA-FBP1 expressando vector foi transfectado para as células, a velocidade de crescimento das células do fígado e do cólon humano após FBP1 sobreexpressão foi drasticamente reduzida no ensaio de crescimento celular MTT (p 0,05; Figura 4C), mostrando um efeito de crescimento-supressora de FBP1 sobre células cancerosas.
a expressão ectópica de FBP1 Induced G2-M Fase Arrest
Para determinar o mecanismo molecular pelo qual FBP1 suprimida a formação de colónias e proliferação celular, nós investigamos o efeito de FBP1 sobre a distribuição do ciclo celular . Depois de iodeto de coloração de propídio, a análise de separação de células activada por fluorescência de FBP1 overexpressed SW480 e células SMMC-7721 revelou um aumento no número de células em fase G2-M e uma diminuição no número de células em fase S (Figura 5A e 5B).
A distribuição do ciclo celular da linha de células de fígado e câncer de cólon (SW480 e SMMC-7721) com e sem expressão FBP1 foi avaliada por citometria de fluxo análise. (A) e (B) de fluorescência Representante -activated separação de células análise das células cancerosas transfectadas com ou sem FBP1.
FBP1 superexpressão Aumento intracelular ROS Produção
Os níveis de ROS foram medidos em células cancerosas não transfectadas e transfectadas com pcDNA-FBP1 expressando vector. expressão FBP1 claramente aumento intracelulares níveis exógenos ROS em SMMC-7721 e as células SW480 (Figura 6A e 6B). Portanto, FBP1 poderia aumentar a produção de ROS, que exercem funções citotóxicos e pró-apoptóticos e limitar a tumorigenicidade e progressão maligna.
O efeito da expressão ectópica FBP1 sobre o stress oxidativo foi determinada por citometria de fluxo de ensaio tal como mostrado em (A) e (B ). células estáveis foram coradas com DCFH-DA e, em seguida, o estado redox de células foi medida por citometria de fluxo.
Discussão
genes supressores tumorais mais e mais novos foram encontrados para ser inactivada por hipermetilação do promotor. metilação do promotor foi, assim, proposto como um importante marcador para a identificação de novos genes supressores de tumor. No presente estudo, identificamos que FBP1 foi frequentemente regulada para baixo em linhas celulares HCC 66,7% e linhas celulares de cancro de cólon 100% (Figura 1A), e em 80% primária HCC, tumores gástricos% 100 e 80 tumores% do cólon (Figura 3A). A hipermetilação foi ainda detectado em 66,7% linhas celulares de carcinoma hepatocelular e linhas celulares de cancro do cólon 100% (Figura 2B), e também em tecidos tumorais primários (Figura 3B). Em contraste, FBP1 hipermetilação foi dificilmente detectada em linhas de células de fígado normais e, ocasionalmente, em tecidos não tumorais adjacentes emparelhados, sugerindo um papel importante de FBP1 na patogénese de fígado e de outros cancros digestivos. Demonstramos ainda que o tratamento com o reagente de desmetilação Aza upregulated FBP1 expressão em células de cancro modesto expressos (Figura 1B) e o estado de metilação foi verificada por sequenciação genómica, indicando que a hipermetilação do ADN mediada FBP1 inactivação.
No cancro, o dinâmica de silenciamento de genes genéticas e epigenéticas são muito diferentes. mutação genética somática leva a um bloqueio na produção de proteína funcional do alelo mutante. Se uma vantagem selectiva é conferido para a célula, as células expandir clonalmente para dar origem a um tumor em que todas as células não possuem a capacidade para produzir a proteína. Em contraste, epigeneticamente mediada silenciamento de genes ocorre de forma gradual. Ela começa com uma diminuição sutil na transcrição, promovendo uma diminuição na protecção da ilha CpG a partir da disseminação de flanqueamento heterocromatina e metilação na ilha. Esta perda resulta em aumentos graduais de locais CpG individuais, que variam entre cópias do mesmo gene em células diferentes. Por exemplo, um nível mais elevado de FBP1 foi detectada em células Huh7 e HCC-LM3 com elevado nível de metilação da região promotora (Figura 1A e 2B). Apesar de metilação do promotor frequentemente inactivado FBP1 em linhas de células de fígado e câncer de cólon humanos, não podemos excluir o envolvimento de outros mecanismos responsáveis pela regulação baixa FBP1, tais como defeitos de remodelação histona. Por exemplo, em Hep3B, Huh7, HCC-LM3, SW480 e células HCT116, promotor FBP1 não conseguiram ser totalmente regulada positivamente após tratamento Aza (Figura 1B).
Além disso, para servir como um novo marcador para definir novos genes supressores tumorais, a hipermetilação do promotor também pode ser utilizado como um marcador sensível para o diagnóstico do cancro e predição prognóstico [10], [11]. Infelizmente, por falta de um grande número de tecidos tumorais, não poderíamos testar FBP1 metilação em tecidos abundantes e analisar ainda mais a sua associação com características clínicas, tais como idade, sexo, grau do tumor e taxa de sobrevivência. Tivemos que determinar a expressão FBP1 e estado de metilação em apenas 10 pares de HCCs primária, 5 pares de tecidos tumorais gástricas e 5 pares de tecidos tumorais de cólon (Figura 3), o que sugere que as funções FBP1 como candidato supressor de tumor romance reprimidos através hipermetilação promotor fígado e câncer de cólon. Este é também o primeiro relatório para mostrar que FBP1 é epigenetically silenciada no fígado humano e carcinogênese do cólon. Uma vez FBP1 metilação do promotor foi detectado com uma frequência elevada em tecidos de carcinoma primário, mas não tecidos gástricos normais não tumorais, FBP1 metilação do promotor pode ser um biomarcador potencial para o diagnóstico do cancro.
Como é mostrado na Figura 4, a restauração de expressão FBP1 marcadamente suprimiu o crescimento de células cancerosas. No entanto, o mecanismo molecular subjacente responsável por FBP1 funciona como um supressor de tumores permanece desconhecido. Verificou-se [4] que funciona FBP1 para antagonizar a glicólise. Como é bem conhecido, as células cancerígenas têm uma maior taxa de glicólise aeróbica, mas não fosforilação oxidativa. A frutose-1,6-bisfosfato é um dos intermediários mais importantes na glicólise e o seu nível é controlado principalmente pela cinase de frutose-6-fosfato de frutose e bisfosfatase-1,6-. Verificou-se que a produção de lactato depois de expressão FBP1 foi significativamente reduzida, o que demonstra a supressão da glicólise aeróbica por FBP1. Além disso, os pontos de verificação do ciclo celular são importantes mecanismos de controle que garantam a boa execução de eventos do ciclo celular. A supressão do crescimento induzida pela expressão ectópica FBP1 parece ser causada pela paragem do ciclo celular uma vez que os números de células com o bloqueio do ciclo celular (G2-M prisão fase) foram aumentadas após FBP1 re-expressão (Figura 5).
durante muito tempo, ROS foram considerados oncogénica, uma vez que foi implicado na progressão e metástase do cancro. estresse oxidativo persistente tem sido associado com o carcinoma da mama e muitos cancros epiteliais, tais como cancro do cólon e cancros cervicais [12]. No entanto, numerosos estudos demonstraram o envolvimento causador da formação de ROS na mediação da apoptose de células de cancro induzido por vários agentes quimioterapêuticos padrão, incluindo o paclitaxel, cisplatina, etoposido e bortezomib. Notavelmente, tem sido demonstrado que a cisplatina apoptogenicity depende da formação de ROS e ocorre independente de danos no DNA nuclear, o que sugere que o stress oxidativo apoptogénica é o mecanismo crucial de morte celular induzida por cisplatina cancro [13]. Além de provocar a paragem do ciclo celular na fase S, importante no presente estudo, o efeito inibidor do crescimento de FBP1 como um supressor tumoral também pode ser mediada através do aumento da produção de ROS intracelular (Figura 6). Os nossos resultados foram consistentes com os dados anteriormente publicados [8] que mostra a frutose-1,6-bisfosfatase medeia as respostas celulares a danos no ADN e o envelhecimento em Saccharomyces cerevisiae. Mas como ROS exercem citotóxica e funções pró-apoptóticos que limitariam tumorigenicidade e progressão maligna, foi proposto que alterações na homeostase redox celular e níveis de ROS afetará a viabilidade através da modulação redox da abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial levando a liberação de citocromo C, apoptossomo montagem, e ativação de caspases executoras, se os níveis de ROS celulares atingem um certo limiar incompatíveis com a sobrevivência celular [7], [14].
em resumo, descobrimos que FBP1 é frequentemente reduzido por hipermetilação do promotor na maior parte do fígado e cólon linhas celulares de cancro e tecidos tumor primário. Nossos resultados sugerem que a inativação epigenética de FBP1 foi um fator importante no fígado humano e carcinogênese do cólon. Também demonstramos que o silenciamento hipermetilação do promotor-mediada de FBP1 podia ser revertida por desmetilação farmacológica e restauração de FBP1 suprimiu o crescimento de células tumorais através de indução de G2-M paragem do ciclo celular de fase e um aumento na produção de ROS. Portanto, será útil para explorar a possível aplicação de FBP1 como marcador molecular para a detecção e tratamento destas doenças malignas.
Reconhecimentos
Agradecemos ao Sr. Wang Cheng para discussão útil e técnica assistência. Agradecemos também o Sr. Jiang Jiukun para fornecer linhas de células HCC MHCC-97H e MHCC-97L e Dr. Chen Qian para fornecer tecidos gástricos e cancerígenas do cólon humano.