Abstract

O câncer de pâncreas (PC) continua sendo um dos males humanos mais letais com mau prognóstico . Apesar de todos os avanços na pesquisa pré-clínica, não houve tradução significativa de novas terapias para as clínicas. O desenvolvimento de camundongo geneticamente modificado (GEM) modelos que produzem adenocarcinoma do pâncreas espontânea (PDAC) têm aumentado o nosso entendimento da patogênese da doença. Embora estes modelos PDAC rato são ideais para estudar terapias potenciais e mutações genéticas específicas, existe uma necessidade para o desenvolvimento de linhas de células singeneicas de estes modelos. Neste estudo, descrevemos o estabelecimento bem sucedido e caracterização de três linhas de células derivadas de dois (PDAC) modelos de ratinho. A linha de células UN-KC-6141 foi derivada de um tumor pancreático de um Kras

G12D; Pdx1-Cre (KC) do mouse em 50 semanas de idade, ao passo que UN-KPC-960 e UN-KPC-961 linhas celulares foram derivada de tumores pancreáticos de Kras

G12D; Trp53

R172H; ratos com 17 semanas de idade Pdx1-Cre (KPC). As mutações de câncer desses ratos mãe transitadas para as linhas de células-filhas (ou seja,

Kras

G12D

mutação foi observada em todas as três linhas celulares durante a

Trp53

mutação foi observada apenas na célula KPC linhas). As linhas de células apresentaram morfologia epitelial típica paralelepípedos em cultura, e ao contrário da linha de células de rato PDAC previamente estabelecido Panc02, expressa o marcador ductal CK19. Além disso, estas linhas celulares expressavam os marcadores epiteliais mesenquimais-E-caderina e N-caderina, e também mucinas, MUC1 e MUC4. Além disso, estas linhas de células eram resistentes ao fármaco quimioterapêutico gemcitabina. Sua implantação

in vivo

produzida subcutânea, assim como tumores no pâncreas (ortotópico). As mutações genéticas nestas linhas celulares imitar o compêndio genética de PDAC humano, o que lhes fazer modelos valiosos com um elevado potencial de relevância translacional pela análise de marcadores de diagnóstico e drogas terapêuticas

Citation:. Torres MP, Rachagani S, Souchek JJ, Mallya K, Johansson SL, Batra SK (2013) linhas de células do cancro do pâncreas Novel Derivado de engenharia genética mouse modelos de Spontaneous pâncreas Adenocarcinoma: Aplicações em diagnóstico e terapia. PLoS ONE 8 (11): e80580. doi: 10.1371 /journal.pone.0080580

editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América

Recebido: 20 Agosto, 2013; Aceito: 14 de outubro de 2013; Publicação: 20 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Torres et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi, em parte, suportado por concessões do NIH (tmen U54 CA163120, EDRN UO1, CA111294, CA127297 SPORE P50, SR1 CA133774, SR1 CA78590 e RO3 CA167342). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar de muitos avanços na compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na patogênese do câncer de pâncreas (PC) ao longo das últimas quatro décadas, a doença continua a ser uma das principais doenças malignas com pior prognóstico [1]. Estas estatísticas sombrias são um lembrete constante da necessidade urgente para elucidar mecanismos ainda não descobertas de PC patologia que contribuirão para um melhor diagnóstico e tratamento regimes. Para este efeito, o desenvolvimento de modelos pré-clínicos é de importância vital, porque eles são críticos para avaliar novas estratégias terapêuticas [2]. tumores de xenoenxerto em ratinhos nus atímicos são modelos pré-clínicos úteis, mas eles não podem fornecer o papel dos mecanismos imunes que pode aumentar ou interferir com a acção dos candidatos terapêuticos. Mais recentemente ratinhos, geneticamente manipuladas (GEM) modelos que produzem adenocarcinomas pancreáticos espontâneas (PDAC) ter avançado significativamente a nossa compreensão da patogénese de PC e também, permitiu o exame de novas abordagens terapêuticas [3] – [6]. Além disso, linhas de células singeneicas podem ser isoladas a partir de tumores pancreáticos produzidos por modelos GEM e utilizado para

In vitro

e

In vivo

ensaios de rastreio. A análise de funções e características de mutações genéticas específicas e biomarcadores PC presentes nestas linhas celulares pode lançar luz sobre a concepção de estratégias diagnósticas e terapêuticas promissoras.

As mutações no

KRAS

,

CDKN2A

,

TP53

, e

SMAD4 /DPC4

genes são comumente observados em tumores de pacientes PDAC de PC [7]. Tendo em conta estes resultados, vários modelos de rato que produzem PDAC espontânea, foram projectadas na última década [3], [4], [6]. O presente estudo centra-se em ratinhos que transportam

Kras Comprar e

Trp53

mutações. O papel da oncogênico

Ras

no PC foi examinado por dirigir a expressão endógena de

Kras

G12D

nas células progenitoras do pâncreas em Kras

G12D; Pdx1-Cre (KC ) ratos [3], Considerando que o papel da expressão endógena de

Trp53

R172H

e

Kras

G12D

foi examinado no pâncreas de Kras

G12D; Trp53

R172H; Pdx1-Cre (KPC) ratos [4]. Os resultados indicam que os tumores pancreáticos espontâneas produzidas por estes modelos de rato recapitular os aspectos clínicos, histopatológicos e genômicos de PDAC humano.

linhas de células do rato PDAC com maior relevância clínica para PC são altamente necessárias. A linha de células Panc02 atualmente disponível tem sido usado ao longo das últimas três décadas [8]. Foi derivada a partir de tumores induzidos por implantação de PDAC 3-metil-colantreno (3-MCA) saturados fios de algodão no pâncreas de ratinhos C57BL /6. Apesar do seu uso generalizado na avaliação de várias estratégias terapêuticas, as células não têm fortes Panc02 significado clínico para PC devido à ausência de espectro mutacional quando comparado com a doença humana. Por conseguinte, o sucesso na tradução de terapias indicadas por este modelo tem sido limitada. Neste artigo, nós descrevemos a geração e caracterização de três novas linhas de células PDAC derivados de modelos do rato espontâneas de PC. Uma linha de células foi derivado de um rato KC a 50 semanas de idade, e duas outras foram derivadas de ratinhos KPC com 17 semanas de idade. O sucesso do estabelecimento e

in vitro Comprar e

In vivo

caracterização destas linhas de células são exaustivamente descritos, incluindo marcadores atualmente conhecidos para tumores pancreáticos.

Materiais e Métodos

estabelecimento de linhas celulares

O meio completo consistiu de DMEM contendo FBS inactivado pelo calor, L-glutamina (200 mM), 100x aminoácidos não essenciais (100 mM), bicarbonato de sódio, tampão HEPES, gentamicina (50 mg /ml), e penicilina /estreptomicina (100 ug /ml). Imediatamente após a ressecção do tumor, 200 mg de tecido de tumor pancreático foi transferida para uma placa de Petri contendo PBS estéril e gentamicina (20 ug /ml).

Os tecidos recolhidos foram lavados 3 vezes com PBS-gentamicina e transferida para uma placa de Petri contendo o meio completo. O tumor foi finamente picada com um bisturi estéril e transferido para um tubo de centrífuga estéril com o meio completo contendo colagenase .A mistura foi incubada a 37 ° C durante 30 min P (Roche, Indianapolis, IN) (10 mg /ml). Os tubos foram invertidos a cada três minutos para assegurar uma mistura adequada. Após dois ciclos de lavagem em meio completo, o pellet obtido após centrifugação foi suspensa em meio completo. Depois de deixar o tubo de repousar durante 2 min, a suspensão de células, sem os restos de tecido foi transferido para uma nova estéril prato de 10 centímetros de Petri.

Após incubação durante a noite a 37 ° C em 5% de CO

2, o meio foi substituído com meio fresco. As células foram tripsinizadas uma vez confluentes. Para prevenir o crescimento de fibroblastos, tripsinização diferencial foi realizada, onde a tripsina foi adicionado às células e, após 10 segundos, as células foram lavadas com PBS e foi adicionado meio fresco. Além disso, o meio foi suplementado com toxina da cólera (400 ng /ml) durante os primeiros 7 passagens, uma vez que tem sido previamente reportado que este tenha um efeito mitogénico em células epiteliais melhorada, mas não em células de fibroblastos [9]. Após 10 passagens, as linhas de células foram transferidas para meio completo normal (meio ou seja DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 ug /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina) e mantida a 37 ° C e 5% de CO

2 em numa incubadora humidificada. Três linhas celulares foram estabelecidas com êxito. A linha de células derivadas de uma Kras

G12D; Pdx1-Cre (KC) do rato foi nomeado-KC-6141 da ONU e as duas linhas celulares derivadas de Kras

G12D; Trp53

R172H; Pdx1-Cre (KPC ) ratos foram nomeados UN-KPC-960 e UN-KPC-961 (ONU designa University of Nebraska Medical Center).

In vitro

caracterização e estudos tumorigênicos foram feitas após 35 passagens em cultura de células. A linha de células PDAC murino Panc02 foi incluído no

in vitro

ensaios funcionais.

O sequenciamento de linhas celulares para

Kras

e

p53

Mutações

As culturas sub-confluentes de UN-KC-6141, UN-KPC-960, e UN-KPC-961 foram lisadas com solução de lise celular contendo beta-mercaptoetanol e RNA total foi isolado com RNeasy Minikit (Qiagen, Germantown , MD). O ADNc foi sintetizado a partir do ARN total utilizando oligo (dT) 18 e iniciador de transcriptase reversa Superscript II (Life Technologies ™, Carlsbad, CA). amplificação por PCR de murino

Kras

códon 12 (exão 1) e

p53

códons 172 (Exon 5) foi realizada usando conjunto de primers para cada gene (

Kras

-seqF: 5′-ACTTGTGGTGGTTGGAGCTG-3 ‘,

Kras

-seqR: 5′-TGACCTGCTGTGTCGAGAAT-3′,

p53

-seqF: 5′-CACGTACTCTCCTCCCCTCA-3 ‘e

p53

-seqR: 5′-ATTTCCTTCCACCCGGATAA-3 ‘), o que resulta em uma pb 168 (

Kras

) e 229 pb (

p53

) produtos de PCR. Os produtos de PCR foram purificados com o kit de purificação de PCR produto (Qiagen, Germantown, MD) e os produtos de PCR purificados foram sequenciados utilizando

Kras

-seqR: 5′-TGACCTGCTGTGTCGAGAAT-3 ‘para

Kras

e

p53

-seqF: 5′-CACGTACTCTCCTCCCCTCA-3 ‘para

p53

gene

Crescimento Kinetics

para os estudos de cinética de crescimento, cada linha de células. semeou-se em quadruplicado em placa de 96 poços (1.000 células /poço) em meio completo. Após incubação durante a noite, o meio foi substituído por meio suplementado com FBS a 1% e penicilina /estreptomicina (100 ug /ml). Todos os dias, 10 ul da Proliferação de Células do reagente WST-1 (Roche, Indianapolis, IN) foi adicionado a cada poço e após 3 h de incubação, os valores de absorvância foram medidas a 450 nm. Os valores de absorvância foram subtraídos dos valores atingidos no comprimento de onda de referência (600 nm), tal como indicado pelo fabricante. O procedimento foi repetido durante 7 dias. Calculou-se o tempo de duplicação (T

D) para cada linha celular durante a fase de crescimento exponencial utilizando a fórmula T

D = 0.693t /LN (N

T /N

0), em que t = diferença de tempo na h, N

t = valor de absorção no tempo t, e N

0 = valor de absorção no momento inicial [10].

PCR em tempo real

RNA foi isolado e purificado a partir de UN-KC-6141, UN-KPC-960, UN-KPC-961, Panc02, e NIH3T3 (fibroblastos de rato) células usando o RNeasy Minikit (Qiagen, Germantown, MD). O ADNc foi sintetizado a partir do ARN total utilizando oligo (dT) 18 e iniciador de transcriptase reversa Superscript II (Life Technologies ™, Carlsbad, CA) como descrito por nós em uma publicação anterior [11]. PCR em tempo real foi realizada em 480 LightCycler (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). A amplificação foi efectuada num processo de dois passos (95 ° C durante 5 min seguido por 45 ciclos de 95 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 10 seg, e 72 ° C durante 10 seg) utilizando o LightCycler 480 SYBR Green I master Mix (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) e ADNc a partir de cada amostra.

GAPDH foi usada como o gene de controlo interno para o qual foram normalizados todos os genes. A dobra-mudança na expressão gênica de

amilase

e

CK19

mRNA em linhas celulares de cancro foram comparados em relação aos níveis de mRNA extraído de pâncreas de rato normal usando

-ΔΔCt o método 2, ao passo que a dobra-mudança de

Muc1

e

MUC4

foram comparados em relação ao mRNA extraído a partir da linha de células de fibroblastos de rato NIH3T3. A sequência dos iniciadores utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1.

Anticorpos

O-CK19 anti hibridoma (TROMA-III) desenvolvido pelo Dr. Rolf Kemler foi obtido a partir de Estudos do desenvolvimento hibridoma Banco desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido na Universidade de Iowa (Iowa City, IA). O anticorpo contra a E-caderina de murino foi obtido a partir de Cell Signaling (Danvers, MA). anticorpo N-caderina foi uma simpática oferta do Dr. Keith R. Johnson, da UNMC (Omaha, NE). β-actina e anticorpos amilase foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Para os estudos de confocal os anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor® (568, 488) foram obtidos de Life Technologies ™ (Carlsbad, CA). Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano utilizado para análise de Western blot foram obtidos a partir da GE Healthcare Life Sciences (Uppsala, Suécia). O anticorpo anti-ratinho de Muc1 (anticorpo monoclonal de ratinho que reconhece a cauda citoplasmática da proteína MUC1) foi adquirido a partir de Abcam® (Cambridge, MA, EUA). O anti-MUC4 (policlonal de coelho-4A) de anticorpos foi concebida neste laboratório e desenvolvidos por GenScript (Piscataway, NJ, EUA), como tem sido descrito anteriormente [12].

Microscopia Confocal

A expressão da proteína foi analisada por microscopia confocal. 2 × 10

5 células suspensas em meio completo foram semeadas em lamelas de vidro colocado em uma placa de 12 poços. No dia seguinte, as células foram fixadas em metanol arrefecido em gelo. Após lavagem em PBST e o bloqueio com 10% de soro de cabra (Jackson Immunoresearch Labs, West Grove, PA), as células foram incubadas com anticorpos para a amilase (1: 500), CK19 (1: 1000), da E-caderina (1:50 ), N-caderina (01:20), e Muc1 (1: 100) durante a noite. Eles foram lavadas quatro vezes com PBST, 5 minutos por lavagem. As células foram incubadas com os respectivos anticorpos secundários (murganho /coelho) conjugado com Alexa Fluor (568, 488) (Life Technologies ™, Carlsbad, CA) e depois repetir os passos de lavagem, as lamelas de vidro foram montadas em lâminas de vidro com montagem Vectashield médio (Vector Laboratories, Burlingame, CA). As células foram fotografadas num microscópio confocal de laser LSM 510 (Carl Zeiss GmbH, Thornwood, NY) nos respectivos comprimentos de onda com uma ampliação de × 63.

Análise Western Blot

Para a análise Western Blot , as células foram semeadas em cada poço de uma placa de 6 poços em meio completo. No -80% de confluência, as células foram lisadas com tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) contendo protease e inibidores de fosfatase. Os lisados ​​foram submetidos a vários ciclos de congelamento-descongelamento para assegurar uma lise completa. A concentração dos lisados ​​foi determinada com o kit de estimativa de proteína de ácido bicinconinico micro-(Bio-Rad, Hercules, CA). As concentrações de proteínas foram ajustadas e as soluções foram preparadas em condições de redução (isto é, β-mercaptoetanol). 2% de gel de SDS-agarose foram utilizados para análise de expressão MUC4. 40 ug de proteína de lisados ​​foram carregados e o gel foi corrido, durante 4 h a 100 V. E-caderina e N-caderina níveis de expressão foram analisados ​​por SDS-PAGE. 40 ug de proteína de lisados ​​foram carregadas e a separação foi realizada a 80 mA durante 1 h. proteínas resolvidas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno, bloqueadas em leite 5% em PBS, e incubadas com os anticorpos primários durante a noite. Após lavagem com PBST, adicionaram-se os anticorpos secundários correspondentes e depois de repetir os passos de lavagem, as proteínas foram detectadas por luminol (Thermo Scientific, Middletown, VA) após a exposição a películas de raios-X.

citotóxica Ensaio

o efeito citotóxico do fármaco quimioterapêutico gemcitabina em linhas celulares de KC e KPC foi comparado com o efeito citotóxico sobre Panc02. A solução injectável de gemcitabina, GEMZAR® (Eli Lilly Company, Indianapolis, IN) foi gentilmente cedido pela farmácia no Centro de Transplante de Lied na UNMC. Para o ensaio citotóxico, 1 × 10

4 células suspensas em meio completo foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços. No dia seguinte, as células foram tratadas com diferentes concentrações de solução de gemcitabina (100 nM-100 uM) em poços em quadruplicado. Após incubação das células com gemcitabina durante 48 h, tiazolilo meios contendo reagente de brometo de tetrazólio azul (Sigma Aldrich, St Louis, MO) foi adicionada às células. Após 4 h de incubação, os cristais de forma zan produzidos por células metabolicamente activas foram dissolvidos com 100 ul de DMSO. Os valores de absorbância a 540 nm foram utilizados para calcular as percentagens de citotoxicidade. A concentração máxima inibitória metade (IC-50) de gemcitabina foi determinada em cada linha de células de interpolação valores no gráfico (% citotoxicidade vs. gemcitabina Concentração).

estudos de tumorigenicidade

A tumorigenicidade de as linhas de células foi determinada após o implante ortotópico das linhas de rato PC celulares (UN-KC-6141 /UN-KPC-960 /UN-KPC-961) na cabeça do pâncreas após 35 passagens. Com base no fundo ratinhos a partir de onde as linhas celulares foram geradas, as células da ONU-KC-6141 (1 × 10

6) foram injectadas em ratinhos C57BL /6, ao passo que o UN-KPC-960 e células da ONU-KPC-961 ( 1 × 10

6) foram injectados no fundo misto (isto é, B6.129) ratos (N = 7). células de rato PC suspensos em 50 ul de PBS estéril foram injectados ortotopicamente usando o mesmo processo descrito por nós [13], [14]. o crescimento do tumor subcutâneo foi avaliada apenas com a linha de células UN-KPC-961. 5 × 10

6 células foram injetadas (N = 12) em mistos B6.129 ratos fundo no peito lateral. O crescimento do tumor foi monitorizada por palpação /medições de calibre Vernier no caso de tumores subcutâneos. Durante toda a experiência, os animais foram abastecidos com alimento e água ad libitum e submetido a uma 12-h escuro /ciclo de luz. Os estudos em animais foram realizados de acordo com o Serviço de Saúde Pública EUA “Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório” ao abrigo de um protocolo aprovado pela Universidade de Nebraska Medical Center Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). Após a eutanásia, os tumores pancreáticos foram dissecados, pesados ​​e fixados em formalina a 10% (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) para a H E de coloração. lesões metastáticas brutas foram examinados em órgãos distantes e processadas para análise histológica

hematoxilina e eosina (H E).

Depois de consertar tecidos em formalina a 10% por pelo menos 48 h, os tecidos foram embebidos em parafina e cortes de tecido em série (4 mm de espessura) foram cortadas. Os cortes foram desparafinados usando EZ-DeWaxTM (Bio Genex, San Roman CA, EUA) e reidratadas progressivamente. Em seguida, os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (H E). Manchas e examinado por um patologista certificado

Estatísticas

As diferenças significativas nos valores experimentais foram determinados calculando valores p usando o JMP® Statistical Discovery Software (Cary, NC). um teste t de Student foi utilizado para calcular o correspondente

p-valor

(

p-valores Art 0,05 foram considerados estatisticamente significativos).

Resultados

In vitro

estabelecimento de linhas celulares KC e KPC

linhas celulares mouros foram gerados com sucesso a partir dos tumores pancreáticos espontâneas produzidas pelo G12D Kras

; Pdx1-Cre (KC) eo Kras

G12D; Trp53

R172H; Pdx1-Cre (KPC) ratinhos com 50 semanas e 17 semanas de idade, respectivamente. Uma linha de células derivadas de camundongos KC foi nomeado UN-KC-6141, e duas outras linhas celulares derivadas de camundongos KPC foram nomeados UN-KPC-960 e UN-KPC-961. Todas as três linhas de células cresceram durante mais de 50 passagens em meio normal, sem qualquer sinal da senescência. culturas em monocamada de todas as três linhas de células apresentaram morfologia de paralelepípedos típico com fechado formação de ilhas de contato (Fig 1A). Para verificar se estas linhas celulares manteve as mutações genéticas de seus respectivos ratos parental (KC e KPC), o estado mutacional do

Kras

(Fig. 1B) e

Trp53

(Fig 1C. ) loci foi examinada. Como esperado, todas as três linhas celulares carregava o

Kras

G12D

ponto de mutação, enquanto UN-KPC-960 e UN-KPC-961 tinham a mutação

Trp53

R172H

ativar .

(A) imagens de microscópio invertido (4X) da UN-KC-6141, UN-KPC-960, e UN-KPC-961 linhas celulares PDAC após 35 passagens. As três linhas de células exibido morfologia epitelial paralelepípedos típico. análise da sequência genética de (B)

Kras

G12D Comprar e (C)

Trp53

R172H

mutação em linhas de células de rato PC. áreas sombreadas azuis representam o codão onde a mutação está localizada. Um retângulo amarelo indicam o nucleotídeo responsável pela mutação. Um pâncreas de um rato Pdx1-Cre (tag rato UN-KPC-1207) foi utilizado como controle negativo para o

Kras

mutação.

A cinética de crescimento destes PC três rato As linhas celulares foram comparadas com células Panc02 (Fig 2A). células UN-KPC-961 proliferaram o mais rápido com um tempo de duplicação (T

D) de 33 h (

p Art 0,0001 em comparação com Panc02). UN-KPC-960 e Panc02 cresceu a taxas semelhantes (T

D ≈ 60 h), enquanto a UN-KC-6141 mostrou a taxa de crescimento mais lenta (T

D de 70 h) (Fig 2B).

(a) células foram semeadas em poços em quadruplicado de placas de 96 poços e o seu crescimento foi seguido a cada dia, medindo a absorvância após a incubação com o reagente WST-1. Os dados são representados como a média de absorvância (λ

Amostra = 450 nm, λ

ref = 600 nm) das quatro repetições ± erro padrão. As estatísticas foram calculadas em comparação com a curva de crescimento para Panc02 (*

p Art 0,01, **

p Art 0,001, ***

p Art 0,0001 ). (B) o tempo de duplicação (T

D) da população celular foi calculada usando a equação T

D = (0.693t) /ln (N

t /N

0), onde t = diferença de horário no h durante a fase log, N

t = valor de absorção no tempo t, e N

0 = valor de absorção no tempo inicial.

KC e linhas celulares KPC derivados têm ductal- como características

PDACs são pensados ​​para surgir a partir de células epiteliais do ducto pancreático [7]. O pâncreas exócrino contém ambos células ductais e acinar. células acinares pancreáticas são caracterizadas por expressão da amilase e da falta de expressão, quer de citoqueratina 19 (CK19) ou mucinas, e as células ductais são caracterizados pela expressão de CK19 e mucinas mas nenhuma expressão de amilase [15], [16]. tumores pancreáticos De fato, estudos anteriores têm relatado de ratos KC e KPC expressa CK19 e frequentemente, mucina, indicando sua herança ductal [3], [4]. Para validar se as nossas linhas de células derivadas KC e KPC tinham essas características ductal, examinamos amilase e expressão CK19 por PCR em tempo real e microscopia confocal. Panc02 células foram incluídos nestas análises para comparação, e de tecido de pâncreas normal foi utilizada para estimar a expressão do gene relativo. Real-time PCR experiências mostraram alta expressão do marcador ductal CK19 nos três novas linhas celulares PDAC (

P

0,005) em comparação com Panc02 (Fig. 3A). Para nossa surpresa, as células Panc02 não mostrou qualquer expressão CK19, mesmo que foi referenciada como uma linha celular PDAC ductal murino por quase três décadas [8]. Nenhuma das quatro linhas celulares mostraram expressão amilase, enquanto pâncreas normal expressa este marcador acinar. Estes resultados foram confirmados por análise de microscopia confocal (Fig. 3B).

(A) em tempo real análise de PCR de

amilase

e

CK19

em células de rato PDAC. Estes transcritos de mRNA foram comparados em relação aos níveis de ARNm em pâncreas normal. Os dados representam as vezes de aumento médio de três repetições ± erro padrão. As estatísticas foram calculadas em relação ao pâncreas normal (*

p Art 0,005, **

p Art 0,0001). (B) A expressão da proteína de amilase e CK19 foram avaliados em linhas celulares de rato PDAC por análise confocal. A amilase foi visualizado após coloração com um anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor® 568 (vermelho fluorescente) e CK19 foi visualizado após coloração com Alexa 488 Fluor® (verde fluorescente). os núcleos das células foram coradas com DAPI.

linhas celulares KC e KPC têm características epitelial-mesenquimal

A transição epitelial-mesenquimal induz perda de adesão celular, o que corresponde a E-caderina downregulation e aumento da expressão de N-caderina, que conduz ao início do PDAC metástase [17]. Examinámos de E-caderina e N-caderina por meio de microscopia confocal e análises de Western blot nas três linhas de células Kc e KPC recém-criadas. A expressão da E-caderina foi observada na ONU-KC-6141, da ONU-KPC-960, e células da ONU-KPC-961, indicativo da sua natureza epitelial (Fig. 4A-B). Em contraste, as células Panc02 mostraram expressão mínima de caderina-E. O padrão de expressão de N-caderina foi semelhante, sendo mais proeminente nas linhas celulares KC e KPC, em comparação com a expressão em células Panc02 (Fig. 4C-D).

(A) Imagens de microscopia confocal de E -cadherin (Alexa Fluor® 568, Red fluorescente) expressão em linhas celulares de rato. os núcleos das células foram coradas com DAPI. (B) Análise de transferência de Western de E-caderina em linhas celulares de ratinho. Os lisados ​​de proteínas foram resolvidas por 10% SDS-PAGE. p-actina foi utilizado como controlo de carga. (C) confocal imagens microsocopy de N-caderina (Alexa Fluor® 488, verde fluorescente) expressão em linhas de células de ratinho. os núcleos das células foram coradas com DAPI. (D) Análise de Western blot de N-caderina em linhas celulares de ratinho. Os lisados ​​de proteínas foram resolvidas por 10% SDS-PAGE. β-actina foi utilizada como controle de carga.

linhas celulares KC e KPC expressam altos níveis da proteína MUC1 e MUC4

Diferentes tipos de mucinas são expressos no pâncreas durante a progressão PC [12 ], [18]. Além disso, as lesões precursoras PC em modelos de rato geneticamente modificadas PDAC, tais como os murganhos e KC KPC, são conhecidos para a produção de mucinas [3], [4]. Recentemente, também têm demonstrado que, no pâncreas de ratinhos KC, a expressão da proteína MUC1, MUC4, MUC5AC aumentou progressivamente e em correlação com o desenvolvimento PDAC [12]. Nós examinar se a expressão dessas mucinas pode ser corroborada nas linhas celulares KC e KPC-derivados. Para este fim, PCR em tempo real, por Western blot, e análises de microscopia confocal foi realizada. Os resultados indicaram que os níveis de transcrição relativos das mucinas transmembrana

Muc1

(

p Art 0,001), e

MUC4

(

p Art 0,05) foram significativamente maiores no UN-KC-6141, UN-KPC-960 e células UN-KPC-961 (Fig. 5A), em comparação com células de controlo (fibroblastos NIH3T3). Em células Panc02, os níveis de transcrição relativa de

Muc1

e

MUC4

foram elevados, mas eles não foram estatisticamente significativas. No entanto, as células Panc02 e as duas linhas de células derivadas de ratinhos KPC mostraram níveis mais elevados de proteína do que MUC4 a linha celular KC-derivado (Fig. 5B). Por outro lado, a proteína em Muc1 Panc02 foi menor do que nas células KC e KPC-derivados (Fig. 5C). Para nossa surpresa, MUC5AC não era detectável em qualquer das linhas celulares, quer na transcrição ou a níveis de proteína (dados não apresentados), e este pode ser uma consequência de alterações evolutivas associadas com a cultura de células.

(A ) análise de PCR em tempo real de

Muc1 Comprar e

MUC4

em linhas celulares PDAC do mouse. Os transcritos de mRNA foram normalizados para níveis de ARNm na linha de células de fibroblastos de rato NIH3T3. Os dados representam as vezes de aumento médio de três repetições ± erro padrão. significâncias estatísticas foram calculados em comparação com NIH3T3 (*

p Art 0,05, **

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* p Art 0,0001). (B) Análise de transferência de Western de MUC4 em linhas celulares de ratinho. Os lisados ​​de proteína para análise MUC4 foram resolvidas por SDS 2% de gel de agarose. β-actina foi utilizado como um controlo de carga e resolveu-se em 10% SDS-PAGE. (C) confocal imagens de microscopia da MUC1 (Alexa Fluor® 568, Red Fluorescente) expressão em linhas celulares de rato. os núcleos das células foram coradas com DAPI.

linhas celulares KC e KPC são resistentes a gemcitabina

Apesar de relatos recentes de que os pacientes de PC apresentam maior sobrevida quando tratados com folfirinox (uma combinação de oxaliplatina, irinotecano, fluorouracilo e leucovorina), em vez de gemcitabina [19], o último ainda é a droga mais utilizada no PC quimioterapia [20]. Portanto, utilizando o ensaio MTT, examinamos citotoxicidade gemcitabina na UN-KC-6141, UN-KPC-960, células Panc02 (Fig. 6A) UN-KPC-961 e. As células foram Panc02 o gemcitabina-resistente a maioria com uma concentração inibitória de metade máxima (IC-50) de 15 uM, após 48 h de tratamento (Fig. 6B). Os valores IC-50 das linhas de células Kc e KPC variou desde 0,5 uM a 5 uM. Embora as células Panc02 eram mais resistentes a gemcitabina, estes valores de CI-50 estão no intervalo comparável de células PC humanos [21], [22]. Curiosamente, a concentrações mais elevadas gemcitabina (30-100 uM) (Fig. 6A), as células da ONU-KPC-961 mostrou uma maior resistência do que as células gemcitabina Panc02.

(A) Gemcitabina citotoxicidade em linhas celulares de rato PDAC foi determinada pelo ensaio MTT citotóxico. As células foram semeadas em poços em quadruplicado e incubadas com diferentes concentrações de gemcitabina (100 nM-100 uM) durante 48 h. Depois de substituir meios com o reagente MTT e dissolver os cristais de formazano com DMSO, citotoxicidade foi calculada com base nos valores de absorvância (540 nm) = λ em células tratadas apenas com meio. Os dados apresentados são uma média de poços em quadruplicado citotoxicidades ± erro padrão. A significância estatística foi calculada em comparação com Panc02 (*

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p Art 0,0001). (B) A metade da concentração máxima inibitória (IC-50) de gemcitabina em cada linha celular foi determinado após a interpolação nos gráficos de% de citotoxicidade em função da concentração.

transplantadas linhas celulares KC e KPC induzir pancreático tumores em camundongos

o estabelecimento de linhas celulares KC e KPC na cultura fornecidos a oportunidade de examinar a sua tumorigenicidade no fundo do rato apropriado a partir do qual eles foram derivados. As células UN-KC-6141 foram testados nos camundongos C57BL /6, enquanto a UN-KPC-960 e células UN-KPC-961 foram examinados em ratos de fundo B6.129 mista. Um mês após o implante ortotópico de células-KC-6141 da ONU em ratinhos C57BL /6, os tumores formados em seu pâncreas (Fig. 7A), e as lesões metastáticas no fígado, foram observadas baço, intestino delgado, os nódulos linfáticos mesentéricos e parede peritoneal. incidência de tumores de células UN-KC-6141 foi de 100%. As duas células KPC-derivados (UN-KPC-960 e UN-KPC-961) também formou tumores após a implantação ortotópica (Fig. 7A), mas aqueles apareceu a taxas mais lentas e os tumores levou mais de dois meses para crescer. A cinética de crescimento do tumor comparativamente mais lenta das células KPC pode ter sido causado por diferenças genéticas entre células KC e KPC, bem como os diferentes fundos dos respectivos ratinhos hospedeiros. Interessantemente, as células da ONU-KPC-961 pareceu ser mais tumorigénico (incidência do tumor de 86%) do que as células da ONU-KPC-960 (tumor de incidência de 43%).