Abstract

câncer epitelial de ovário (EOC) geralmente é descoberta depois de extensa metástase desenvolveram na cavidade peritoneal. A superfície do ovário é exposto a pressões de fluido peritoneal e forças de cisalhamento, devido aos movimentos peristálticos contínua do sistema gastro-intestinal, criar um micro-ambiente mecânico para as células. Um

in vitro

modelo experimental foi desenvolvido para expor as células EOC para induzida fluxo de tensões de cisalhamento de fluidos estacionários (WSS). As células foram cultivadas EOC da linha de células OVCAR-3 nas membranas amnióticas desnudas em poços especiais. Parede tensões de corte de 0,5, 1,0 e 1,5 dine /cm

2 foram aplicados sobre a superfície das células, sob condições que imitam o ambiente fisiológico, seguido por manchas fluorescentes de actina e

β

-tubulina fibras. A resposta citoesqueleto para WSS incluiu alongamento celular, formação de fibras de stress e de geração de microtúbulos. Mais componentes do citoesqueleto foram produzidas pelas células e organizadas numa estrutura mais densa e mais organizado dentro do citoplasma. Isto sugere que a WSS pode ter um papel importante na regulação mecânica do EOC peritoneal espalhando

Citation:. Avraham-Chakim L, Elad D, Zaretsky U, Kloog Y, Jaffa A, Grisaru D (2013) dos Fluidos fluxo induzido parede tensão de cisalhamento e epitelial de ovário Câncer peritoneal espalhando. PLoS ONE 8 (4): e60965. doi: 10.1371 /journal.pone.0060965

Autor: Gil Ast, Universidade de Tel Aviv, Israel

Recebido: 18 de dezembro de 2012; Aceito: 05 de março de 2013; Publicação: 10 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Avraham-Chakim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado por uma bolsa da Associação Cancer Israel. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do ovário

epitelial (EOC) é o quinta maior causa de mortes por câncer entre as mulheres, e tem a maior proporção de letalidade-a-caso de todas as malignidades ginecológicas. O desenvolvimento de EOC começa no epitélio de superfície e é seguida por proliferação de células EOC agressivo para o ovário. Metástases de EOC são formados cedo no processo da doença de disseminação de células EOC principalmente na cavidade peritoneal. A superfície do ovário é exposto continuamente à peritoneal pressões de fluidos e forças de cisalhamento devido aos movimentos peristálticos do intestino. Este micro-ambiente mecânico foi levantada a hipótese de ser um fator importante controlar os padrões de tumor espalhando [1], [2].

estímulos mecânicos, tais como tensões de cisalhamento (WSS) foram mostrados para afetar muitos processos celulares tais como a proliferação celular, a remodelação do citoesqueleto, a adesão e migração em vários tipos de células, e amplamente estudada com as células endoteliais [3]. Experiências realizadas com as células cancerosas em cultura (por exemplo, do cólon, do ovário, da bexiga, do esófago, melanoma) revelou que a estímulos mecânicos, como a pressão ou o escoamento de fluido afectar a aderência de células cancerosas [2], [4], [5], [6], [ ,,,0],7], [8], a migração [4], [9], caderinas e integrinas expressão [10], [11], a capacidade de invasão [11], [12], a morfologia [12], [13] e viabilidade [14 ]. Muitos estudos exploraram o efeito do fluxo de sangue nas propriedades de adesão de células circulantes metastáticos [4], [5], [7], [10], [11], [12], [13], [14]. No entanto, não há nem

in vivo

nem

in vitro

estudos sobre os efeitos da WSS induzida fluxo de fluido sobre as células EOC.

Os mecanismos exactos pelos quais as células EOC penetram ovário e disseminação no peritônio ainda não foram totalmente descoberto. Por outro lado, é bem aceite que o citoesqueleto é a estrutura celular mais importante que pode distribuir as forças mecânicas em toda a célula para a manutenção da estrutura e da integridade celular. Por conseguinte, no presente estudo, exploramos a alterações no citoesqueleto de células EOC humanos em resposta ao fluxo de fluido do WSS induzida sob condições que simulam o ambiente fisiológico na cavidade peritoneal.

Materiais e Métodos

desenvolvemos um

in vitro

modelo de células EOC humanos por cultura de linha celular OVCAR-3 sobre uma membrana amniótica desnudada (AM) utilizando poços especiais que podem ser desmontadas, a fim de permitir a instalação do fundo do poço com o cultued células de EOC em uma câmara de fluxo de fluido para as experiências em que o WSS são induzidas por cima das células.

Cultura celular

as células EOC foram cultivadas a partir da linha celular OVCAR-3 (American Type Culture Colecção (ATCC), Virginia, EUA). Elas foram cultivadas em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 meio suplementado com soro fetal de bovino (FBS), uma solução de bicarbonato de sódio a 5%, tampão de Hepes 1 M, solução de glicose a 25%, solução de piruvato de sódio 100 mM, 10,000 U /mL de penicilina L e 10 mg /ml de sulfato de estreptomicina com 1250 U /ml de nistatina, e 4 mg /ml insullin bovina. As células foram primeiramente cultivadas em frascos de plástico, e ao atingir 70-90% de confluência (geralmente após 2-3 dias) foram tripsinizadas (tripsina EDTA 0,25%, solução A).

Para os experimentos de fluxo foi realizada cultura de células EOC na AM desnudada, que foi colhida a partir de placentas prazo e desnudado a partir da camada de células epiteliais, como descrito num estudo anterior [15]. A AM desnudada é uma membrana extra-celular de espessura feito de um estroma avascular que contém colágeno e fibronectina. Tem um grande potencial de adesão da célula, excelentes propriedades mecânicas e, por conseguinte, é um substrato adequado para a cultura de células EOC para exposição ao fluxo de fluido induzida WSS. O uso de AMs de placentas humanas foi aprovado pelo comitê de ética de Tel Aviv Sourasky Medical Center (# 06/376) e os doadores forneceram um consentimento informado por escrito. A AM foi instalado em poços de design personalizado que podem ser desmontados em sub-unidades para a instalação das células cultivadas em câmara de fluxo de teste e, em seguida, re-montados para posterior incubação ou testes biológicos [16]. As células cultivadas sobre a EOC AM desnudada revelou a mesma aparência de cultura de uma camada confluente como a cultura regular em frascos de plástico como mostrado na Fig. 1. Depois de a camada cultivada de células atingiram a confluência EOC na AM (ou seja, no prazo de 5 dias), o poço foi desmontado em sub-unidades, a fim de permitir a instalação do fundo do poço com as células cultivadas na câmara de fluxo.

(a) Em um balão de plástico, 3 dias após a sementeira. (B) numa membrana amniótica em poços especiais, 4 dias após a sementeira (50 K células por poço). contraste de fase microscópio de luz. Ampliação:. X10

In vitro Aplicação do Muro de tensão de cisalhamento em células cultivadas

A câmara de fluxo especial foi desenvolvida para aplicação direta do fluxo de WSS induzida fluido sobre uma monocamada de células cultivadas EOC . A câmara era uma conduta rectangular 17 cm de comprimento com uma secção transversal de 28 mm x 1 mm ligados com uma bomba num circuito fechado (Fig. 2a). A câmara de fluxo foi desenhado para conter 3 fundo dos poços com células em cultura, a fim de reduzir o comprimento de uma única experiência e para ter várias amostras biológicas para análise estatística com algumas repetições. A bomba pode gerar taxas de fluxo constante até a um máximo de 2,52 L /min (ColeParmer, EW-07012-20) com um campo uniforme de forças de cisalhamento sobre a superfície das células. O meio de crescimento das células foi utilizado como o fluido no sistema. A sua viscosidade dinâmica foi assumido semelhante à da água,

μ

= 0,0007 N⋅s /m

2. O espaço sob o bem-fundo no interior da câmara de fluxo foi preenchido com meio de cultura estática que estava em contacto com o plano inferior do AM no poços de fundo ao longo das experiências. Os experimentos foram realizados dentro da incubadora a condições ambientais de 5% de CO2 e 37 ° C (Fig.2B).

A câmara de fluxo pode conter 3 bottoms também. (B) Desenho dos componentes da câmara de fluxo e o fundo dos poços.

Experimental Protocolo

A magnitude do WSS na cavidade peritoneal é considerado muito baixo, mas desconhecido. simulações computacionais recentes modelos de gastro-intestinal os valores previstos do WSS na gama de 0,14 dine /cm

2 a 11 dines /cm

2 [16]. Consequentemente, foi aplicado sobre as células cultivadas EOC constante uniforme WSS de 0,5 dine /cm

2, 1,0 dine /cm

2 e 1,5 dine /cm

2 por períodos de 30 minutos. Assumiu-se o campo da WSS para ser devido ao escoamento laminar para as quais o número de Reynolds 2,000, e, por conseguinte, calculado a taxa de fluxo no circuito fechado através de um método descrito anteriormente [17]

Uma quantidade semelhante de. 50.000 células por poço EOC foi cultivada em AM em todas as culturas utilizadas neste estudo. Todas as experiências foram realizadas com células EOC bem diferenciadas que foram cultivadas durante 2-5 dias. As culturas de controlo para cada uma das experiências foram semeadas e incubadas de forma semelhante às culturas estressadas, e foram definidos como culturas, em condições estáticas, enquanto todas as outras condições permanecendo o mesmo. Cada experimento foi repetido 3 vezes com 3 bottoms bem com células EOC cultivadas para a análise estatística.

Coloração de fibras Citoesqueleto

manchas fluorescentes imuno-histoquímico das β-tubulina e F-actina foram realizados a fim para identificar as alterações morfológicas e estruturais no citoesqueleto das células. A fixação das células foi realizada incubando o fundo dos poços com as células numa solução de paraformaldeído a 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente (TA) após a remoção do meio. Em seguida, a perfuração da membrana celular foi realizada por incubação das células em bloco de burro, uma diluição de 5% de soro de burro (Jackson Immunoresearch, Suffolk, UK) em PBST (PBS com Tween 20 a 0,05%), durante 4-5 horas num agitador rotativo ( 60 rpm) à temperatura ambiente.

fibras

p-tubulina foram coradas por incubação das células em uma diluição de anticorpo primário anti-tubulina β 1:500 monoclonal de ratinho, clone 2.1 (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) em bloco de burro, durante 1 hora num agitador rotativo (60 rpm) à temperatura ambiente, e, em seguida, a incubação durante a noite a 4 ° C. Na manhã seguinte, as células foram lavadas 3 vezes durante 45 minutos com o bloco de diluente (uma diluição 1:03 de bloco de burro: PBST) e foram incubadas com o anticorpo secundário – anticorpo de burro anti-rato rodamina secundário (Jackson Immunoresearch, Suffolk, UK ) – a uma diluição 1:400 no bloco diluente. As células foram incubadas com o anticorpo secundário durante 4 horas, num agitador, à TA, e depois lavou-se novamente 3 vezes durante 45 minutos com o bloco de diluente. fibras de stress de actina foram coradas após incubação em 1:1000 diluição de Faloidina marcada com FITC (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) em PBS, durante 20 minutos num agitador à temperatura ambiente e, em seguida, lavada duas vezes com PBS.

depois de as manchas foram concluídas, as membranas foram removidas e colocadas em lâminas de microscópio de vidro. Vidros de cobertura foram montados em lâminas de vidro usando uma única gota de DAPI + gel de montagem (Santa Cruz Biotechnology, Inc através Enco, Petah Tikva-, Israel), que também manchou o núcleo da célula. As células foram examinadas sob uma SP5 Leica e Zeiss 410 microscópios confocal usando uma objetiva de água ampliação X40.

Análise do citoesqueleto alterações estruturais

Observação de imagens confocal depois de expor as culturas EOC para WSS revelou celular alongamento da poligonal e arredondado para elipsoidal. Semelhante a outros estudos [13], que caracterizou a forma elipsoidal pela relação de aspecto que define a razão entre os longas e curtas diâmetros de uma elipse. Usando as aplicações de imagiologia para microscópios confocais medimos estes diâmetros que eram verticais uns aos outros sobre as células de imagens (fig. 3). A relação de aspecto foi calculada para a estimativa do nível de alongamento das células com 1,0 representando um círculo.

Estimativa de microtúbulos e a formação de fibras de stress foi feita por observação. Três níveis de fibras de stress ou microtúbulos formação foram definidos, de acordo com sua aparência nas imagens adquiridas (Fig. 4): “Low Level” indica que actina ou β-tubulina foram coradas com destaque para o anel cortical da célula e quase nada em o centro da célula (fig. 4aa, 4BA). “Nível Intermediário” indica que a maioria saliências, microspikes e fragmentos de actin- ou β-tubulina eram visíveis (Fig. 4AB, 4bb). “Alto nível” indica que a maioria da área central da célula continha fibras de stress ou microtúbulos, quase sem fragmentos de fibras e pouca coloração nas áreas periféricas da célula (Fig. 4ac, 4BC).

(a) baixo nível, actina na maior parte cortical e quase sem fibras de stress, (b) nível intermediário, algumas fibras são formados, principalmente em saliências celulares, e (c) de alto nível, a maioria da área central da célula é abundante com fibras de stress. (B) Três níveis diferentes de formação de microtúbulos: (a) Nível Baixo, na sua maioria fragmentos de β-tubulina e quase nenhum microtúbulos citoplasmáticos, (b) nível intermediário, alguns microtúbulos foram formados dentro da célula, e (c) de alto nível, uma densa rede de microtúbulos foi gerado no interior das células.

análise estatística

análise One-way e bidireccional de variância (ANOVA, SPSS 11.5.1), seguido por um teste de Tukey foram utilizado para realizar as comparações múltiplas entre os resultados obtidos após a exposição das células EOC para diferentes tensões de corte. Para os resultados de fibras de stress e microtúbulos formação de um teste qui-quadrado foi realizado eo significado de uma associação linear-by-linear foi testada.

Resultados

O presente estudo demonstrou que as alterações morfológicas das fibras do citoesqueleto de células cultivadas na EOC AM desnudada depois de exposição a WSS fluxo de fluido. imagens confocal mostrou a transformação das células forma a partir de formas poligonais e arredondados a formas elipsoidais, após 30 min de exposição para WSS (Fig. 5A). As longas e curtas diâmetros de 541 células (ou seja, 136, 64, 223 e 118 células para WSS de 0,0 (controle), 0,5, 1,0 e 1,5 dine /cm

2, respectivamente) foram medidos e suas proporções correspondentes foram calculado. A relação de aspecto média aumentou em 12,4%, 19,2% e 27,8% em comparação com a do controlo em comparação para células expostas a WSS de 0,5, 1,0 e 1,5 dine /cm

2, respectivamente. Para a análise estatística utilizou-se o logaritmo destes valores numéricos, permitindo, assim, analisar resultados com uma distribuição normal (Fig. 5B). A relação de aspecto aumentou significativamente em relação ao grupo de controlo como WSS aumentou (P 0,001). Uma diferença significativa existe também entre a 0,5 dine /cm

2 e os 1,5 dine /cm

2 grupos, e entre o dyne 1,0 /cm

2 e 1,5 dine /cm

2 grupos ( p 0,05). No entanto, não há diferença significativa entre o 0,5 dine /cm

2 ea 1 dyne /cm

2 grupos próprios.

As setas estão apontando para representar células. (A) cultura de controlo, (b) 0,5 dine /cm

2 de cultura, (c) 1,0 dine /cm

2 de cultura, e (d) de 1,5 dine /cm

2 culturas. (B) Variação do valor logarítmico da relação de aspecto que define o nível de alongamento das células com o nível da tensão de corte aplicada (± desvio padrão).

formação de uma rede filamentosa espessura do stress fibras foi observada em células expostas a tensão de corte, em comparação com culturas de controlo em que a actina estava presente principalmente nas áreas periféricas da célula. Observou-se a formação de fibras de tensão em células 640; 235, 78, 142 e 185 células para WSS de 0,0 (controle), 0,5, 1,0 e 1,5 dine /cm

2, respectivamente. Imagens representativas de mancha de actina em culturas de células EOC que foram expostos a diferentes WSS durante 30 minutos, em comparação com culturas estáticas são apresentados na Fig. 6A. Mais fibras de stress foram formados no interior do citoplasma das células como o AAS foi aumentada (Fig. 6B). Geralmente, a percentagem de células que demonstram um nível reduzido de formação de fibras de stress diminuiu em comparação com o grupo de controlo como WSS aumentou (ou seja, a partir de 80% no grupo estático em comparação com 28,1% no de 1,5 dine /cm

2 grupo) . A percentagem de células com um nível intermédio de formação de fibras de tensão aumentada em comparação com o grupo de controlo como WSS aumentou (isto é, de 18,3% no grupo a 49,2% estática no 1,5 dine /cm

2 grupo). A percentagem de células com um elevado nível de formação de stress fibras geralmente aumenta nos grupos estressadas em comparação com o grupo de controlo (isto é, de 1,7% no grupo de estática para 22,7% no de 1,5 dine /cm

2 grupo). O teste do qui-quadrado mostrou que linear-por-linear de associação para estes resultados foi estatisticamente significativa (p 0,001), o que significa que houve uma relação linear entre a magnitude da WSS e o nível de formação de fibras de stress e que o nível de fibras de tensão formação depende da grandeza da tensão de cisalhamento.

(a) cultura de controlo (sem WSS), (b) células expostas a WSS de 0,5 dine /cm

2, (c) células expostas a WSS de 1,0 dine /cm

2, e as células (d) expostas a WSS de 1,5 dine /cm

2. (B) A percentagem de células em cada um dos três níveis de formação de fibras de stress, para diferentes níveis de tensão de cisalhamento. (C) A relação de aspecto média logarítmica de alongamento celular para cada nível de formação de fibras de stress (± 2 · erro padrão).

Também explorou a relação entre a formação de fibras de stress e alongamento celular. Para esta análise estatística, os diâmetros longas e curtas de 221 células (ou seja, 110, 13, 62 e 36 células para o WSS de 0,0 (controlo), 0,5, 1,0 e 1,5 dine /cm

2, respectivamente, foram medidos e suas proporções correspondentes foram calculadas para cada nível de formação de fibras de stress, ignorando a tensão de cisalhamento (Fig. 6C). encontrou-se uma diferença significativa entre a proporção do grupo de baixo nível de formação de fibras de stress de aspecto (denotado “a”) e o grupos intermédios e de elevado nível de formação de fibras de stress (denotado “b”), um b (p 0,05). Quando se considera a tensão de cisalhamento, bem como, a interacção entre cisalhamento formação de fibras de tensão e de esforço (em relação ao seu efeito sobre o relação de aspecto) não foi encontrado estatisticamente significativa (p .. 0,05) Este resultado sugere que o efeito da formação de fibras de stress nos rácios das células alongadas de aspecto era independente do nível de tensão de cisalhamento

Um densa e organizada rede de microtúbulos do citoesqueleto foi gerado após exposição das células a tensão de cisalhamento, em comparação com fragmentos de tubulina e coloração lateral, em culturas de controlo. Observou-se a formação de microtúbulos em 494 células; 156, 33, 111 e 194 células para WSS de 0,0 (controle), 0,5, 1,0 e 1,5 dine /cm

2, respectivamente. Imagens representativas de microtúbulos mancha em culturas de células EOC que foram expostos a diferentes WSS durante 30 minutos, em comparação com culturas estáticas são representadas na Fig. 7A. É evidente que mais microtúbulos foram formados no citoplasma das células, pois o aumento da WSS (Fig. 7B). Geralmente, a percentagem de células que demonstram um nível reduzido de formação de microtúbulos diminuiu em comparação com o grupo de controlo como WSS aumentou (isto é, a partir de 84% em culturas estáticas para 20,6% no de 1,5 dine /cm

2 grupo). Não houve um comportamento consistente para o nível intermédio, como a percentagem de células que demonstram um nível intermédio da formação de microtúbulos aumentou inicialmente entre a estática e 0,5 dine /cm

2 grupos (isto é, 16% e 63,6%, respectivamente), e foi, em seguida, ligeiramente diminuída na dine 1,0 e 1,5 /cm

2 grupos (isto é, 55% e 54,6%, respectivamente). A percentagem de células que demonstram um alto nível de formação de microtúbulos aumentou de 0% na dine estática e 0,5 /cm

2 grupos para quase 10% no dine 1,0 /cm

2 grupo e mais de 24% em 1,5 dyne /cm

2 grupo. O teste do qui-quadrado estabelecido que associação linear-por-linear para estes resultados é estatisticamente significativa (p 0,001), o que significa que existe uma relação linear entre a grandeza da tensão de cisalhamento e o nível de formação de microtúbulos e que o nível de formação de microtúbulos depende sobre a grandeza da tensão de cisalhamento.

(a) cultura de controlo (sem WSS), (b) células expostas a WSS de 0,5 dine /cm

2, (c) células expostas a WSS de 1,0 dine /cm

2, e (d) células expostas a WSS de 1,5 dine /cm

2. (B) a percentagem de células em cada um dos três níveis de formação de microtúbulos, para diferentes níveis de tensão de cisalhamento. (C) A relação de aspecto média logarítmica de alongamento celular para cada nível de formação de microtúbulos (± 2 · erro padrão).

Foi também avaliada a relação entre a formação de microtúbulos e alongamento celular. Para esta análise, os diâmetros longas e curtas de 191 células (isto é, 82, 8, 58 e 43 células para o WSS de 0,0 (controlo), 0,5, 1,0 e 1,5 dine /cm

2, respectivamente, foram medidos e os seus proporções correspondentes foram calculadas para todos os níveis de formação de microtúbulos, ignorando a tensão de cisalhamento (Fig. 7C). foi encontrada uma diferença significativa entre as proporções do grupo de baixo nível de formação de microtúbulos aspecto (denotada “a”) e do intermediário e alto grupos nivel de formação de microtúbulos (denotado “b”), um b (p 0,05). Quando se considera a tensão de cisalhamento, assim, foi encontrada a interacção entre a tensão de corte e a formação de microtúbulos (em relação ao seu efeito sobre a proporção de aspecto) estatisticamente significativa (p 0,05). a implicação é que o efeito da formação de microtúbulos nos rácios das células alongadas aspecto dependem do nível de tensão de cisalhamento

Discussão

o cancro do ovário é a. causa mais comum de morte entre malignidades ginecológicas e geralmente é diagnosticado numa fase avançada [18]. As células EOC superfície peritoneal são expostos a pressões do fluido e forças de cisalhamento, devido aos movimentos peristálticos do sistema gastro-intestinal, a criação de um ambiente micro mecânico para as células [2], [19]. estímulos mecânicos, tais como WSS foram mostrados para afectar muitos processos celulares em vários tipos de células [3]. O presente trabalho investigou os efeitos da WSS na remodelação do citoesqueleto das células cultivadas EOC. Para este efeito, foi desenvolvido um novo modelo de EOC cultivadas na AM desnudada, que é uma membrana de colágeno facilmente acessível e mais de perto simula o

in vivo

condições em que as células crescem em substratos não-rígidas. As células cultivadas no presente estudo cresceu como uma monocamada com a aparência típica de paralelepípedos-like semelhante às culturas em frascos de plástico em outros estudos [20].

Os resultados do presente estudo mostraram que o fluxo de fluido induzida WSS estimulou o alongamento celular, formação de fibras de stress e de geração de microtúbulos em células EOC. Os rácios de aspecto de células expostas a 1,5 dine /cm

2 aumentou significativamente em comparação com a do 0,5 dine /cm

2 e 1,0 dine /cm

2 grupos. O alongamento e alinhamento de células cultivadas na direcção do fluxo são comuns efeitos de tensão de corte e têm sido amplamente estudados em células endoteliais [21], [22], [23]. Presentemente, no entanto, não se observou qualquer alinhamento célula na direcção do fluxo. Este pode ser o resultado do tempo relativamente curto de exposição a células de WSS. Enquanto as células no presente estudo foram expostos a WSS durante 30 minutos, o alinhamento das células em relação a uma direcção específica foi demonstrado em outros tipos de células apenas após 24 horas de exposição a WSS [21], [22], [23], [ ,,,0],24]. Deve notar-se que o alongamento das células foi relatado para ocorrer após o tempo de exposição mais curto a tensão de corte [13], [23]. A resposta acima mencionada alteração da forma das células endoteliais para WSS (isto é, o alongamento e orientação na direcção do fluxo) foi assumido específico da célula, uma vez que não foi observada em células de músculo liso e células epiteliais nasais [25], [26], [27 ]. O presente resultado pode também estar relacionado com a elasticidade da mambrene amniótico em que as células foram cultivadas EOC. Foi relatado anteriormente que a resposta das células, incluindo a remodelação do citoesqueleto, dependem da rigidez e elasticidade dos seus substratos [28].

Uma distribuição intrigante da mancha de actina foi observado sob exposição a WSS. culturas estáticas demonstrou bandas periféricas densas de actina, enquanto fibras de stress centrais eram escassos. No entanto, em células expostas a WSS uma rede filamentosa da actina foi formada dentro da célula que foi linearmente relacionada com a grandeza da tensão de cisalhamento. Estes resultados implicam que a tensão de corte atinge o citoesqueleto de actina das células EOC. a formação de fibras de stress também afecta a relação de aspecto, no entanto, este efeito não é dependente do nível de tensão de cisalhamento. Alterações semelhantes na forma celular e organização estrutural, também foram observados em

células cultivadas endoteliais, que apareceu poligonal com algumas fibras de stress em condições estáticas, enquanto que as células expostas a WSS desenvolvidas numerosas fibras de stress e, numa fase posterior, também alongadas [24], [29], [30], [31], [32], [33], [34]. Um resultado semelhante de remodelação da actina-tubulina induzida WSS também foi observado em células de câncer de esôfago metastáticos [11]. Por outro lado, as células de carcinoma do cólon expostas a tensão de corte de 2,4 dine /cm

2 durante 45 minutos demonstraram uma diminuição na formação de actina sem o stress de alongamento ao longo da direcção de fluxo de [35].

O presente estudo demonstrou a formação de microtúbulos citoplásmicos em células estressadas, com a geração de uma rede central, filamentosa de microtúbulos em comparação com células estáticas em que fragmentos de microtúbulos localizadas principalmente periférica. a formação de microtúbulos influencia as relações entre as células estressadas aspecto e este efeito depende do nível da WSS. Também foi observado um resultado semelhante de microtúbulos estabilizados mais densas e mais no citoplasma da célula e em torno do núcleo de células em células endoteliais expostas a WSS constante de 15-20 dine /cm

2 durante 24 horas exibiu [22], [36] , [37]. É digno de nota que a constante WSS aplicado sobre nasal fragmentação microtúbulos induzida por células epiteliais, enquanto oscilatório WSS resultou numa rede de microtúbulos e filamentos mais organizados no citoplasma, incluindo a geração de novas microtúbulos [17], [25]. Em outro estudo, as células cancerosas esofágicas metastático que foram expostas a taxa de cisalhamento venosas de 200 durante 30 minutos mostrou polimerização rápida e trans-localização de tubulina ao bordo de ataque da célula oposta à localização do anel cortical sob condições estáticas [12].

a integração dos resultados do presente estudo sobre as alterações do citoesqueleto implica que a exposição de células EOC para WSS pode induzir o movimento celular. O primeiro passo na motilidade celular ocorre quando a célula se estende protuberâncias tais como filopodia e lamelip�ios na direcção do seu movimento por polimerização de actina na vanguarda. Muitas das células do presente estudo demonstrou a formação de saliências de actina, especialmente em células em que se observou um nível intermédio de formação de fibras de stress (por exemplo, na Fig. 6A e 6C). Como as fibras de stress são importantes para as actividades contrácteis de uma célula móveis, a produção de mais fibras de stress, as células podem indicar que a célula foi puxado para a frente, como parte do processo de motilidade. fibras de stress podem também ter um papel importante na adesão celular à matriz extra-celular através de integrinas que formam as adesões focais durante o movimento celular. Os microtúbulos e interacções actina-microtúbulos podem também ter papéis importantes na motilidade celular [38]. As células tratadas com microtúbulos agentes despolimerização perder sua aparência polarizada e fazer protuberâncias simultaneamente em todo o seu perímetro. Um citoesqueleto de microtúbulos intacto foi necessário a fim de manter a distribuição de saliências polarizada dependente da actina no bordo de ataque de um fibroblasto de migração [39].

As células cancerígenas cultivadas em matrizes tridimensionais demonstraram morfologias alongadas e arredondadas como um resultado do mesênquima e migrações ameboides, respectivamente. No presente estudo, a relação de aspecto média de células alongadas, demonstrando um baixo nível de tensão formação fibras foi significativamente menor do que a de células que demonstram níveis elevados de intermediários e formação de fibras de stress. Estes resultados podem sugerir que as células EOC usar um modo mesenquimais da migração de células como resultado de exposição a WSS, e, portanto, são alongadas. células alongadas têm salientes membrana na borda e formar líderes aderências dependente de integrina com o substrato [40]. Além disso, a inibição da polimerização da actina e tubulina suprime a migração de células de cancro, que suporta o facto de que a polimerização de actina e tubulina é essencial para a motilidade das células [41]. No entanto, um estudo recente mostrou que a interferência com a dinâmica de actina é mais eficaz na inibição da motilidade das células de cancro do ovário humano que perturbação da função dos microtúbulos [42]. Esta evidência suporta a nossa suposição de que WSS induzir motilidade celular em células EOC. Este efeito da WSS podem ter uma ligação importante para os processos de sheading e disseminação metastática do cancro de ovário epitelial. terapia do cancro dirigida para microtúbulos ea dinâmica de polimerização de filamentos de actina pode ser uma abordagem útil para inibir a cinética celular e metástase peritoneal resultante.

Em conclusão, o presente estudo prevê pela primeira vez dados sobre alterações do citoesqueleto em células EOC exposto ao fluxo de fluido induzida WSS, que estão previstos para a cavidade peritoneal. A resposta citoesqueleto para WSS foi clara e significativa, especialmente em magnitudes mais elevadas de WSS, e incluiu alongamento celular, formação de fibras de stress e de geração de microtúbulos, que são componentes celulares essenciais para a movimentação das células. Estes resultados sugerem que o ambiente mecânico do EOC tem um papel importante na proliferação e espalhamento e também devem ser considerados para o desenvolvimento de ferramentas terapêuticas para a prevenção do câncer de metástase peritoneal de ovário.