Abstract
Fundo
Patogênese e fatores para determinar a progressão da esteatose bebidas alcoólicas e não-alcoólicas para esteato-hepatite com risco de progressão para cirrose hepática e câncer são mal compreendidos. No presente estudo, teve como objetivo identificar assinaturas moleculares potenciais para a discriminação de esteatohepatite de esteatose.
Foi aplicado
Metodologia e Resultados
análise de expressão gênica por microarrays global para desvendar genes diferencialmente expressos entre esteatohepatite em comparação com amostras de esteatose e controle. Para anotação funcional, bem como a identificação de processos biológicos de doenças relevantes dos genes diferencialmente expressos a ontologia gene foi usado (GO) banco de dados. genes candidatos seleccionados (n = 46) foram validados em 87 amostras de fígado humano a partir de duas coortes de amostra por quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR). A análise GO revelou que os genes regulados negativamente em esteatohepatite eram principalmente envolvidos em processos metabólicos. Os genes regulados positivamente em amostras esteatohepatite foram associados com a progressão e a proliferação do cancro. Em amostras de ressecção hepática cirúrgicos, 39 genes e em biópsias hepáticas percutâneas, 30 genes foram significativamente up-regulamentada em esteato-hepatite. Além disso, a investigação imuno-histoquímico de tecido hepático humano revelou um aumento significativo da expressão da proteína AKR1B10 em esteatohepatite.
Conclusões
O desenvolvimento de esteato-hepatite é caracterizada por alterações moleculares distintas. Os exemplos mais marcantes a este respeito foram
KRT23
e
AKR1B10
, que encontramos a ser altamente diferencialmente expressos em esteatohepatite em comparação com esteatose e fígado normal. Propomos que
KRT23
e
AKR1B10
pode servir como futuros biomarcadores potenciais para esteato-hepatite, bem como marcadores de progressão para HCC
Citation:. Starmann J, Fälth M, Spindelböck W, Lanz KL, Lackner C, Zatloukal K, et al. (2012) Gene Expression Profiling Unravels câncer relacionado ao hepática Molecular Assinaturas em Esteato-hepatite, mas não em esteatose. PLoS ONE 7 (10): e46584. doi: 10.1371 /journal.pone.0046584
editor: Wing-Kin Syn, Institute of Hepatology Londres, Reino Unido
Recebido: 05 de abril de 2012; Aceito: 02 de setembro de 2012; Publicação: 10 de outubro de 2012
Direitos de autor: © Starmann et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Áustria Wirtschaftsservice GmbH (AWS) eo austríaco Nationalstiftung através do quadro do programa de investigação IMGuS (Instituto de Medicina e Genome Research e biologia de sistemas, Viena). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes. Áustria Wirtschaftsservice GmbH é uma agência de financiamento público não comercial organizada como um lucro GmbH não. Não era nem envolvido em todas as decisões sobre a direção da investigação financiada nem no desenho do estudo; recolha, análise e interpretação dos dados; escrita do papel; e decisão de enviar para publicação. O financiamento através da Áustria Wirtschaftsservice GmbH não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
doenças de fígado gordo compreendem um espectro de gravidade que varia de esteatose simples sobre esteatohepatite para cirrose e câncer hepatocelular (HCC) [1], [2]. Existem dois principais etiologias para doença hepática gordurosa, ou seja, álcool e distúrbios associados com a síndrome metabólica, como obesidade e diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Devido à sua alta prevalência e potencial de resultados hepáticos graves, como cirrose hepática e carcinoma hepatocelular em uma fração substancial de indivíduos afetados, doença hepática gordurosa tornou-se um grande problema de saúde pública. Até 30% da população em geral é afetada pela doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), atingindo até 70% entre os pacientes diabéticos [3], [4]. A prevalência de esteatose e esteato-hepatite em doentes obesos submetidos a cirurgia bariátrica é tão alta como 76% e 37%, respectivamente, [3], [5]. Esteatohepatite desenvolve em cerca de 20% dos alcoólatras e até 50% do DM2 que também são obesos (IMC 30). Isto coloca doença hepática gordurosa como a doença de fígado mais comum do
contabilidade do século 21 para a maioria dos cirrose hepática e carcinoma hepatocelular nos países ocidentais. Sua prevalência é esperado para subir ainda mais à luz da epidemia em curso de diabetes e obesidade [1], [2].
Embora simples esteatose tem um curso relativamente benigno e é principalmente reversível, esteato-hepatite carrega um prognóstico pobre e pode levar a danos hepáticos graves com progresson para cirrose e carcinoma hepatocelular. marcadores não-invasivos convencionais, tais como transaminases séricas correlacionar mal com o risco de desenvolvimento, bem como progressão da doença hepática e fígado testes de rotina atualmente disponíveis pode até ser brilhe em uma proporção significativa de pacientes com esteatohepatite [6]. Portanto, na prática clínica padrão atual, marcadores séricos e de imagem não invasivos não permitem a distinção de fígado gordo relativamente benigna da esteatohepatite progressiva. Esta situação resulta em subdiagnosticada e subtratada desses transtornos. O desenvolvimento de estratégias de diagnóstico, prognóstico e terapêutico eficientes tem sido substancialmente dificultada pelo facto de que a nossa compreensão da patogénese molecular de esteatohepatite está ainda incompleta. Vários estudos mostraram que as diferentes formas de esteato-hepatite (alcoólicas – ASH, não-alcoólicas – NASH) não pode ser morfologicamente distinto, o que sugere um mecanismo patogênico comum apesar das diferentes etiologias da doença [7]. Um grande problema não resolvido é a diferença acentuada do risco individual de desenvolver esteato-hepatite e progredir para cirrose (por exemplo, apenas 20% dos bebedores pesados ou 50% do tipo II obesos diabéticos desenvolver esteato-hepatite; hispânicos e caucasianos são mais suscetíveis do que Afro- americanos [8], [9]). No entanto, os fatores responsáveis pela progressão da doença em todo o espectro da doença hepática gordurosa são mal compreendidos. Por que alguns pacientes são protegidos contra o desenvolvimento de esteato-hepatite ou esteatose simples, enquanto outros não são, ainda é incerto [10]. está mesmo discutível se esteatose e esteatohepatite representam duas fases da doença consecutivos; alternativamente, os indivíduos podem
a priori
ser pré-determinado para desenvolver tanto um esteatose bastante benigno ou esteatohepatite prognóstico desfavorável [4].
No presente estudo, foi realizada a expressão do gene à base de microarray profiling análise esteatose e esteato-hepatite e os comparou com amostras de fígado humano normal. Estamos focados em analisar as mudanças de transcrição de genes relevantes em esteato-hepatite, mas não em esteatose hepática normal e para identificar potenciais assinaturas como base para o desenvolvimento de biomarcadores na discriminação de esteatohepatite como uma doença de prognóstico mais relevante. Notavelmente, que teve como objetivo investigar as alterações moleculares entre esteato-hepatite e esteatose, em vez de diferenciar entre etiologias da doença de NALFD. No geral, validada a expressão de 46 genes alvo em amostras de fígado humano a partir de duas coortes. Nós demonstramos uma assinatura molecular até agora desconhecida para as mudanças relacionadas ao câncer nos esteato-hepatite, mas não em esteatose. Vários genes foram significativamente altamente expressa em comparação com esteato-hepatite e esteatose hepática normal. A proteína associada de um gene (
AKR1B10
) foi expresso em tecido esteato-hepatite. A assinatura gene relatado neste estudo pode servir como uma ferramenta valiosa para distinguir entre esteatose e esteato-hepatite, bem como para o desenvolvimento futuro de biomarcadores de diagnóstico e prognóstico. Além disso, os resultados oferecem importantes insights sobre a patogênese da doença, que também podem ser relevantes para a concepção de futuras estratégias terapêuticas.
Métodos
amostras de tecido do paciente
O detalhada dados clínicos, bioquímicos e histológicos dos pacientes estudados são apresentados na tabela 1, 2 e 3. o estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Graz (EK number: 20-119 ex 08/09). Os diagnósticos de todas as amostras utilizadas foram histologicamente validado por um patologista certificado pensão (CL) antes da análise molecular. Para análise histológica, hematoxilina e eosina (H E) e azul Chromotrope anilina (CAB) foram utilizados cortes corados. Um diagnóstico histológico de esteatose foi realizada, se mais do que 5% da área do parênquima foi ocupada por esteatose usando rotina de H E de manchas, enquanto que o diagnóstico da esteatohepatite (SH) baseou-se na presença de balão hepatocelular em combinação com graus variáveis de esteatose e /ou inflamação [11], [12]. Estágio de fibrose hepática foi avaliada de acordo com o Sistema de Pontuação NASH Rede de Pesquisa Clínica para DHGNA [13].
Oitenta e sete amostras de dois grupos independentes de amostras de fígado humano com alcoólica e doença hepática gordurosa não alcoólica foram usados para este estudo (tabela 4). O primeiro grupo ( ‘Biobank coorte’, n = 58) consistiu em amostras não neoplásicas do tecido do fígado (isto é, controlos hepática normal, n = 18; esteatose, n = 30; esteatohepatite, N = 10, 02/08 destes cirrótico /não-cirrótico) obtidos a partir de pacientes que foram submetidos a ressecções hepáticas por causa de HCC (n = 7), outras lesões do fígado maligna (N = 33, 20/33 cancro do cólon) ou tumores benignos do fígado (n = 7) (tabela 1 e 2 ). Oito pacientes dos quais foram obtidas amostras de esteatose tinha recebido uma quimioterapia contendo platina (7/8 FOLFOX) três meses antes da ressecção. Embora esteatose pode ser um efeito colateral do tratamento FOLFOX, não havia nenhuma indicação de que estes casos estavam relacionados com a quimioterapia. Além disso, foram incluídas amostras de tecido de fígados de doadores explantados não utilizados para o transplante (n = 11).
O segundo grupo ( ‘coorte Biópsia’, n = 29) abrangeu amostras percutâneas biópsia do fígado, incluindo esteatose (n = 13), esteato-hepatite (n = 11, destes, 5/6 cirrótico /não-cirrótico), e a hepatite C crónica (CHC, n = 5, todos genótipo 1) como controlos de doença com ausência de esteatose. Na coorte de biópsia, amostras de CHC foram utilizados como controlos vez que os pacientes com tecido de fígado normal, não submetidos a biópsia hepática percutânea (tabela 3). O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes antes da utilização de uma alíquota do tecido de biópsia hepática para análise molecular.
extracção de ARN e de controlo de qualidade
O ARN total foi isolado a partir das amostras utilizando TRI Reagent® (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante. A qualidade do RNA foi analisado utilizando electroforese microcapilar (Agilent Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies, Böblingen, Alemanha). Somente amostras com RIN (RNA número de integridade) de 5,0 ou superior foram submetidos à análise de matriz expressão do gene.
Illumina microarrays experimentos e análise de dados
gênica global rastreios de expressão foram realizadas utilizando apenas amostras Biobank ( esteatohepatite n = 8 (6/2 cirrótico /não-cirrótico), esteatose n = 14 e os controles n = 10). Para análise da expressão gênica, usamos toda a expressão do genoma microarrays chips de expressão Sentrix® Humano-6 v3 talão (Illumina®, San Diego, CA, EUA), abrangendo 49577 características. Os experimentos foram realizados no Centro de genômica e proteômica Núcleo de DKFZ Heidelberg utilizando 300 ng /mL de RNA e protocolos recomendados pelo fornecedor.
Os dados brutos foi log2-transformados e quantil-normalizado. Análise de Componentes Principais (PCA) foi realizada para investigar a estrutura de dados interna de uma forma que melhor explicou a variância nos dados e identificar potenciais valores atípicos. O “limma” pacote-R foi utilizada para identificar genes expressos diferencialmente [14]. Com “limma”, um modelo linear está equipado para cada gene e um t-teste é utilizado para identificar genes expressos diferenciais. Os valores de p foram ajustados para múltiplos testes usando o procedimento Benjamini-Hochberg (BH). Além disso, uma mudança de dobragem de pelo menos 30% foi necessária para designar um gene que expresso diferencialmente. dados resultante foi importado para análise Ingenuity Pathway software (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA, EUA), para identificar excesso ou caminhos sub-representados, bem como potenciais biomarcadores.
Os dados discutidos nesta publicação foram depositados em Gene Expression Omnibus NCBI [15] e são acessíveis através GEO Series número de acesso GSE33814 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=nrmdhyayykcgavo acc=GSE33814).
Quantitative PCR em tempo real
análise de expressão gênica quantitativa foi realizada com 87 amostras humanas de tecido hepático (amostras Biobank: 10 esteato-hepatite, 8/2 cirrótico /não-cirrótico; 30 esteatose e 18 controles; amostras de biópsia: 11 esteato-hepatite, 5/6 cirrótico /não-cirrótico; 13 esteatose; 5 controlos de doença de pacientes com hepatite C crónica) usando PCR em tempo real (LightCycler®480 real-Time PCR System, Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha). Foram aplicados gene iniciador específico e sonda TaqMan ® ensaios de expressão de gene (Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemanha) e realizada a quantificação relativa de todos os genes.
HPRT1
foi usado como um gene de manutenção da casa para normalizar os dados. O valor Cp foi extraído do software Lightcycler®480 1.5.0 e o nível de expressão foi calculada com a 2
-ΔCp método [16], [17].
Imunohistoquímica
para análise imuno-histoquímica de 3 um de espessura secções de parafina de tecido do fígado de hepatite C crónica, EHNA esteatose associada (Nafl) e esteato-hepatite foram desparafinados e re-hidratadas de acordo com procedimentos padrão. Para a recuperação de antigénio, as secções foram microondas no alvo Retrieval Solution a pH 9.0 (Dako S2367 REAL ™; Dako, Glostrup, Dinamarca), durante 40 min a 160 W seguido de arrefecimento durante 20 min à TA. As secções foram então lavadas em água e PBS. O bloqueio foi realizado com Dako REAL ™ Solução de Bloqueio durante 10 minutos antes da incubação com os anticorpos contra o AKR1B10 da aldose-redutase (Novus Biologicals, Littleton, CO, EUA) diluídos em 1:500 Dako REAL ™ Diluente de Anticorpo durante 60 min à TA. A ligação dos anticorpos foi detectada com o Dako REAL ™ EnVision ™ Sistema de detecção de peroxidase /DAB
+, coelho /rato que conduz a um produto de reacção castanho-avermelhado.
AKR1B10 expressão da proteína detectada no citoplasma de hepatócitos foi avaliada semi-quantitativamente, como indicado abaixo. A intensidade da imunomarcação foi classificada como leve a moderada (pontuação A) ou marcados (pontuação B), e da quantidade de hepatócitos positivos foi estimado pela aplicação de pontuações numéricas que foram definidas como:
Score A ou B 0 : – AKR1B10 imunocoloração em hepatócitos não detectado
a ou B Pontuação 1: – AKR1B10 hepatócitos positivos compreendem menos do que 10% do parênquima hepático
ScoreA ou B: 2 – AKR1B10 hepatócitos positivos compreendem entre 10 -30% do parênquima hepático
score a ou B 3: – AKR1B10 hepatócitos positivos compreendem mais de 30% do parênquima hepático
a pontuação AKR1B10 foi então obtida da soma das pontuações a e B e representa uma estimativa da quantidade e da intensidade da expressão da proteína AKR1B10 imunohistoquímica detectável no parênquima hepático (tabela 5).
resultados
padrão de expressão gênica separa claramente esteatohepatite de esteatose e controles
para rastrear mudanças na expressão gênica hepática distinguem esteatohepatite de esteatose, amostras de fígado de pacientes com doença hepática gordurosa bebidas alcoólicas e não-alcoólica obtida por cirurgia (Biobank) foram submetidos à análise baseada em chip de Illumina expressão do gene talão. Um total de 32 amostras Biobank foram investigados (Tabela 1). Para a análise dos dados microarray, casos ASH e Nash foram agrupadas em um grupo “esteatohepatite”. É importante salientar, que teve como objetivo investigar as alterações moleculares entre esteato-hepatite e esteatose apenas, e não entre as suas etiologias. Isto parece adequada, dado que ambas as doenças , Ash, bem como Nash, caracterizam-se por um espectro muito sobreposição de alterações morfológicas [18]. dados de expressão de gene foram posteriormente explorada por dois procedimentos de análise de dados, que consiste de (i) a identificação de genes expressos diferencialmente, utilizando limma e (ii) selecção . dos 1000 genes com maior variação em todo o conjunto de dados nas comparações de pares, foram identificados 4963 e 2543 genes de forma tão significativa (FDR 0,05). diferencialmente expressos entre esteato-hepatite e controles, e esteato-hepatite e esteatose, respectivamente os dois comparações, partilhada 1931 genes expressos diferencialmente. as diferenças entre os perfis das amostras normais e esteatose de expressão de genes são pequenos. A variação dentro dos grupos é elevado e, devido a isso, a potência do teste estatístico não é suficiente para identificar genes expressos diferencialmente significativamente entre os dois grupos. O número de genes diferencialmente expressos indica que esteatohepatite, quando comparada com o tecido normal do fígado, é caracterizado por mais profundas alterações moleculares que esteatose.
agrupamento hierárquico foi usada para visualizar os 1931 genes comuns em um mapa de calor (Figura 1A ). Com duas exceções, amostras esteatose e de controlo agrupados enquanto amostras esteatohepatite agrupadas em um ramo separado. Notavelmente, a combinação de NASH e cinzas não afectou o agrupamento hierárquico. Os genes comuns foram divididos em dois ramos, genes em esteatohepatite regulada para baixo em comparação com esteatose e controles (figura 1A, cluster 1) ou sobre-regulada em esteatohepatite em comparação com esteatose e controles (figura 1A, cluster 2).
A. genes diferencialmente expressos comuns foram utilizados para agrupamento supervisionado. B. agrupamento não supervisionado foi realizada com os 1.000 genes mais variáveis nos três grupos de amostras de fígado (esteatohepatite, vermelho; esteatose, laranja; controles, verde).
Os 1000 genes com maior variância foram utilizado para um agrupamento não supervisionada e uma visualização dos resultados de um mapa de calor (Figura 1B). Mais uma vez, com uma exceção, amostras esteatohepatite agrupadas em um ramo separado de amostras de esteatose e controles. Os genes altamente variantes caiu em duas classes, caracterizada por cima e para baixo-regulação na esteatohepatite em comparação com as amostras restantes. Tomados em conjunto, os dois tipos de análises de expressão de genes produziu assinaturas diferenciais, o que claramente separados esteatohepatite a partir de amostras de controlo e de esteatose.
ontologia Gene [19] análise foi realizada por um conjunto e o grupo 2 (tabela 6 e 7, respectivamente ) para identificar processos biológicos de doenças relevantes de genes diferencialmente expressos. Notavelmente, cluster 1 (regulado positivamente em controles e esteatose) foi caracterizado pelo metabolismo somente (de redução de oxidação, processos metabólicos, e biossíntese). Em contraste, várias classes GO no cluster 2 (upregulated em esteatohepatite) pertencia a processos moleculares, que são característicos de doenças malignas e progressão do tumor (adesão celular, matriz extracelular, movimento celular, sinalização integrina). Esta constatação sugere que a esteatohepatite é acompanhada por inteiramente diferentes programas de expressão do gene, quando comparado com os controles e esteatose. Notavelmente, os programas upregulated em esteatohepatite são característicos de doenças malignas.
validação qRT-PCR dos dados microarray
Um total de 87 amostras de fígado humano foram utilizados para a PCR- validação com base dos dados de matriz (tabela 8 e 9). Para selecionar de forma otimizada genes candidatos para a validação, foram empregadas três estratégias. Em primeiro lugar, foram identificados 265 genes comuns entre os 1931 genes diferencialmente expressos e os 1000 genes com maior variação. Este grupo de genes comuns foi analisada pelo software baseado na web (sistemas Ingenuity®) IPA®. IPA-Biomarker® foi aplicado para identificar candidatos a biomarcadores relevantes que possam ser úteis para distinguir entre esteato-hepatite e esteatose. Um total de 126 genes foram detectados após a filtração. Deste grupo foram seleccionados 13 genes para uma validação adicional, devido à sua alteração dobra significativa na análise de microarray. Em segundo lugar, GO termos dos dois grupos definidos foram sistematicamente analisados para potenciais alvos e três genes foram escolhidos. Em terceiro lugar, 17 genes expressos diferencialmente foram identificados por um valor p significativo e dobre mudança a partir dos dados de microarray. Por outro lado, cinco genes foram utilizados como controlos positivos e, adicionalmente, oito genes foram escolhidos devido à conhecida função do nível de proteína no esteatohepatite (tabela 8). Dentro do processo de seleção dos candidatos aplicáveis, focada principalmente em genes ligados ao metabolismo, estresse oxidativo, inflamação e sua relevância na doença hepática gordurosa. Em resumo, foram selecionados 46 genes para posterior validação por qRT-PCR.
HPRT1
foi usado como um gene de manutenção. A Figura 2 resume as alterações de dobragem da expressão dos genes seleccionados. As taxas de verificação de expressão diferencial de genes eram elevadas: As mudanças – conforme determinado pela qRT-PCR – de expressão diferencial de 39 genes em amostras de esteatohepatite Biobank foram significativas. Apenas três genes não foram significativamente desregulamentado. Em biópsias, 30 genes foram significativos, e doze genes não foram significativamente desregulamentado. As razões para a taxa de verificação inferior em biópsias pode ser que a maioria das amostras analisadas Biobank já havia sido utilizado para toda a experiência genoma de microarray (sem amostra coorte independente). Quatro genes (
DCDC2
,
EEF1A2
,
GSTM1
e
STMN2
) não pôde ser mensurado de forma confiável em qualquer uma das amostras.
A expressão de genes-alvo seleccionados foi determinada em amostras colhidas cirurgicamente (A) e em amostras de fígado, obtidos por biopsia (B). A mudança vezes foi calculada comparando os três grupos de amostras de fígado uns contra os outros.
Os genes
ACSL4
,
ATF3
,
CAT
,
GSTM5
e
NR0B2
foram descritos previamente na doença hepática gordurosa [20], [21] e serviu como controlos positivos para a validação quantitativa de genes candidatos em o presente estudo. O significativo aumento da regulação destes genes de controlo positivo foi validado em um ou ambos os grupos analisados (Tabela 8 e 9).
A maior descoberta apoia a noção de uma alteração notável de programas moleculares na esteatohepatite quando em comparação com amostras de controlo e de esteatose. Os genes mais impressionante desregulamentado a este respeito foram
AKR1B10
e
KRT23
(figura 3) uma vez que nossos dados mostraram uma superexpressão altamente significativa de ambos os genes em esteatohepatite.
HPRT1
foi escolhido para normalizar a expressão de genes nas amostras analisadas. Os níveis médios de expressão normalizados são dadas em log2.
A análise imunohistoquímica de expressão AKR1B10 em esteatose, esteato-hepatite e hepatite crônica C
fraca a moderada ou marcada citoplasmática e reactividade às vezes nuclear com anticorpos contra AKR1B10 foi detectada nos hepatócitos de quase todas as amostras de tecido do fígado de doentes com esteatose e esteato-hepatite de ambos, etiologia alcoólicas e não alcoólicas, bem como controlos com hepatite C crónica (figura 4 a-F, tabela 5). AKR1B10 expressão em casos com esteatohepatite conforme avaliado pela pontuação AKR1B10 imuno-histoquímica foi significativamente maior em comparação com a expressão AKR1B10 nos casos de esteatose e crónica de hepatite C (p = 0,003 e 0,006, respectivamente). No entanto, a expressão em tecidos do fígado AKR1B10 com esteatose ou hepatite C crónica não foi diferente (P = 0,351) (Tabela 5). AKR1B10 expressão foi também detectada em epitélio de alguns dos grandes ou médias canais biliares de tamanho (dados não mostrados).
Apenas as áreas representativas são mostrados. Case (A) da hepatite C crónica com um trato portal inflamado com infiltrados linfocíticos e hepatite interfase leve (veia central marcada por asterisco, H E seção manchado). (B) seção consecutiva da área mostrado em (A). Apenas um grupo de alguns hepatócitos centrolobulares exibem imuno AKR1B10 citoplasmática e nuclear (veia central marcada por asterisco). Case (C) de fígado gorduroso com esteatose macro e mediovacuolar marcada predominantemente de hepatócitos centrolobulares e médio zonal (veia central marcada por asterisco; H E seção manchado). (D) a secção consecutiva da área mostrada em (C) dos hepatócitos com degeneração gordurosa show de coloração da borda de citoplasma não ocupada por gordura, com AKR1B10 anticorpos (veia central marcada por asterisco). Case (E) de esteatohepatite em um fígado cirrótico com nódulo parênquima abuting um septo fibroso com a reação ductular suave. Muitos hepatócitos mostram degeneração gordurosa e alguns deles são caracterizados por, citoplasma alargada levemente manchado (hepatócitos incharam) e inclusões citoplasmáticas eosinofílica irregulares (corpos de Mallory-Denk, MDBs; inserir com maior exibição de ampliação inchou hepatócitos contendo MDBs, H seção E manchado ). (F) secção consecutiva da área mostrada em (E). Muitos dos (hepatócitos margem interna com shows de maior ampliação inchou com MDB) de tamanho normal, bem como os hepatócitos incharam mostrar imunocoloração citoplasmática moderada com anticorpos AKR1B10 enquanto os MDBs permanecem sem mácula.
Discussão
O presente estudo desvenda gene de expressão assinaturas esteatohepatite profundamente distinta da esteatose e fígado normal. Notavelmente, o tecido normal e esteatose agrupados de forma mais estreita quando comparada com as amostras esteatohepatite. Uma vez que o agrupamento hierárquico claramente demonstrado perfis de expressão comuns para amostras Nash e cinza, não foi feita qualquer outra distinção entre as diferentes etiologias. Além disso, ambas as etiologias manifestos com um espectro amplo de sobreposição das principais características histológicas (por exemplo centrilobular recursos com base de esteatose, inflamação e balonismo hepatocelular, bem como fibrose pericelular) [7], [18].
Os dados de expressão gênica sugere que esteatohepatite apresenta perfis moleculares que são característicos para os processos relevantes em tumores malignos e pode, portanto, refletem um estado pré-maligna da doença hepática já na fase precirrhotic (tabela 7.). Com efeito, uma evidência crescente suporta o facto de que pode progredir para esteato-hepatite HCC já na fase precirrhotic [22]. A obesidade e a diabetes não são apenas factores de risco estabelecido para o desenvolvimento de esteato-hepatite e cirrose, mas também têm sido implicados na formação do HCC. Outros fatores de risco para HCC em esteato-hepatite são a idade avançada e fibrose do tecido. Os mecanismos subjacentes a progressão da esteatohepatite para HCC ainda não estão claros, e as metas para o tratamento da esteatohepatite e HCC estão faltando. No entanto, as vias envolvidas na inflamação e resistência à insulina esteatohepatite promover sinalização, podem contribuir para o seu potencial carcinogénico.
A expressão do gene dos 46 genes selecionados foi validado por qRT-PCR para ambos os coortes de amostras testadas. Embora as amostras analisadas foram recolhidos por diferentes abordagens, e para as amostras de biópsia de amostras na hepatite C crónica foram utilizados como controlos (uma vez que a biópsia hepática percutânea não é realizada em indivíduos de fígado normal), muitos genes significativamente desregulados foram encontrados em todos os três grupos testados de amostras de fígado em ambas as coortes de amostras independentes (tabela 1 a 3). Apesar da diferença na percentagem de casos de cirrose entre as duas coortes (80% em amostras cirúrgicas, e 45% em biópsias),
AKR1B10
bem como
KRT23
foram significativamente elevada expresso em ambos coortes de amostra. Isso indica mecanismos patogênicos comuns em esteatohepatite bebidas alcoólicas e não-alcoólicas. Entre os genes diferencialmente expressos,
AKR1B10
e
KRT23
foram os mais proeminentes. AKR1B10 pertence às redutases aldose e foi descrito pela primeira vez em HCC humana [23], [24]. É uma enzima monomérica reduzindo aldeídos e cetonas para os álcoois correspondentes. A proteína é expressa no cancro cervical e cancro do pulmão de células não pequenas, em que é considerada como um potencial biomarcador de diagnóstico [25], [26], [27]. Várias descobertas também suportam a hipótese de que
AKR1B10
pode ser um marcador útil para diferenciação e proliferação de fígado, cólon, pulmão e cancro da mama [28], [29], [30]. Além disso, a proteína AKR1B10 desempenha um papel na desintoxicação de aldeídos tóxicos. Os radicais livres gerados por espécies reactivas de oxigénio oxidar os ácidos gordos da membrana lipídica resultante na produção de aldeídos reactivos, que são rapidamente reduzidos pelo AKR1B10 protegendo assim as células de toxification [31], [32]. Lipotoxicidade de ácido gordo e de metabolitos intermediários lipídicos pode ser um evento importante na progressão da doença do fígado gordo através da indução de morte hepatocelular. No presente estudo, relatamos a sobre-expressão significativa de
AKR1B10
em esteatohepatite que poderia ser causada pelo aumento da necessidade de inativar componentes tóxicos em hepatócitos. Isto sugere que o
AKR1B10
pode ser um marcador molecular que acompanha a evolução da esteatohepatite para HCC.
Os genes envolvidos na particionamento lipídico, mantendo ácidos graxos potencialmente lipotoxic armazenados nos triglicéridos neutros (TG) pode contrariar /proteger da lipotoxicidade como um factor potencialmente importante na progressão da esteatose hepática para esteato-hepatite [33]. Notavelmente, alguns dos genes que foram encontrados para ser desregulamentado incluídos enzimas envolvidas na FA homeostase como DGAT2 (responsáveis pela FA esterificação para TGs) e PNPLA3 (adiponutrin), recentemente identificada como um factor determinante para a patogênese e progressão de bebidas alcoólicas e não doença alcoólica do fígado gorduroso [34], [35].
Além disso, descrevemos a sobre-expressão muito significativa do
KRT23
em esteatohepatite em comparação com esteatose e fígado normal.
KRT23
foi detectada em diferentes tipos de cancro. Em microssatélites câncer de cólon estável,
KRT23
expressão é altamente aumentada, e isso pode ter uma função protectora contrariar a proliferação e sobrevivência das células [36]. Outro estudo identificou KRT23 como um antigénio associado HCC-soros no paciente [37].
KRT23
ainda não foi descrita a ser expressa no fígado ou doença hepática. O papel de KRT23 sob condições fisiológicas e na esteatohepatite é desconhecido. No entanto, as mutações de outros membros da família de multigenes de queratina, ou seja queratinas 8 e 18, foram encontrados para ser associada com a doença crónica de fígado humano.