Abstract

metástases ósseas fundo

Até 80% dos pacientes que morrem de carcinoma da próstata desenvolveram que são incuráveis. A castração é comumente usado para tratar cancro da próstata. Embora a doença responde inicialmente para andrógeno estratégias de bloqueio, que muitas vezes torna-se resistente à castração (CRPC para castração resistente do cancro da próstata). A maioria dos modelos murinos de lesões mistas derivadas de células de cancro da próstata sensível são androgénio. Assim, foi estabelecido um novo modelo de CRPC (receptor de andrógeno (AR) negativo) que causa lesões mistas no osso.

Métodos

PC3 e suas células PC3c clone de células novas derivados foram diretamente injetados tíbias de ratinhos machos SCID. O crescimento do tumor foi analisado por radiografia e histologia. efeitos diretos do meio condicionado de ambas as linhas celulares foram testados em osteoclastos, osteoblastos e osteócitos.

Resultados

Descobrimos que as células PC3c induzidas lesões mistas 10 semanas após a injeção intratibial.

Em

vitro

, PC3c meio condicionado foi capaz de estimular fosfatase tartarato ácido resistente (TRAP) osteoclastos -positivas. A osteoprotegerina (OPG) e da endotelina-1 (ET1) foram altamente expresso por PC3c enquanto dikkopf-1 expressão (DKK1) foi diminuída. Finalmente, PC3c altamente expresso óssea associada marcadores osteopontina (OPN), Runx2, fosfatase alcalina (ALP), sialoprote�a óssea (BSP) e produzido matriz mineralizada

em

vitro

em condições osteogênicas.

Conclusões

Nós estabelecemos uma nova linhagem celular CRPC como um sistema útil para a modelagem de câncer de próstata metastático humano, que apresenta o fenótipo misto de metástases ósseas que é comumente observados em pacientes com câncer de próstata com doença avançada. Este modelo vai ajudar a compreender os mecanismos independentes de andrógenos envolvidos na progressão do câncer de próstata nos ossos e fornece um modelo pré-clínico para testar os efeitos de novos tratamentos para metástases ósseas

Citation:. Fradet A, Sorel H, Depalle B, Serre CM, Farlay D, Turtoi A, et al. (2013) Um novo modelo murino de osteoblastos /osteolíticas As lesões de câncer de próstata andrógeno-Resistant Humano. PLoS ONE 8 (9): e75092. doi: 10.1371 /journal.pone.0075092

editor: Vladislav V. Glinskii, Universidade de Missouri-Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de junho de 2013; Aceito: 08 de agosto de 2013; Publicação: 19 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Fradet et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo CNRS (Edith Bonnelye), Inserm, da Universidade de Lyon, “Ligue Régionale contre le Cancer” (Isère) (EB) https://www.ligue-cancer.net/e “Association pour la Recherche sur les Tumeurs de la próstata (ARTP) “(Edith Bonnelye) https://www.artp.org/. Anais Fradet é apoiada pela Ligue Nationale contre le Cancer, https://www.ligue-cancer.net/Baptiste Depalle por uma subvenção da região Rhône Alpes “Cible” programa e Akeila Bellahcene é um pesquisador associado sênior do Fundo Nacional de Investigação Científica, Bélgica. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Edith Bonnelye está na lista de PLoS ONE editores acadêmicos. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O osso é o local mais frequente de metástases de carcinoma da próstata com metástases ósseas em até 80% de doença avançada [1]. terapias hormonais e cirúrgicos têm demonstrado efeitos benéficos somente para em estágio inicial da doença hormônio-responsivo. Com efeito, se a doença na maioria dos casos responde inicialmente, que muitas vezes progride e se tornar independente de androgénio. Nessa fase, os pacientes com doença avançada, muitas vezes exibir osteoblásticas ou lesões mistas no osso [2,3]. Os mecanismos pelos quais os cancros da próstata são induzidas para metastizar para o osso dependem de uma complexa interacção entre células de cancro da próstata e o microambiente do osso [4]. Crescimento de células cancerosas da próstata altera a remodelação óssea (formação e reabsorção) por fatores que vão afetar diretamente os osteoblastos (células formadoras de osso) e os osteoclastos (células de osso reabsorção) secretoras. RANKL (ligando do receptor do activador de NF-kB) estimula a diferenciação de osteoclastos e acção enquanto a osteoprotegerina (OPG) actua como um receptor de engodo para RANK (RANKL receptor). Portanto, o equilíbrio entre a RANKL e OPG, que podem ser ambos produzidos por células de cancro da próstata, é crítico para controlar a actividade dos osteoclastos e osteólise na metástase óssea [4-6]. Por outro lado, as moléculas pro-osteoblásticas também pode ser produzida por células de cancro da próstata. Na verdade, os primeiros estudos clínicos de alvejar especificamente osteoblastos em doentes com cancro da próstata metastático foi baseado em endotelina-1 (ET1), um factor mitogénico para os osteoblastos que podem promover o crescimento de osteoblastos em locais metastáticos [7,8]. Além disso, transformando β factor de crescimento (TGF-p), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) são abundantemente expressa pelas células de cancro da próstata e tem um efeito directo sobre a função dos osteoblastos [9,10]. A via de wingless (WNT) que está implicada na osteoblastogênese tem sido também implicada no desenvolvimento de metástases osteoblásticas em cancro da próstata [11]. A regulação do ligando Wnt-família Wnt1 em células de cancro da próstata e uma diminuição do soro do antagonista WNT dikkopf-1 expressão (DKK1) tem sido relatada em doentes com carcinoma da próstata metastático avançado e está associada a lesões osteoblásticas [12] . Finalmente células cancerosas da próstata que induzem metástases ósseas também expressam grande quantidade de fatores associados de osso como osteopontina (OPN), osteocalcina (OCN) ou osso sialoprote�a (BSP) secretada na matriz óssea e que contribuirá para promover suas propriedades osteomimicry [13].

a maioria das metástases ósseas mistos derivados de modelos do rato do cancro da próstata são andrógeno sensível e para que o assunto realmente não imitar a situação clínica. Nós descrevemos a caracterização de uma nova linha de células (ou seja PC3c) que induzem lesões ósseas mistos em animais que é derivado da PC3 AR-negativo independente de andrógeno humano linha celular, conhecida por induzir metástases ósseas osteolíticas puros.

Materiais e Métodos

declaração Ética

os ratos utilizados em nosso estudo foram tratados de acordo com as regras do Décret N ° 87-848 du 19/10/1987, Paris. O protocolo experimental foram revistos e aprovados pelo Comité Regional da Rhone-Alpes na Ética de Experimentação Animal (Lyon, França) (número de registo: 0121). Experimentos em animais foram rotineiramente inspecionadas pelo veterinário responsável para assegurar a conformidade contínua com os protocolos propostos. SCID, 6 semanas de idade, foram alojados em condições de barreira no fluxo laminar capuzes isolados. Os animais portadores de xenoenxertos de tumores foram cuidadosamente monitorizados para sinais estabelecidos de angústia e desconforto e foram humanamente eutanasiados.

cultura celular

linha de células PC3 foi obtido a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA , EUA). As células PC3c, uma linha de células de subcultura de PC3 foi isolada no nosso laboratório

In vitro

após cultura população de células única. Consequentemente a derivação espontânea das células, que finalmente obtida uma linha celular denominada subcultura PC3c que foi escolhido com base no seu fenótipo epitelial (Figura S1) [14,15]. As células VCaP cancro da próstata humanos dependentes de hormonas foram um presente generoso de Pr M Cecchini (Departamento de Investigação Clínica da Universidade de Berna, Berna, Suíça) e foi obtido a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). VCAP foram cultivadas em meio RPMI. células PC3 e PC3c foram rotineiramente cultivadas em mistura F12K nutriente e meio DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), respectivamente, suplementado com 10% (v /v) de soro fetal bovino (FBS; Perbio /Thermo Scientific; Rockford, IL, EUA ) e 1% (v /v) de penicilina /estreptomicina (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. PC3 e PC3c também foram cultivadas em condições osteogénicas para três semanas, em meio de osteoblastos suplementado com 50 ug /ml de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça). Foi adicionado dez mM β-glicerofosfato de sódio (Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça) durante 1 semana no final da cultura. PC3 e PC3c eram continuamente (dia 1 ao dia 21) expostos a condições osteogênicas. Para a visualização de mineralização, os poços foram fixadas e coradas com Von Kossa e para ALP [16].

Os estudos em animais

Para experiências de xenoenxerto de tumor intra-ósseo (Charles River Laboratories, Wilmington, MA , EUA), de um pequeno orifício foi perfurado com uma agulha estéril de calibre 26 através da tíbia direita, com a flexão do joelho em ratinhos SCID com 6 a 8 semanas de idade anestesiados. Usando uma agulha nova estéril equipado com um 50-pi estéril seringa Hamilton (Hamilton Co .; Bonaduz, GR, Suiça), uma suspensão de uma única célula (6×10

5 em 15 ul de PBS) ou de células PC3 PC3c foi cuidadosamente injectado na cavidade de medula óssea. Desde a semana 2 depois da inoculação das células tumorais, as radiografias dos ratinhos anestesiados foram semanal feita com o uso de filmes de MIN-R2000 (Kodak, Rochester, NY, EUA) em um sistema de raios-X MX-20 armário (Faxitron X-ray Corp., Tucson , AZ, EUA). Os animais foram sacrificados após 6 e 10 semanas de camundongos injetados por células PC3 e PC3c respectivamente. tomografia Microcomputed análises foram realizadas utilizando um scanner de micro-CT Skyscan 1174 (Skyscan; Kontich, Bélgica). O tubo de raios-X foi definido para uma voltagem de 50 kV e uma corrente de 800 uA. Um filtro de alumínio 0,5 mm foi utilizada para reduzir artefatos de endurecimento do feixe. As amostras foram varridas em etanol a 70% com um tamanho de voxel de 20 um. Para cada amostra, 265 imagens de seção foram reconstruídos com software NRecon (versão 1.6.1.8, Skyscan). A modelação tridimensional e análise de BV (volume do osso) /TV (volume total) razão (percentual de tecido ósseo) foram obtidos com o CTAN (versão 1.9, Skyscan) e CTVol software (, Skyscan versão 2.0). Os ossos dissecados foram então processadas para análise histológica e histomorfométrica.

As injecções subcutâneas de células PC3c (10

6 em 100 ul de PBS) também foram realizadas em 6 a SCID 8 semanas de idade. Os animais foram sacrificados após 12 semanas e os tumores foram fixadas e incluídas em parafina.

histomorfometria do osso e histologia

Tibia de animais foram fixadas, descalcificadas com EDTA a 15% /0,4% de PFA e incorporado em parafina. Cinco mm secções foram coradas com Tricrômico de Goldner e passou para as análises histomorfométrica para calcular a TB (carga tumoral) /STV (Tecidos Moles Volume) rácio (percentagem do tecido tumoral). O

in situ detecção

dos osteoclastos foi realizada em secções de tecido ósseo metastático utilizando a fosfatase resistente ao tartarato ácido (TRAP) ensaio kit de actividade (Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça).

osteoclastogênese ensaio

células da medula óssea primária foram obtidos após a tíbia eo fêmur medula lavagem de camundongos machos OF1 6 semanas de idade. As células foram então cultivadas durante 7 dias, em meio de diferenciação: a-MEM contendo 10% de soro fetal de vitelo (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), 20 ng /mL de M-CSF (R D Systems, Minneapolis, MN , EUA) e 200 ng /mL de RANK-L solúvel recombinante na presença ou na ausência de meio condicionado a partir de PC3 e extraída PC3c (25 ug de proteínas de cada condição) [17]. Médio foi, em primeiro lugar, trocado a cada dois dias, em seguida, a partir do dia 4 todos os dias. Após 7 dias, os osteoclastos maduros multinucleadas (COs) foram obtidas e coradas para a actividade de TRAP (Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça), seguindo as instruções do fabricante. células TRAP-positivas multinucleadas contendo três ou mais núcleos foram contados como anticoncepcionais orais.

osteoblastogênese ensaio

Calvaria de 3 dias de idade OF-1 ratos foram dissecados, em seguida, as células foram enzimaticamente isolados por digestão sequencial com colagenase, tal como descrito anteriormente [18,19]. As células obtidas a partir do último quatro das cinco fases de digestão (populações II-V) foram plaqueadas em placas de 24 poços a 2×10

4 células /poço. Após 24 horas de incubação, o meio incluindo meio α-MEM contendo 10% de soro fetal de bovino (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) foi mudado e suplementado com 50 ug /ml de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça) e com ou sem meio condicionado (25 ug de proteínas de cada condição) extraído de PC3 e PC3c. O meio foi mudado a cada dois dias durante 15 dias. adicionou-se 10 mM de glicerof osf ato de sódio-β (Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça) durante 1 semana no final da cultura. No dia 15, quando nódulos mineralizados ósseas foram formadas, as células foram então fixadas e coradas com Von Kossa para quantificação. ALP + e nódulos mineralizados ósseas foram então contadas em uma grade [16]. Os resultados são representados como a média do número de nódulos ± DP de três poços para controlos e cada condição (PC3, PC3c) e foram representativos de duas experiências independentes. linha de células osteócito MLO-Y4 foram um presente generoso de Pr L Bonewald (Faculdade de Odontologia da Universidade de Missouri, Kansas City, MO, EUA) e foram cultivadas como descrito anteriormente [20].

Imunocitoqu�ica

tumores PC3c e tíbia metastático foram fixados e embebidos em parafina. Cinco mm seções foram submetidos à imuno-histoquímica usando coelho policlonais anticorpo osteopontina anti humano /rato (Bachem, Bubendorf, Suíça), anticorpo anti humano endotelina-1 (Abbiotec, San Diego, CA, EUA) e anticorpo anti OPG humana (Abbiotec, San Diego, CA, EUA). anticorpo BSP foi uma oferta generosa do Dr. L Malaval (Universidade de J Monnet, St Etienne, França). Os cortes foram desparafinados em metilcicloexano, hidratado, em seguida, tratado com um reagente de bloqueio de peroxidase (Dako, Glostrup, Dinamarca). As secções foram incubadas com soro de vitelo normal durante 1 hora e incubada durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários (diluição: 1/100). As secções foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com HRP de burro anti-coelho (Amersham /GE Healthcare; Chalfont St Giles, Reino Unido) (diluição 1/300) durante 1 hora. Após a lavagem, as secções foram revelados por 3,3′-diaminobenzidina (Dako, Glostrup, Dinamarca). A contracoloração foi realizada com hematoxilina de Mayer (Merck, Whitehouse Station, NJ, EUA).

em tempo real de RT-PCR

O ARN total foi extraído com o reagente de Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA ) de PC3, PC3c, OBS, COs e células MLO-Y4. As amostras de ARN total (1 ug) foram sujeitos a transcrição reversa usando hexâmero aleatório (Promega, Madison, WI, EUA) e o kit de síntese de primeira cadeia de Superscript

TM II (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Em tempo real de RT-PCR foi realizada num LightCycler Módulo Roche (Roche, Penzberg, Alemanha) com os iniciadores específicos para o homem e ratinho (ver Tabelas S1 e S2). Em tempo real de RT-PCR foi realizada utilizando SYBR Green (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante, com um passo inicial de 10 min a 95 ° C seguido de 40 ciclos de 20 seg a 95 ° C, 10 seg a Tm (ver Tabelas S1 e S2) e 10 seg a 72 ° C. Verificou-se que um único pico foi obtido para cada produto usando o software LightCycler Roche. Amplimeros foram todos normalizados para valores L32 correspondente. A análise dos dados foi realizada usando o método comparativo CT: em tempo real cada replicar genes médios CT foi normalizada para a CT média de L32 subtraindo a média de CT L32 de cada repetição para se obter o ΔCT. Os resultados são expressos como log

-2 __CT com ΔΔCT equivalente ao ΔCT dos genes em PC3, PC3c ou tratados OBS, COs e células MLO-Y4 subtraindo à ΔCT do controle endógeno (não-tratados OBs, a OCS e células MLO-Y4 respectivamente).

Electron microscopia

células PC3c foram cultivadas em lamelas de vidro, em seguida, fixados para 1h em glutaraldeído 2% em 0,1 M de tampão de cacodilato de sódio a pH 7 .4. Após três lavagens em 0,2 M de sacarose em 0,1 M de tampão de cacodilato de sódio, as células foram fixadas posteriormente em 1% tétroxyde de ósmio em 0,15 M tampão de cacodilato, desidratadas em etanol graduado, em seguida, incorporado em Epon. Secções ultrafinas foram contrastadas com acetato de uranilo e citrato de chumbo, o examinada sob um 1200 EX JEOL microscópio eletrônico (Jeol, Tóquio, Japão).

Fourier Transform InfraRed microespectroscopia (FTIRM)

secções não descalcificadas ( 2¼m de espessura) da tíbia embutido no MMA foram cortadas longitudinalmente com um Polycut micrótomo (Reichert-Jung, Leica, Alemanha), e armazenado entre 2 lâminas de vidro. FTIRM foi realizada com um PerkinElmer GXII Auto-imagem Microscópio (Norwalk, CT, EUA), equipado com um resfriado azoto líquido banda larga detector Mercúrio Cádmio Telluride (7800-400 cm

-1). medições de infravermelhos foram realizados em matriz de osso (osso cortical) em torno do tumor e sobre o próprio tumor. medição por infravermelho do osso cortical de ratos sham também foi coletada. Os espectros de IR foram coletados em modo de transmissão, a 4 cm

-1 de resolução espacial, e 40 mm X 40 mm de resolução espacial. Contribuição de ar e MMA foram subtraídos ao espectro inicial. correção automática de linha de base foi realizada em cada espectro de IR com o software Spectrum (PerkinElmer, Inc.).

A análise estatística

Os dados foram expressos como média +/- SD, e analisados ​​estatisticamente por uma análise de forma de variância (ANOVA), seguido de post hoc testes t ou teste t de Student para avaliar as diferenças entre os grupos para

in vitro Comprar e

in vivo

estudos. A significância estatística foi considerada como p . 0,05

Resultados

Expressão de fatores pró-osteoblásticas por células PC3c

A partir da próstata linha celular de cancro PC3 andrógeno resistente humano, obtivemos depois cultura população única célula

in vitro

uma nova linhagem celular subcultura células PC3c nomeados que foi escolhido com base no seu fenótipo epitelial (Figura S1). Como esperado e de forma semelhante às células PC3 parentais, AR não poderia ser detectado por PCR em tempo real em PC3c ao mesmo tempo que foi expresso na linha celular dependente de hormona VCaP utilizado como controlo positivo (Figura 1A). Por outro lado, os marcadores da próstata P504S (alfa methylacyl-CoA-racemase (AMACR)) e a fosfatase ácida prostática (PAP) foram expressos em ambas as linhas celulares que confirmam a origem da próstata das células (Figura 1B) [21]

detecção por PCR em tempo real da expressão de mRNA AR no PC3, PC3c e VCaP células cancerosas linhas (a), AMACR, PAP (B) e DKK1, ET-1, FGF9, Noggin, OPN, OPG, Runx2 e a expressão do mRNA de TGFp (C e D) em PC3 e PC3c células cancerosas linhas. expressão de genes foi avaliada por PCR em tempo real em amostras em triplicado e normalizadas contra aquela do gene da proteína ribossómica L32 * p 0,05; ** P 0,001, *** p . 0,0001

A caracterização por PCR em tempo real de células PC3c indicou que ET1 e OPG, dois fatores que têm sido implicados na patogênese da osteoesclerótico metástases ósseas de cancro da próstata são sobre-expressos em comparação com a linha celular parental PC3 (Figura 1C-D), enquanto que outros factores tais como factor de crescimento de fibroblastos 9 (FGF9) e TGF-p são expressos de forma semelhante em ambas as linhas celulares [8,22,23]. Por outro lado, a expressão de DKK1 e Noggin, dois inibidores de osteoblastos (respectivamente inibidores WNTs e proteína morfogenética do osso (BMP)), é diminuída em comparação PC3c PC3 (Figura 1 C-D) [24,25]. Além disso, de forma semelhante ao PC3c células PC3 factores conhecidos expressos a ser implicado em osteomimicry cancro da próstata, tais como OPN e Runx2. Todos juntos, estes resultados sugerem que as células PC3c pode potencialmente induzir lesões osteoblásticas quando comparado com células PC3 que são conhecidos por apresentar predominantemente lesões ósseas no osso.

PC3c células induzir /lesões ósseas osteolíticas osteoblásticas mistos

a fim de testar a propriedade de PC3c para induzir lesões ósseas, injecções intra-tibiais foram realizadas em ratinhos SCID machos. Dez semanas após a inoculação de células tumorais, a análise radiográfica revelou que os animais portadores de tumores PC3c tiveram lesões ósseas que incluíam componentes osteolíticas e osteoblásticas (Figura 2?), Enquanto lesões ósseas puras foram observados em tumores PC3 rolamento animais após 6 semanas (Figura 2E). A capacidade de PC3 e PC3c para induzir osteolíticas puro e lesões mistas, respectivamente, foi confirmada utilizando a reconstrução 3D micro-CT (Figura 2F-G e JK) (volume do osso, BV /TV, Tabela 1), a histologia (Figura 2H e L ) e histomorfométrica de tíbias (carga tumoral esquelético, TB /STV; Tabela 1). Como esperado foram observadas sem lesões ósseas após a injecção de PBS (animais sham) (Figura 2A-D, Tabela 1). Por imuno-histoquímica, confirmamos,

in vivo

, que ET-1 e OPG foram altamente expresso em tumores PC3c (Figura S1, B, D), quando comparado com PC3 (Figura S2, A, C).

células PC3 e PC3c (a) foram inoculados em ratinhos SCID machos; 10 semanas após a inoculação, radiografia revelou lesões osteolíticas puros em ratinhos injectados com células PC3 (n = 6) (E) e lesões mistas em ratinhos injectados com células PC3c (n = 8) (I) em comparação com ratinhos injectados com PBS (n = 10) (A) (ver * (lise) e setas brancas (formação)). (B, C-F, G-J, K) tridimensionais reconstruções micro-CT de tíbias e (D, H, L) histologia após tricromo de Goldner confirmou os resultados de radiografia. T: do tumor; NB:. Osso novo

BV /TV (%)

TB /STV (%)

Sham (n = 10) 22,4 +/- 2,90PC3 (n = 6) 3,6 +/- 4,1 *** 72,6 +/- 6,6 *** PC3c (n = 8) 39,5 +/- 3,0 *

$ 36,6 + /- 4,5 ***

$ Tabela 1. a análise histomorfométrica da tíbia com metástases induzidas pela injeção de células PC3 e PC3c

BV /TV: volume ósseo /volume total.. TB /STV: /volume dos tecidos moles a carga tumoral. Sham foram realizados como controlo.

n

é o número de pernas com metástases ósseas. * P 0,05; *** P 0,001 comparado com Sham;

$ P 0,001 comparado com PC3. CSV Baixar CSV

remodelação óssea estimulação por células PC3c

Tendo em conta estes dados, o próximo perguntado se PC3c poderia alterar o osso células reabsorção, os osteoclastos (CO) eo células formadoras de osso, os osteoblastos (OBs) . Tratamento de rato primária células de medula óssea com RANKL, factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF) e com o meio condicionado de PC3c estimulou mais a formação de fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP) OC multinucleadas -positivos em comparação com a observada com o meio condicionado de células PC3 e células não tratadas (TC) (Figura 3A). Por outro lado, o tratamento de células de calvária de rato primários em cultura em condições osteogénicas com o meio condicionado de PC3c teve efeito inibidor sobre a diferenciação menos de OB de meio condicionado de células PC3 em comparação com células não tratadas (TC) (Figura 3B). Com efeito, um elevado número de obstetras foi visualizada usando a imunocoloração do OPN

In vivo

(Figura 4A a-b). Curiosamente, PC3 meio condicionado estimulou a OPG e RANKL expressão pelo Obs primária enquanto que o meio condicionado PC3c diminuição da produção de OPG que conduz a um aumento mais forte de RANKL /OPG pelo Obs tratadas com meio condicionado PC3c em comparação com a de células PC3 (Figura 3C). Consistente com estes

in vitro

resultados, coloração TRAP de cortes tibiais de pernas metastáticos de animais portadores PC3c mostrou elevado número de OC multinucleadas TRAP-positivas, em comparação com o observado em PC3 e animais Sham (Figura S3). Finalmente, PCR semi-quantitativa realizada na linha de células osteócito, MLO-Y4, permitiu-nos mostrar que sclerostin (SOST) e matriz de dentina fosfoproteína ácida 1 (DMP1) expressão foi estimulada após 24h de tratamento com PC3 e médio PC3c condicionado, respectivamente, enquanto OPG e RANKL expressão não foi afectada (Figura 3D).

células de medula óssea de rato primária (a) foram cultivadas na presença de RANKL e M-CSF e tratada ou não (Ct) com meio condicionado obtido a partir de PC3 e células PC3c. Mais COs (seta branca) foram formadas em culturas tratadas com meio condicionado PC3c em comparação com culturas tratadas com meio condicionado e PC3 Ct (ANOVA, p 0,0001). (B) culturas de células calvárias de rato Primária foram tratados a partir do dia 21/01 com meio condicionado obtido a partir PC3 e celular PC3c. nódulos osso mineralizado estavam presentes e visualizados por coloração von Kossa no dia 21 (ver mineral, setas brancas pretas). formação de nódulos osso mineralizado foi diminuída quando as células primárias foram tratadas com meio condicionado a partir de qualquer uma das células PC3 /PC3c (em comparação com células não-tratadas (Ct)); a diminuição foi menos quando se utilizou meio de células PC3c condicionado (em comparação com PC3) (ANOVA, p 0,001 versus Ct e versus PC3). (C) media PC3 condicionado estimulou a expressão de OPG e RANKL em OBs primários em comparação com os não-tratados (Ct), enquanto a mídia PC3c condicionado só inibe a expressão de OPG comparação com Ct levando a uma maior proporção RANKL /OPG em condições PC3c. (D) Detecção por PCR em tempo real de SOST, DMP1, OPG e expressão de mRNA em células RANKL MLO-Y4 tratados com PC3 e médio PC3c condicionado. Os resultados são representados como a média do número de OC ± SD e OB nódulos ± DP de três poços para controlos e cada condição e são representativos de duas experiências independentes. expressão de genes foi avaliada por PCR em tempo real em amostras em triplicado e normalizadas contra aquela do gene da proteína ribossómica L32 * p 0,05; ** P 0,001, *** p . 0,0001

(A) imunodetecção de OPN em OB em metástases ósseas induzidas por células PC3c (VER OBS A e B ampliações de a; consulte setas pretas) (a) e em células de tumores (B um). À semelhança do OPN, expressão BSP é detectada em tumores de células

em

vivo

(B, b). (C) Similarmente a células de calvária de rato primários, PC3 e PC3c foram cultivadas em condições osteogénicas para 21 dias. ALP (A, C) e coloração de von Kossa (b, d) mostram expressão elevada de ALP (c) e mineralização (seta branca) (d) em células PC3c enquanto que nenhuma expressão de ALP (uma) e mineralização foram detectados em células PC3 ( b). (D) de detecção por PCR em tempo real de OPN, ALP e a expressão de ARNm em PC3c OCN e células PC3 cultivadas em condições osteogénicas para 21 dias. A expressão de genes foi avaliada por PCR em tempo real em amostras em triplicado e normalizadas contra a do gene da proteína ribossómica L32 ** p 0,001. Barra = 200 um T: do tumor; OB: osteoblastos; NB:. Osso novo

PC3c células induzir reações osteoblásticas robustos sobre condições osteogênicas

Como as células PC3c induzida nova formação óssea

in vivo

, nós próxima testaram se eles poderia produzir marcadores Obs. Após imunocoloração de secções de tecido com metástases ósseas, OPN e BSP foram encontrados expressos em células PC3c

in situ

(Figura 4B a e b). Além disso, após 3 semanas de cultura,

In vitro

, mediante condições osteogénicas incluindo ácido ascórbico e β-glicerofosfato (Fig 4C b e d), as células foram PC3c revelou ser a fosfatase alcalina (ALP) -positivo (Fig 4CC ) e eram capazes de formar uma matriz calcificada positivo para a coloração de von Kossa (Fig 4C d), enquanto PC3 foram ALP-negativo e não induzir a mineralização da matriz (Figura 4C a e b). Expressão de ALP após tratamento com ácido ascórbico foi confirmada em células PC3c por PCR em tempo real (Figura 4D). Da mesma forma, a OPN foi altamente expressa em PC3c comparação com células PC3 enquanto OCN foi expressa por ambas as linhas de células sob estas condições experimentais (Figura 4D), sugerindo propriedades alta osteomimicry de PC3c em comparação com células PC3. Finalmente, Fourier Transform estudo infravermelho microespectroscopia (FTIRM) em tumores obtidos após a injecção subcutânea de células PC3c revelou a presença de amidas I (principalmente C = O alongamento) e II (principalmente NH flexão) e III (principalmente CN alongamento e NH de flexão) grupos de proteínas (Figura S4, consulte I e II linha vermelha), que geralmente corresponde à matriz orgânica (90% de colágeno tipo I) no osso (Figura S4, veja a linha azul e preto). Sem fosfato ou vibrações moleculares de carbonato foram encontradas, indicando a ausência de mineral dentro do tumor PC3c

in vivo

(Figura S4). Por outro lado, a nova matriz óssea obtidas a partir de murganhos injectados com células tíbia PC3c mostrou a presença de minerais (Figura S4). Paralelamente a estes resultados, foi encontrada grande quantidade de colágeno tipo I deve ser expressa por PC3c quando comparado com células PC3 por PCR em tempo real

in vitro

(Figura 5A). Além disso, as células PC3c foram mostrados cercado por típico tipo I fibras de colágeno

in situ

como julgado por microscopia eletrônica (Figura 5B ver setas e maior ampliação). Todos juntos, estes dados sugerem propriedades osteomimicry mais elevados para PC3c em comparação com células PC3, explicando, assim, pelo menos em parte, a sua capacidade para induzir /lesões ósseas osteolíticas osteoblásticas mistos.

(A) Detecção por PCR em tempo real de colagénio do tipo I a expressão de ARNm em células PC3 PC3c e cultivadas em condições normais. A expressão de genes foi avaliada por PCR em tempo real em amostras em triplicado e normalizadas contra a do gene da proteína ribossómica L32 * p 0,05. (B) Visualização de colágeno tipo I em células cultivadas em PC3c lamela de vidro por microscopia eletrônica (ver setas pretas).

Discussão

Neste estudo, nós estabelecemos e caracterizada uma nova linha independente de androgénios de células de cancro da próstata (PC3c) que dá rapidamente lesões ósseas misturadas em ratinhos SCID machos, 10 semanas após a injecção intra-tibial células tumorais. Este modelo pode ser útil para estudar os mecanismos celulares e moleculares que diferem entre carcinomas da próstata andrógeno-dependente e independente de androgénios, quando metastizar para o osso. No câncer de próstata, as estratégias de bloqueio androgênico são normalmente utilizados para tratar metástases ósseas osteoblásticas. No entanto, as respostas a estas terapias são muitas vezes breve devido a modificações pós-traductional ou mutações de AR que reduzem ligando de ligação e, inevitavelmente, levar a CRPC [26,27]. O papel da via AR na progressão osteoblástica de câncer de próstata é mal compreendido porque os modelos disponíveis de lesões osteoblásticas mistas e puras (C4-2B, PCa2B, VCaP) são principalmente de andrógeno responsivo como [28,29]. Consequentemente, acredita-se que uma via AR activa a ser implicada na progressão do cancro da próstata osteoblástica. No entanto, no tocante a nosso modelo PC3c, esta hipótese não ocorre tanto como linhas celulares PC3 e celulares PC3c linhas não expressam AR. Por outro lado, os modelos de AR negativos comumente usadas como células PC3 e DU145 que derivados de pacientes com lesões induzidas CRPC puro osteolíticas e não reproduzem o que se observa clínica em [30,31]. Em seguida, a fim de satisfazer a necessidade de modelos clinicamente relevantes de lesões ósseas associadas a cancro da próstata, os modelos mais recentes independente de hormonas têm sido desenvolvidos como MDA CaP 118 e Ace-1 que de forma semelhante ao modelo PC3c não expressam AR e induzir misturado lesões [22,32]. No entanto, a osteogénese que foi induzida por FGF-9 no modelo MDA CaP 118 não foi implicado na resposta induzida por osteoblástica PC3c como FGF-9 expressão não foi estatisticamente significativamente modulada entre células PC3 e PC3c.

Curiosamente, quando comparado com PC3, células PC3c altamente expresso ET-1, um factor mitogénico para OB [33,34].