Abstract

Objectivo

O Proteínas Associadas Morte Quinase 1 (

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) gene tem sido frequentemente investigada em câncer cervical (CC). O objetivo do presente estudo foi realizar uma revisão sistemática e uma meta-análise para avaliar

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metilação do promotor como um marcador epigenético para o risco de CC.

Métodos

Uma busca sistemática da literatura foi realizada. Foi utilizado o pacote de software Cochrane Review Manager 5.2. Os de efeitos fixos ou de efeitos aleatórios modelos, de acordo com a heterogeneidade entre os estudos, foram utilizados para calcular odds ratio (OR) e 95% intervalos de confiança (IC). Além disso, as análises de subgrupo foram realizadas por tipo histológico, os ensaios utilizados para avaliar

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metilação do promotor e do controle da fonte de amostra.

Resultados

Um total de 20 artigos, publicados entre 2001 e 2014, em 1929 amostras, foram incluídos na meta-análise.

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metilação do promotor foi associado com um risco aumentado de CC com base no modelo de efeitos aleatórios (OR: 21,20; IC95% = 11,14-40,35). Omitindo o estudo mais heterogênea, o estudo entre heterogeneidade diminuiu ea associação aumentado (OR: 24,13; IC95% = 15,83-36,78). A associação também foi confirmado em todos os subgrupos analisa.

Conclusões

A forte associação significativa entre

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metilação do promotor e CC foi mostrado e confirmado de forma independente por tipo histológico do tumor, método utilizado para avaliar a metilação e a fonte de amostras de controlo. marcadores de metilação podem ter valor na detecção precoce das lesões precursoras CC, oferecer garantias adicionais de segurança para as mulheres que são candidatos para telas menos frequentes, e prever os resultados de mulheres infectadas com o vírus do papiloma humano

Citation:. Agodi A, Barchitta M, Quattrocchi a, Maugeri a, Vinciguerra M (2015)

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metilação do promotor e cervical Cancer Risk: uma revisão sistemática e uma meta-análise. PLoS ONE 10 (8): e0135078. doi: 10.1371 /journal.pone.0135078

editor: Raffaele A. Calogero, Universidade de Torino, Itália

Recebido: 26 de fevereiro de 2015; Aceito: 17 de julho de 2015; Publicação: 12 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Agodi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical (CC) é o segundo tipo de câncer mais comum em mulheres em todo o mundo [1, 2]. A identificação e tratamento de mulheres com neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) ou carcinoma

in situ

(CIS), as lesões precursoras do CC invasiva, representam um componente importante da prevenção do CC [3]. CC surge por alterações morfológicas distintas do epitélio normal e progride para o carcinoma através de uma série de lesões pré-invasivas bem definidas. Histologicamente, CC apresenta tanto como carcinoma de células escamosas (SCC) ou adenocarcinoma (AC) [4], com predomínio SCC. A persistência do vírus do papiloma humano (HPV) é o principal factor etiológico no desenvolvimento de CC e as lesões precursoras [5, 6]. No entanto, apenas uma pequena fracção de lesões CIN infectadas pelo HPV progride ao cancro invasivo, deste modo, outros factores do hospedeiro desempenhar um papel na carcinogénese cervical [2, 7].

Entre as alterações moleculares putativos envolvidos no processo neoplásico , metilação aberrante pode ser um evento importante na oncogénese [8]. Uma recente meta-análise confirmou que os níveis de metilação do DNA globais, em tecidos de vários tipos de câncer, foram significativamente menores nos pacientes com câncer do que nos controles saudáveis ​​[9]. Aproximadamente 60% de todos os promotores humanos estão associadas com ilhas de CpG. No genoma das células não transformadas, ~ 90% de todos os promotores são não metilado [10]. Por outro lado, no cancro, a metilação de CpG regiões do promotor do gene está associada com inadequado transcricional repressão e inactivação de genes. Significativamente, muitos dos genes inactivados são os genes supressores de tumor [11,12] e a inibição destes genes por metilação está implicado na iniciação do cancro, o desenvolvimento, progressão e [13]. Embora seja difícil estabelecer se tais alterações epigenéticas são causal ou consequencial de câncer, há evidências de que eles podem ocorrer no início do processo neoplásico [14]. Recentemente, o papel dos mecanismos epigenéticos de inativação do gene foi examinado na oncogênese cervical [13,15-19].

Entre os genes envolvidos, a proteína associada-Death Quinase 1 (

DAPK1

) gene tem sido frequentemente investigada em CC. DAPK1 é a novel 160 kDa dependente de calmodulina serina /treonina-quinase a funcionar como um mediador de apoptose positivo, enquanto as ligações de apoptose para o desenvolvimento, progressão e metástase do cancro humano [20]. O péptido de cauda rico serina-DAPK1 C-terminal, que é conservada nas proteínas de morte contendo domínios, desempenha um papel regulador negativo na inibição da DAPK1, ao passo que a remoção desta região aumenta a actividade de morte [21]. Hipermetilação do

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foi citado em vários tipos de cancros, incluindo cólon [22], cabeça e pescoço [23], bexiga urinária [24], pulmão [25-27], linfoma de células B [28] e dos ovários [29]. Além disso, tem sido associada com as fases avançadas de desenvolvimento de tumores [30] e um mau prognóstico no carcinoma do pulmão de células não pequenas [31]. Desde DAPK1 é um mediador positivo de apoptose, o silenciamento de

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desativado a apoptose mediada por DAPK e metástase poderia, então, pronta nas células cancerosas [32]. Além disso, as células falta

expressão DAPK1

através de metilação do promotor tornou-se mais invasivo e metastático [33].

Além das implicações funcionais de inactivação do gene no desenvolvimento do tumor, genes que são frequentemente de forma aberrante em metilado tumores específicos têm sido utilizados como alvos moleculares para a detecção de células neoplásicas em fluidos corporais proporcionar alvos adicionais para o diagnóstico precoce não-invasiva e para a monitorização do cancro [34-36]. Assim, o desenvolvimento de um painel de marcadores de metilação podem ter valor na detecção precoce das lesões precursoras CC, oferecer garantias adicionais de segurança para as mulheres que são candidatos para telas menos frequentes, e prever os resultados de mulheres infectadas com HPV [34].

o objetivo do presente estudo foi realizar uma revisão sistemática e uma meta-análise, a fim de resumir os estudos publicados atuais e avaliar

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metilação do promotor como um marcador epigenético para o risco de CC.

Métodos

estratégia de procura e selecção

em primeiro lugar, uma pesquisa sistemática da literatura na base de dados Medline, usando PubMed, foi realizada para estudos epidemiológicos, publicados antes de Julho de 2014, que investigam o Associação entre a metilação do promotor do gene e o risco de CC. pesquisa bibliográfica foi realizada independentemente por dois autores usando as palavras-chave “promotor metilação” e “neoplasia cervical”. As buscas foram limitadas a estudos escritos em Inglês; resumos e trabalhos não publicados não foram incluídos. Além disso, as listas de referências de artigos selecionados foram marcados para pesquisar outros estudos relevantes. O objetivo da primeira seleção foi identificar estudos que investigaram a associação entre a metilação do promotor de qualquer gene eo risco CC; não há estudos foram excluídos a priori para a fraqueza do design ou qualidade dos dados. Assim, foram selecionados artigos somente se satisfeitas as seguintes critérios: i) caso-controle ou estudo de coorte projetos, e ii) estudos que avaliaram a associação de metilação do promotor do gene e CC. Posteriormente, uma vez que

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gene foi identificado como o gene mais comum analisada e estudada, uma meta-análise de artigos que relatam a associação entre o

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metilação do promotor e CC do risco foi realizada. Assim, para inclusão na análise quantitativa, os estudos tiveram que seguir os seguintes critérios: i) estudos que avaliaram a associação entre o

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metilação e CC e ii) forneceram dados sobre a freqüência de

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metilação no câncer e nos grupos de controle. Além disso, os critérios de exclusão foram os seguintes: i) estudos que não usaram células esfoliadas, biópsias do colo do útero ou urinas como amostras e ii) em que controlam ou grupos de câncer incluídos indivíduos com vários tipos de lesões pré-cancerosas. Os itens de informação preferidos para revisões sistemáticas e meta-análise (PRISMA) orientações foram seguidas [37] (S1 e S2 Arquivos).

Extração de dados e qualidade de avaliação

Dois dos autores revisados ​​independentemente todos os estudos elegíveis e abstraídas as seguintes informações em um formato padrão: sobrenome do primeiro autor, ano de publicação, país onde o estudo foi realizado, tipo de amostra, os métodos experimentais para avaliar

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metilação e número de casos e controla assuntos.

Análise estatística

Todos os dados foram analisados ​​utilizando o software Review Manager 5.2 fornecido pela Colaboração Cochrane (https://ims.cochrane.org/revman).

parcelas florestais foram geradas para ilustrar os tamanhos de efeito específico do estudo, juntamente com um CI de 95%. Os modelos de efeitos fixos ou aleatórios de efeitos, de acordo com a heterogeneidade entre os estudos, foram utilizados para calcular as RUP e ICs de 95%, a fim de avaliar a associação entre

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risco metilação do promotor e CC. Onde um valor de zero no número de eventos de metilação do promotor causou problemas com a computação das RUP para estudos individuais, o software de avaliação 5.2 Gestor fornecido para adicionar um valor de 0,5 a todas as células da tabela de referência cruzada relacionada [38].

a heterogeneidade entre os estudos, foi medida usando o Q-teste baseado na estatística χ2, considerando a heterogeneidade estatística significativa, p 0,1. Como teste de Cochran indica apenas a presença de heterogeneidade e não a sua magnitude, também relataram a estatística I

2, que calcula a percentagem de variabilidade resultado que pode ser atribuído à heterogeneidade entre os estudos. Um I

2 valor de 0% significa sem heterogeneidade observada, enquanto que, 25% é ” baixa “, 50% é ” moderado” e 75% é “a” heterogeneidade “elevado [39]. Nós também estimou a variação entre-estudo utilizando (t) Estatística de tau-quadrado [40].

Além disso, as análises de subgrupo foram realizadas por tipo histológico (SCC e AC), por meio de ensaios utilizados para avaliar

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metilação do promotor (metilação específico PCR-MSP e quantitativa em tempo real MSP-qMSP) de origem e, por controle de amostra (cervical tecidos-NT e benigna cervical tecidos-BCT normal). A análise de sensibilidade foi realizada para encontrar relativamente estudos de baixa qualidade pela omissão de um único estudo de cada vez e ver se uma omissão particular poderia afetar o geral ou o valor ea heterogeneidade entre os estudos.

Para determinar o presença de viés de publicação, a simetria das parcelas funil em que RUP foram plotados contra os seus correspondentes erros padrão foram avaliados.

resultados

resultados da pesquisa e características de dados

o detalhada etapas do processo de revisão e meta-análise sistemática são dadas como um fluxograma PRISMA (Fig 1). Um total de 519 artigos foram recuperados a partir da base de dados. Após a exclusão de estudos que não preencheram os critérios de inclusão,

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resultou do gene analisado mais comum. Posteriormente, um artigo foi adicionado através de pesquisa manual com lista de referência e, portanto, 27 artigos, publicados entre 2001 e 2014, foram incluídos na revisão sistemática e resumidos na Tabela 1. Um total de 13 estudos eram de países asiáticos (48%) [13 , 17, 36, 41-50], 6 de países europeus (22%) [3, 16, 51-54], 5 dos EUA (19%) [55-59] e 3 da África (11%) [60 -62]. Todos os estudos avaliaram

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metilação do promotor no CEC e 12 estudos (44,4%), também em AC. Em relação ao método de avaliação de metilação do promotor, o “método padrão de ouro”, usado na maioria dos estudos (67%), foi MSP, seguido por qMSP (26%), a sequenciação (3,5%) e de metilação específico do multiplex de amplificação da sonda dependente de ligadura (MS-MLPA) (3,5%).

Meta-análise

dos 27 artigos selecionados, 4 estudos realizados sem um grupo de controle, 2 estudos que incluiu pré-cancerosa lesões no controle ou em grupos de casos e 1 estudo que reportaram dados inadequados, foram excluídos da meta-análise. Assim, estudos 20 (74%) avaliando

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metilação do promotor tanto no tumor e em amostras de controlo saudáveis ​​foram incluídos na presente meta-análise. No geral, os estudos relataram resultados obtidos a partir de 1929 amostras: 1092 a partir de pacientes com câncer e 837 dos controles. Em relação à fonte de amostras de controlo, 10 estudos avaliaram

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metilação do promotor em BCT de pacientes portadores de doenças ginecológicas, como mioma uterino, adenomyoma, e prolapso uterino, 8 estudos em NT de pessoas saudáveis ​​e 2 estudos em cervical normal tecidos adjacentes ao tumor.

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metilação do promotor foi associado com um risco aumentado de CC com um pool ou de 19,97 (IC 95% = 13,57-29,38) com base no modelo de efeitos fixos. No entanto, devido à heterogeneidade significativa (I

2 = 49%; p = 0,007), um pool ou de 21,20 (IC 95% = 11,14-40,35), com base no modelo de efeitos aleatórios, obteve-se (figura 2) . As análises dos subgrupos foram realizadas por tipos histológicos, métodos para a análise de metilação e fontes de amostras de controlo. A associação entre o

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metilação do promotor e CC foi confirmada em cada subgrupo (S1 Tabela).

Além disso, a análise de sensibilidade encontrados no estudo de Yang et al. (2010) [54], como o estudo relativamente pobre qualidade. Quando este estudo [54] foi omitido, o estudo entre heterogeneidade diminuiu para I

2 = 39% (p = 0,04), ea associação entre

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metilação do promotor e CC risco aumentado (OR: 24,13 ; IC95% = 15,83-36,78) (S1 Fig)

análises de subgrupos omitindo o estudo heterogênea [54] foram realizadas. análise de subgrupo por tipos histológicos mostraram que a heterogeneidade totalmente desapareceu no subgrupo AC (I

2 = 0%; p = 0,93) ea associação foi confirmada tanto na SCC (OR = 33,84; IC95% = 15,61-73,37; baseadas no modelo de efeitos aleatórios) (Fig 3A) e CA (OR = 21,89; IC de 95% = 8,64-55,48; com base no modelo de efeito fixo) (Fig 3B) subgrupos. Além disso, a análise de subgrupos com base em ensaios de métodos utilizados para avaliar

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metilação do promotor foi realizado incluindo as duas técnicas comuns, MSP e qMSP. Os ORs foram 23,45 (95% CI = 10,56-52,09), com base no modelo de efeitos aleatórios, no subgrupo de MSP, e 34,25 (95% CI = 12,34-95,04), com base no modelo de efeitos fixos, em qMSP subgrupo, enquanto o I

2 foram de 51% e 0%, respectivamente (Figura 4A e 4B). A análise de subgrupo por fonte de amostra de controlo, e particularmente entre NT e BCT, informou que as RUP foram 16,99 para NT (IC 95% = 9,09-31,76) e 22,00 para BCT (IC95% = 11,95-40,51), respectivamente. Heterogeneidade em subgrupos NT e BCT eram baixos com I

2 = 48% e eu

2 = 14%, respectivamente (Fig 5).

(A) Carcinoma de células escamosas (SCC) análise de subgrupo , com base no modelo de efeitos aleatórios. (B) Adenocarcinoma (AC) análise de subgrupo, com base no modelo de efeitos fixos.

Análise de subgrupo

(A) PCR de metilação-específica (MSP), com base no modelo de efeitos aleatórios. (B) quantitativo em tempo real MSP (qMSP) análise de subgrupo, com base no modelo de efeitos fixos

NT:. Tecido cervical normal; BCT:. Benigno tecido cervical

O gráfico de funil da análise agrupada (Fig 6), que é bastante simétrica, sugere nenhum preconceito significativa entre os estudos incluídos, no entanto, as formas dos subgrupos análises (S2 , S3 e S4 Figs) indicam pequena assimetria a moderada, portanto viés de publicação não pode ser completamente excluída como fator de influência sobre o presente meta-análise.

Discussão

genes supressores de tumor pertencentes a diferentes caminhos, como adesão celular, reparo do DNA, controle do ciclo celular checkpoint e receptores nucleares, foram encontrados para ser hipermetilado em CIN e CC [41, 55, 60].

Uma revisão anterior [63] resumiu os resultados de 51 estudos publicados sobre a análise de metilação realizados em tecidos e células cervicais e propôs que a combinação de

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,

CADM1

, e

R a R b

genes iria aparecer o painel mais promissor gene metilado para obter um desempenho adequado para triagem CC.

a recente meta-análise de Xiong et al. [64], incluindo 15 estudos, sugere uma forte associação entre

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metilação do promotor e CC (agrupada OR = 19,66; IC95% = 8,72-44,31), indicando que

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metilação do promotor pode ser um biomarcador durante a carcinogênese cervical.

Nossos relatórios de estudo resultados de uma meta-análise mais abrangente e, tendo em conta que a metilação do promotor poderia ser um evento específico do tecido [65, 66], fornece uma análise de subgrupo por tipo histológico do tumor. A presente meta-análise em causa 20 artigos originais e, em um total de 1092 de pacientes com câncer e 837 amostras de controlo, relata um significativo em pool ou de 21,20. Devido à heterogeneidade moderada entre os estudos, uma análise de sensibilidade e análises de subgrupos de tipos de tumores histológicos, fontes de amostras de controlo e ensaios utilizados para avaliar

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metilação do promotor foram realizadas. Curiosamente, removendo o estudo mais heterogênea [54], a associação entre o

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metilação do promotor e CC risco aumentado (OR: 24,13) e foi confirmada em SCC e AC subgrupos com uma heterogeneidade entre estudo do I

2 = 48% e eu

2 = 0%, respectivamente.

O método padrão de avaliação de ouro metilação do promotor de MSP foi, em que os produtos de PCR são separados num gel de, e os resultados são reportados como metilado ou não metilado na sequência de ADN alvo. Consequentemente, este método não permite a identificação de níveis parciais de metilação, uma característica que é extremamente relevante tanto biológica como clinicamente. Assim, qMSP tem sido desenvolvida nos últimos anos para ultrapassar esta limitação de DME convencional. Na verdade, qMSP é relatado para ser mais específico e mais sensível do que o MSP convencional e permite uma análise de alto rendimento, tornando-a mais adequada como ferramenta de rastreio [67-69]. No presente meta-análise, considerando estes dois métodos de detecção, ambos os subgrupos relatou uma associação significativa entre o

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metilação do promotor e CC. Embora a heterogeneidade entre os estudos estavam moderadamente elevados em MSP subgrupo (I

2 = 51%), a heterogeneidade na qMSP subgrupo diminuiu para I

2 = 0%.

Por fim, a análise de subgrupo por fonte de controle de amostra revelou uma associação significativa em ambos os subgrupos; a heterogeneidade em subgrupos NT e BCT foi moderadamente baixo (I

2 = 48% e eu

2 = 14%, respectivamente).

O presente estudo tem algumas limitações. O número de estudos incluídos na meta-análise é modesta (n = 20). Além disso, uma vez que todos os estudos incluídos tinha um desenho de caso-controle, não é possível esclarecer se

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metilação do promotor é uma aberração causadores de câncer precoce ou um efeito da carcinogênese. Por conseguinte, o potencial de medidas de metilação do DNA requer validação em estudos retrospectivos, mas em última análise, em estudos clínicos prospectivos grandes [70].

Além disso, embora a análise de sensibilidade e análises de subgrupo foram realizadas, as estimativas agrupadas devem ser interpretados com cautela, devido à heterogeneidade moderada entre os estudos. Finalmente, a pequena a moderada assimetria nas parcelas de funil, sugere que o viés de publicação não pode ser completamente excluída.

A utilidade da

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hipermetilação do gene supressor de tumor como um marcador epigenético está sob intensa investigação muitos cancros diferentes, incluindo CC e suas lesões precursoras e do presente meta-análise fornece evidências científicas para este debate, mostrando uma forte associação significativa entre o

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metilação do promotor e CC. Este resultado foi confirmado de forma independente por tipo histológico do tumor, método utilizado para avaliar metilação e fonte de amostras de controlo.

Informações de Apoio

S1 Fig. Análise de sensibilidade de 20 estudos com o modelo de efeitos fixos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0135078.s001

(TIF)

S2 Fig. . Gráfico de funil da análise de subgrupos com base no tipo de câncer histológico, omitindo um estudo heterogênea [54]

SCC: carcinoma epidermóide; AC: Adenocarcinoma

doi:. 10.1371 /journal.pone.0135078.s002

(TIF)

S3 Fig. gráfico de funil da análise de subgrupos com base no método, omitindo um estudo heterogênea [54]

MSP:. metilação-Specific PCR; qMSP: quantitativo em tempo real MSP

doi:. 10.1371 /journal.pone.0135078.s003

(TIF)

S4 Fig. gráfico de funil da análise de subgrupos com base na fonte de amostra de controlo, omitindo um estudo heterogênea [54]

NT:. tecido cervical normal; BCT:. Tecido cervical benigna

doi: 10.1371 /journal.pone.0135078.s004

(TIF)

S1 Arquivo. . PRISMA lista

doi: 10.1371 /journal.pone.0135078.s005

(PDF)

S2 Arquivo. Meta-análise sobre Genetic Association Studies Checklist

doi:. 10.1371 /journal.pone.0135078.s006

(PDF)

S1 Table. análises de subgrupos com base no tipo de câncer histológico, método e fonte de amostra de controlo

SCC:. Carcinoma de células escamosas; AC: Adenocarcinoma; MSP: PCR de metilação-específica; qMSP: quantitativo em tempo real MSP; M +: o número de indivíduos /amostras com metilação; M-: o número de sujeitos /amostras sem metilação; NT: tecido cervical normal; BCT:. Tecido cervical benigna

doi: 10.1371 /journal.pone.0135078.s007

(TIF)

Reconhecimentos

Os autores agradecem a Bench Srl, da Universidade de Catania , para suporte técnico.