Abstract

Akt /proteína quinase B é um pivot componente a jusante da via de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), cuja actividade regula o equilíbrio entre a sobrevivência celular e apoptose. A fosforilação de Akt ocorre em dois locais principais, quer no local de Thr308 na ansa de activação ou no local de Ser473 no motivo hidrofóbico. A forma fosforilada da Akt (pAkt) é activado para promover a sobrevivência da célula. Os mecanismos de pAkt desfosforilação e como a transdução de sinal de Akt está terminada são ainda desconhecidos. Neste estudo, identificamos uma CSTP1 romance proteína fosfatase (completo s proteína transactivado 1), que interage e desfosforila Akt especificamente no local Ser473

in vivo

e

in vitro

, blocos de progressão do ciclo celular e promove a apoptose celular. Os efeitos sobre a sobrevivência de CSTP1 de células e ciclo celular foram anulada pela depleção de domínio de fosfatase CSTP1 ou por expressão de uma forma constitutivamente activa de Akt (S473D), sugerindo local de Akt Ser473 como um alvo celular primária de CSTP1. A análise do perfil de expressão mostraram que a expressão CSTP1 é selectivamente regulada para baixo em tecidos não-invasivos de cancro da bexiga e sobre-expressão de CSTP1 suprimiu o tamanho de tumores em ratinhos nus. As curvas de Kaplan-Meier revelou que a diminuição da expressão de CSTP1 implicados dele reduziu significativamente a sobrevida livre de recorrência em pacientes sofriam de cancros da bexiga não invasivos

Citation:. Zhuo DX, Zhang XW, Jin B, Zhang Z, Xie BS, Wu CL, et al. (2013) CSTP1, uma fosfatase nova proteína, Blocos Ciclo Celular, Promove celular apoptose, e suprime o crescimento do tumor de câncer de bexiga por Diretamente desfosforilando Akt em Ser473 Site. PLoS ONE 8 (6): e65679. doi: 10.1371 /journal.pone.0065679

editor: Ferenc Gallyas, Universidade de Pecs Medical School, Hungria

Recebido: 11 de dezembro de 2012; Aceito: 17 de abril de 2013; Publicação: 17 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhuo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation da China concede 81272827 e 30971627. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. os autores têm declarou que não existem interesses conflitantes.

Introdução

o câncer de bexiga é o segundo tumor maligno mais comum no trato geniturinário, com 350.000 novos casos diagnosticados e mais de 145.000 mortes por ano em todo o mundo [1]. Porque vigilâncias longo prazo dos pacientes são necessários, juntamente com possíveis recidivas e outras complicações, tratamentos de cancros da bexiga geralmente custam muito dinheiro. De acordo com as diferenças de desenvolvimentos clínicos, patológicos e perfis alteração molecular, cancros da bexiga são classificados em dois tipos de carcinomas: o não-invasivos musculares superficiais, carcinomas papilares e os carcinomas invasivos musculares [2]. O não-invasivos musculares superficiais, carcinomas papilares são geralmente baixos, mas com alta incidência e altos retornos, enquanto a musculares carcinoma invasivo muitas vezes causam metástases à distância e mortes rápidas [3].

Várias vias de sinalização estão com risco de vida implicado na iniciação e progressão de cancros da bexiga, incluindo mutações em componentes da via PI3K /Akt e Ras /MAPK caminho oncogénica maneira e alterações nos supressores de tumor, tais como p53 e Rb. Há evidências crescentes de que indica que alterações nesses componentes da via não são apenas associados com a iniciação de cancros da bexiga, mas também fortemente correlacionada com a recorrência da doença, progressão e sobrevivência. Por exemplo, o ganho de mutações de função de Ras, FGFR3, PIK3CA são frequentemente implicado no não-músculo invasivo superficiais, carcinomas papilares, enquanto a perda de alterações da função de genes p53 e Rb são encontradas mais frequentemente em, músculo carcinomas invasoras agressivas [4] – [6].

a fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) regula o equilíbrio entre a sobrevivência celular e apoptose, e esse equilíbrio é muitas vezes interrompido em muitos tipos de cancros humanos, incluindo os cancros da bexiga urothelial humanos [2 ]. Akt a jusante é um componente fundamental da via PI3K, que pode ser activado por fosforilação sequencial em dois locais conservados na família cinase AGC [7]. Por exemplo, uma quinase a montante de PDK-1 pode fosforilar o local de Thr308 na ansa de activação da Akt1 [8], [9], o que desencadeia a autofosforilação de Akt1 na sua extremidade C-terminal de Ser473 [10], e assim activa totalmente Akt1. sinalização de Akt pode ser terminada por dois mecanismos: a remoção do segundo mensageiro lipídico activo que é catalizada pela fosfatase lipídica PTEN (fosfatase e homólogo tensina suprimida no cromossoma dez) [11], e a desfosforilação da Akt activado. Akt também pode ser diretamente desfosforilado pelas fosfatases do tipo PP2A [12] ou de outras proteínas fosfatases como PHLPP1 (PH domínio rico em leucina de repetição da proteína fosfatase 1) e PHLPP2 [13], [14].

Aqui , que relatou um romance proteína fosfatase, denominado o s completa proteína transactivado 1 (CSTP1) [15], cuja expressão foi reduzido selectivamente no não-musculares cancros da bexiga invasivo. Para fazer uma melhor compreensão da importância do CSTP1 na carcinogênese da bexiga, neste estudo, iremos profundo conhecimento sobre i. os efeitos de CSTP1 no ciclo celular de cancro da bexiga, a apoptose e a formação de tumores in vivo e os mecanismos moleculares sublinhados; II. os mecanismos moleculares pelos quais CSTP1 exerce a sua função biológica; III. a importância da diminuição da expressão de CSTP1 sobre a recorrência e prognóstico de cancros da bexiga não invasivos.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pelos comitês de ética da Universidade de Pequim primeiro Hospital (Permit Number: 2008 [96]) e consentimento informado por escrito foi obtido de cada sujeito. Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Pequim. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Pequim Primeiro Hospital (Permit Number: J201112).

Os pacientes

Oitenta e seis pacientes com câncer de bexiga que foram recentemente diagnosticados no Instituto de Urologia, Universidade de Pequim foram incluídos neste estudo. Entre eles, 62 casos tinham cancros da bexiga não invasivos e sofreu órgão de preservação após a ressecção transuretral de tumores da bexiga (TURBT). A idade média (± SD) dos 62 pacientes foi de 65,3 ± 11,5 anos (40 homens e 22 mulheres).

Cultura de Células

RT4, SV-HUC1, EJ, e as células T24 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. células HeLa e 293T foram cultivadas em meio DMEM suplementado com FBS a 10% e 100 U /ml de penicilina. As células Sf9 foram mantidas em meio SF-900 II SF contendo penicilina /estreptomicina a concentração final (50 unidades /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina) a 27 ° C.

Real Time PCR

o RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A primeira cadeia de ADNc foi sintetizada utilizando SuperScript TMIII kits de primeira cadeia (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). GAPDH foi usada como um controlo interno. iniciadores CSTP1_RT e GAPDH_RT utilizados neste estudo são apresentados na Tabela 1. A diferença na expressão de ARNm CSTP1 foi calculada usando o método 2-ΔCt Schmittgen descrito por [16].

Experimentação Animal

ratinhos nu feminino Seis a oito semanas de idade, com BALB /c fundo foram adquiridos da Universidade de Pequim. A 5 × 106 células EJ de sobre-expressar ou CSTP1 CSTP1 ΔPP2Ac e as células de controlo foram injectados por via subcutânea em ratos. O tamanho dos tumores foi medido uma vez por semana com um paquímetro, e os volumes dos tumores foram calculados utilizando a fórmula π comprimento /6 × largura2. Cada ponto representa a média ± S.D. para diferentes medições de animais (n = 6).

Preparação de Anticorpos

de anticorpo policlonal anti-CSTP1 foi preparado por imunização de coelhos com o péptido 20-mer, IDEDDDYYFNLSKSTRKKLA, e anti-soro foi purificado por cromatografia de afinidade .

Construção do plasmídeo

a região de codificação de CSTP1 foi obtido a partir de cDNA de bexiga normal, endotelial utilizando iniciadores CSTP1_MYC_F e CSTP1_MYC_R, e clonado no myc pcDNA3.1 /o vector pcDNA3 C para gerar o plasmídeo recombinante 0,1 mic /His -CSTP1 C. Todos os iniciadores utilizados neste estudo são apresentados na Tabela 1. Para gerar construção de fusão GFP, toda a região codificante de CSTP1 foi amplificado utilizando iniciadores CSTP1_GFP_F e CSTP1_GFP_R, e subclonado no vector de expressão pEGFP-N1 como pEGFP-CSTP1. O plasmídeo de expressão de lentivírus pZsG-CSTP1 foi construído através da inserção de produtos de PCR amplificados por CSTP1_ZsG_F e CSTP1_ZsG_R no plasmídeo pZsG. pZsG-CSTP1 ΔPP2Ac foi obtida utilizando iniciadores e CSTP1ΔPP2Ac_F CSTP1ΔPP2Ac_R e os produtos foram ligados novamente utilizando a ligase de ADN de T4. A região de codificação de Akt1 foi amplificado com os iniciadores Akt_Tag_F e Akt_Tag_R e clonado em plasmídeo pCMV Tag-2B. Para a construção do mutante phosphomimetic Akt (S473D), Akt1 tipo selvagem foi primeiro clonado no plasmídeo usando pZsG de PCR (iniciadores Akt_ZsG_F e Akt_ZsG_R são dadas na Tabela 1). mutação pontual em Akt1 (Ser473) que converte Ser por Asp foi gerado usando o kit de mutagénese sítio-dirigida QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante, com os seguintes iniciadores (Akt_Mut_F e Akt_Mut_R, Tabela 1). Para a expressão bacteriana de proteínas CSTP1, cDNA CSTP1 foi clonado no vector pET-42a com primers (CSTP1_pET_F e CSTP1_ pET_R, Tabela 1).

RNA Interferência

As sequências alvo CSTP1 siRNA humanos (CSTP1_siRNA_target , Tabela 1) são em relação ao primeiro nucleótido do codão de iniciação da sequência de codificação CSTP1 humano. Um não-relacionado, mexidos siARN foi utilizado como controlo negativo (CSTP1_siRNA_neg, Tabela 1). O siARN foi sintetizado por Shanghai Genechem Co., Ltd, na China. CSTP1 knockdown foi realizada por transfeco de ARNsi em células MCF utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

Análise de mancha de Northern

O ARN total foi extraído a partir de tumores linhas celulares utilizando TRIzol regente (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Vinte microgramas de amostras de ARN total foram desnaturadas, fraccionado por tamanhos por electroforese em 1,2% gel de agarose-formaldeído, e transferidos para membrana de transferência de nylon Magna (Osmonics Inc. em Minnetonka, MN, EUA). Para a detecção de ARNm endógeno CSTP1, ORF de CSTP1 foi excisado a partir de pcDNA3.1 Mic /His C-CSTP1 plasmídeo, marcado com [32P-α] dCTP usando Prime-a-Gene Labeling System (Promega, Madison, WI, EUA) . O controlo interno de GAPDH foi obtido pelo método de PCR com iniciadores (GAPDH_NB_F e GAPDH_NB_R, Tabela 1) e foi etiquetado como acima. A hibridação foi realizada numa solução de hibridização ExpressHyb (Clontech, Mountain View CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

in vitro Ensaio de Fosfatase

As células 293T foram transfectadas com pcDNA3.1 myc /HIS C plasmídeo-CSTP1 usando o método de transfecção com fosfato de cálcio. Após 48 h, as células foram lisadas em tampão de armazenamento da fosfatase. A proteína de fusão CSTP1-His foi purificada por EZView vermelho HIS-Select HC níquel Gel de Afinidade (Sigma, Ronkonkoma, NY, EUA). As proteínas foram utilizados para Ensaio de Fosfatase usando serina /treonina fosfatase Assay System (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

Para examinar se CSTP1 purificado pode desfosforilar Akt, CSTP1 foi expressa como uma proteína de fusão GST em BL21 (DE3) bacteriana e purificado com glutationa-Sepharose. As reacções de desfosforilação foram efectuadas tal como descrito por Gao Tianyan [13].

Baculovirus Vector construção, Vírus Embalagem

Para obter His Akt1, o comprimento total que codifica para a região Akt1 foi primeiro clonado pcDNA3.1Myc /His C plasmídeo por PCR com iniciadores Akt_His_F e Akt_His_R (Tabela 1) e, em seguida, Akt1-His sequência de codificação foi preparado pelo método de PCR com iniciadores e Akt_Bac_F Akt_Bac_R (Tabela 1) com pcDNA3.1Myc /His C-Akt1 plasmídeo como molde. O produto foi subclonado nos sítios BamHI e Xhol do vector de transporte pFastBacTM baculovírus (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O plasmídeo dador pFastBacTM recombinante é transformado em DH10BacTM de transposição para o bacm�eo. colónias brancas contêm foram selecionados os bacm�eo recombinantes para o isolamento de DNA recombinante bacm�eo. Para gerar partícula virai, as células Sf9 em placas de 6 poços foram transfectadas com o ADN de bacmid recombinante CSTP1 em CellfectinTM (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Cinco dias depois, o meio foi recolhido e o sobrenadante foi reservado como estoque viral P1.

Análise de citometria de fluxo

Para o ensaio de apoptose, as células foram tratadas com 10

-8 mol /L gemcitabina ou 2 ug /mL de cisplatina, respectivamente. 48 horas mais tarde, as células foram obtidas e duplamente coradas com anexina V-FITC e PI (KEYGEN, Nanjing, China). apoptose celular foi analisada por citometria de fluxo (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).

Para a análise do ciclo celular, as células foram cultivadas em RPMI 1640 normal com FBS a 10% para aproximadamente 40% confluencey, e cultivadas com 2 timidina mM durante 19 h. As células foram esgotadas de timidina e incubadas durante 9 h até 2 mM de timidina adicionou-se pela segunda vez, e as células foram cultivadas durante um adicional de 16 h. Após a remoção de timidina de novo, as células sincronizadas-timidina foram cultivadas em meio completo e recolhidos em momentos diferentes para análise do ciclo celular. Em geral, as células foram lavadas duas vezes com solução de PBS e fixadas com álcool refrigerada 70% a -20 ° C durante 24 h. sedimento celular foi recolhido por centrifugação, lavado duas vezes com solução de PBS, incubadas com 20 ul de ARNase A (20 mg /ml) durante 30 min a 37 ° C, e coradas com 25 ug /ml de PI durante 30 min à temperatura ambiente. a distribuição do ciclo celular foi então avaliada utilizando citometria de fluxo (BD Biosciences, EUA).

Análise Imunohistoquímica

Quatro secções micrômetros de tecidos embebidos em parafina e fixados em formalina foram montados em poli-L-lisina lâminas -Revestido e, em seguida, desparafinados em xileno e reidratadas através do álcool à água destilada. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 3% de peróxido de hidrogénio durante 15 minutos à temperatura ambiente. Depois de pressão cozinhar as lâminas em EDTA 10 mM (pH 8,0) durante 3 minutos, as secções foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo de coelho anti-CSTP1 (1:200). Os anticorpos primários foram detectados utilizando um sistema EnVision de dois passos (Dako, Dinamarca). controles de imunohistoquímica positivos e negativos foram usados ​​rotineiramente. Para controlos negativos, o anticorpo primário foi substituído por soro de coelho não imune para confirmar a sua especificidade.

Avaliação da coloração CSTP1 foi principalmente de acordo com os critérios de pontuação descritos anteriormente [17]. A escala de referência quantitativo imuno-histoquímica que varia de 0 a 3 depende da intensidade da expressão da proteína CSTP1. A quantidade relativa de células tumorais que coraram positivamente para CSTP1 (0-100%), em conjunto com a classificação da intensidade de coloração, resultou numa pontuação de coloração que varia de 0 a 100.

Análise estatística

sobrevida livre de recorrência foi avaliada por curvas de Kaplan-Meier. As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste de log rank. sobrevida livre de doença foi definida como o período entre a cirurgia e a detecção de recorrência local inicial. Toda a análise foi realizada pelo software estatístico SPSS 12.0 eo valor P inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

mRNA CSTP1 Expressão em linhas normais e tumor tecidos e de células

gene CSTP1

foi identificado pela primeira vez por Bai GQ em 2005 [15], que foi transactived por proteína S completa de vírus da hepatite B, e suposto que pode ser associada com os cancros humanos. Em primeiro lugar, examinou

CSTP1

nível de expressão de mRNA em vários tipos de cânceres humanos, incluindo fígado, pâncreas, estômago, cólon, bexiga e câncer renal. Para nossa surpresa,

CSTP1

ARNm foi diminuiu significativamente (de 40% ~ 90%) em 80% (8 de 10) de tecidos de cancro da bexiga, em comparação com tecidos não-cancerosas adjacentes emparelhados, enquanto que a expressão de

CSTP1

ARNm em fígado, pâncreas, estômago, cólon e tecidos de cancro renal não se alterou de forma significativa (Fig. 1A). Em seguida, determinou o nível de mRNA CSTP1 expressão por Northern blot em linhas celulares de cancro da bexiga e SV-HUC1, um urothelial células não transformadas. Resultados de Northern blot mostrado um nível de expressão moderada de

CSTP1

mRNA em células SV-HUC1, mas em RT4, as células de câncer de bexiga EJ e T24,

CSTP1

mRNA dificilmente poderia ser detectada (Fig. 1B). Além disso, dois conjuntos de conjunto de dados microarray obtido a partir Oncomine também revelou que a expressão do mRNA CSTP1 diminuiu em cancros da bexiga, com valores de p de 0,005 (para cima) e 2.62E-4 (para baixo), respectivamente (Fig. 1C).

(A), em tempo real A análise de PCR de

CSTP1

níveis de ARNm em seis tipos de tecidos cancerosos humanos.

CSTP1

mRNA foi selectivamente regulada para baixo em tecidos de cancro da bexiga em comparação com tecidos não cancerosos adjacentes. (B) Análise de transferência de Northern de mRNA CSTP1 em linhas celulares de cancro da bexiga.

CSTP1

mRNA foi expressa em um nível moderado em células SV-HUC1, mas dificilmente poderia ser detectado em RT4, EJ e linhas celulares de cancro da bexiga T24, GAPDH foi utilizado como controle interno. Análise da expressão (C) CSTP1 ARNm em Oncomine. Diminuição da expressão de mRNA CSTP1 em cancros da bexiga em dois conjuntos de conjunto de dados, com valores de p de 0,005 (para cima) e 2.62E-4 (para baixo), respectivamente (1, mucosa da bexiga;. 2, infiltrando carcinoma urotelial de bexiga, 3, cancro da bexiga superficial ).

Caracterização de CSTP1

Bioinformatics análise mostrou que o ARNm é CSTP1 6156 pb de comprimento, que codifica para uma proteína de 314 aminoácidos (Fig. 2a). A massa molecular prevista desta proteína é de 36 kDa com o ponto isoeléctrico teórica de 5,99. O gene correspondente foi mapeado no cromossoma 16p13.12, constituído por quatro exões e intrões três. A análise da sequência da proteína prevista mostrou que a proteína contém um domínio CSTP1 PP2Ac (proteína fosfatase 2A unidade catalítica) a partir de aminoácidos 50 a 250 (Fig. 2B). A análise filogenética indica que o gene CSTP1 é conservada entre chimpanzé, cão, vaca, murganho, rato, galinha, peixe-zebra, e P. falciparum (Fig. 2C).

(a) a sequência de nucleótidos de

CSTP1

grelha de leitura aberta e a sequência de aminoácidos deduzida. A sequência nucleotídica é mostrada na direcção 5 ‘para 3’. A sequência de aminoácidos prevista é mostrada por baixo da sequência de nucleótidos. Os resíduos de aminoácidos que corresponde ao domínio catalítico unidade phosphorase 2A (PP2Ac) estão em letras vermelhas. Análise (B) Bioinformatics indicou que a proteína CSTP1 continha um domínio PP2Ac conservada entre 50 a 250 aminoácidos. (C) A análise filogenética mostrou que a proteína CSTP1 é conservada no chimpanzé, cão, vaca, murganho, rato, galinha, peixe-zebra, e P. falciparum. (D) Análise Western blot da expressão CSTP1 em células HeLa. As células HeLa foram transfectadas com pCDNA3.1 Myc /His C-CSTP1 plasmídeo, 48 h mais tarde, o nível da proteína de fusão CSTP1-Myc foi testado pelo anticorpo anti-myc. Actina foi utilizada como controlo interno. (E) CSTP1 exibida uma atividade proteína fosfatase PP2B-como

in vitro

. As células 293T foram transfectadas com pcDNA3.1Myc /His C-CSTP1, 48 h mais tarde, o-His CSTP1 proteína de fusão foi purificada para o ensaio de fosfatase. A libertação do Pi foi determinada na presença de 1 mM de EGTA, 50 mM MgCl

2, 5 mM de NiCl

2 e 250 ug /mL de calmodulina. 200 nM trifluoroperazine ou 0,5 mol de ácido ocadaico, também foi adicionado ao anula a actividade de fosfatase de PP2B ou PP2A.

Em seguida, confirmou o peso molecular previsto de proteína CSTP1. O pcDNA3.1Myc /His C-CSTP1 plasmídeos foram transfectados em células HeLa e proteína de fusão CSTP1-Myc foi determinada por Western blot com anticorpo anti-myc. Como mostrado na Fig. 2D, o plasmídeo recombinante expressa uma proteína com o peso molecular esperado de 36 kDa.

Finalmente, determinou-se a proteína CSTP1 exibida uma actividade de fosfatase de serina /treonina in vitro. As células 293T foram transfectadas com pcDNA3.1myc /os plasmídeos C-CSTP1 e a-His CSTP1 proteína de fusão foram purificadas por ensaio de fosfatase. A actividade enzimática foi determinada através da medição da libertação de Pi do substrato péptido sintético comercial contendo um resíduo fosfotreonina [RRA (PT) VA]. Como mostrado na Fig. 2E, proteína CSTP1 catalisada Pi liberado da RRA peptídeos (PT) VA, além disso, inibidor específico PP2B, trifluoroperazine quase revogou a sua actividade de fosfatase, enquanto PP2A inibidor específico ácido ocadaico não afetou a atividade CSTP1.

localização subcelular de CSTP1

Para obter insights sobre a função biológica da proteína CSTP1, analisamos primeiro a sua localização subcelular. plasmídeos de expressão CSTP1 GFP foram transfectados em células HeLa, e a fluorescência foi visualizada sob microscópio de fluorescência. As células transfectadas com vector vazio pEGFP exibida fluorescência difusa ao longo de compartimentos subcelulares de células, enquanto que CSTP1-GFP localizada principalmente para o citoplasma (Fig. 3), o que sugere que CSTP1 pode exercer a sua função através da localização para o citoplasma celular.

As células HeLa foram transfectadas com plasmídeo pEGFPN1 e pEGFPN1-CSTP1 respectivamente, 48 horas mais tarde, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e visualizados por microscopia de fluorescência confocal. 4, 6-diamidino-2-fenilindole coloração dicloridrato foi utilizado para indicar o núcleo da célula. Os resultados foram representativos de três experiências independentes.

CSTP1 Over-expressão Suprime o cancro de bexiga proliferação celular e Formação de Colónias, mas não Invasion

Dada a observação de que CSTP1 mRNA foi diminuída em câncer de bexiga tecidos, presume-se que CSTP1 pode funcionar como um supressor tumoral em cancros da bexiga. Para investigar o papel de CSTP1 na função celular, analisou-se primeiro o efeito da sobreexpressão CSTP1 sobre a proliferação celular. CSTP1 foi sobre-expresso de forma estável em células de câncer de bexiga EJ via infecção lentivírus e proliferação celular foi avaliada pelo método de MTT. A sobre-expressão de CSTP1 inibiu a proliferação de células EJ em 50% após cultura de um 5-dia (Fig. 4A), ao mesmo tempo, a depleção de domínio PP2Ac prejudicada a capacidade de crescimento de inibição de CSTP1 em células EJ em 80% (Fig. 4A) . Consistente com os resultados do ensaio de MTT, a sobre-expressão de CSTP1 diminuiu a capacidade de formação de colónias de células EJ, e depleção de domínio PP2Ac resgatado a capacidade de formação de colónias de células EJ (Fig. 4B). Resultados semelhantes foram obtidos em outra linha de células de cancro da bexiga T24 (dados não mostrados).

células EJ (A) foram transduzidas com lentivírus com superexpressão CSTP1 (Lv-CSTP1), o PP2Ac domian excluído CSTP1 (Lv-CSTP1 ΔPP2Ac ), ou controle de lenti-vector (Lv-CTR). A proliferação celular foi detectada por ensaio MTT. Os dados em cada ponto de tempo representa a média ± SD de 8 amostras. Os resultados foram representativos de três experiências independentes. (B) As células EJ transduzidas foram cultivadas durante 14 dias, e as colónias foram coradas com violeta de cristal e contadas no campo de uma lente objectiva 40 x. Os resultados foram representativos de três experiências independentes. (C) O crescimento do tumor de xenoenxerto em ratinhos nus foram notavelmente suprimidos seguinte CSTP1 superexpressão. Os dados em cada ponto de tempo representa a média ± DP, n = 6. Os ensaios de câmara (D) foram realizados com células transduzidas EJ. Os resultados mostraram que CSTP1 não tem efeito sobre a invasão celular. Os dados apresentados foram o número médio de células invasoras (100 × campo) ± DP de três experiências independentes. ** P . 0,01

Para investigar o papel do CSTP1 in vivo, estabelecemos tumores da bexiga de xenotransplante humanos em ratinhos nus pela injeção de células EJ controle ou células EJ expressam de forma estável, quer de tipo selvagem ou CSTP1 CSTP1 ΔPP2Ac. O crescimento dos tumores implantados foi medido em ratos (n = 6 para cada grupo) ao longo de um período de 8 semanas. Os resultados indicaram que, em ratinhos atímicos que receberam as células que sobre-expressam CSTP1 EJ, o crescimento do tumor foi significativamente suprimida (~ 50%), mas em ratinhos atímicos que receberam células EJ que sobre-expressam CSTP1 ΔPP2Ac, o crescimento tumoral quase não se alteraram em comparação com o grupo de controlo (Fig. 4C). No entanto, a sobre-expressão CSTP1 não teve efeito sobre a invasão de células EJ, tal como determinado por ensaios de Transwell (Fig. 4D).

Influência CSTP1 no ciclo celular e apoptose

Para explorar o efeito da CSTP1 no ciclo celular , células EJ lentivírus transduzidas foram sincronizadas na fase G0 /G1 por dois ciclos de tratamento de timidina e do ciclo celular foram analisadas por FACS a 0 h, 2 h, 4 h e 8 h após a liberação da fase G0 /G1 pela adição de completa médio. Como mostrado na Fig. 5A, a sobre-expressão de CSTP1 significantlly retardasse a progressão do ciclo celular. Em comparação com as células de controlo, as células com superexpressão CSTP1 exibiu uma menor percentagem de células em fase S em 2 horas e 4 horas após a liberação da fase G0 /G1. Além disso, uma menor percentagem de células em fase G2 /M em 8 h após libertado do bloqueio do ciclo celular foi também observada em células que sobre-expressam CSTP1, enquanto que as células que sobre-expressam CSTP1 ΔPP2Ac não mostrar a progressão do ciclo celular retardada. Para confirmar os efeitos da CSTP1 endógena no ciclo celular, proteína CSTP1 foi derrubado por siRNA transfecção em células SV-HUC1 que mostrou uma expressão CSTP1 moderada (Fig. 1B). CSTP1 proteína foi efectivamente regulada por transfecção siRNA específico (Fig. 5B), e a expressão reduzida de CSTP1 promoveu a proliferação de células, elevando a percentagem de células em fase S (Fig. 5C).

(A) EJ células que sobre-expressam CSTP1 (LV-CSTP1), CSTP1 ΔPP2Ac (LV-CSTP1 ΔPP2Ac) e as células de controlo foram tratadas com duas rodadas de timidina de 2 mM. ciclos celulares foram analisadas por FACS após a liberação da fase G0 /G1 no ponto de tempo indicado. Os resultados foram representativos de três experiências independentes. (B) Immunoblotting de CSTP1 em extratos de SV-HUC1cells 48 h após a transfecção com um controle siRNA (Mock) ou um siRNA para CSTP1 (CSTP1 siRNA). (C) análise do ciclo celular de células de SV-HUC1 após transfecção com ARNsi de controlo ou ARNsi para CSTP1. *, P 0,05. Os resultados foram representativos de três experiências independentes.

Para examinar o papel do CSTP1 na apoptose celular, as células EJ com superexpressão CSTP1 ou CSTP1Δ PP2Ac e células de controlo foram cultivadas em meio completo com ou sem gemcitabina e cisplatina, dois comumente usado drogas da quimioterapia no tratamento do cancro da bexiga. Os resultados de FACS mostraram que a sobre-expressão de CSTP1 sozinho apenas ligeiramente induzida EJ apoptose das células, mas quando as células foram tratadas com drogas de quimioterapia, um aumento da taxa de morte foi observado em células CSTP1-sobre-expressam, e que a depleção de domínio PP2Ac atenuado essa capacidade promotora de morte de CSTP1 dramaticamente (fig. 6).

células EJ que sobre-expressam de forma estável células CSTP1 ou CSTP1 ΔPP2Ac e de controlo foram cultivados em meio completo com ou sem gemcitabina (10

-8 mol /L) e cisplatina ( 2 ug /mL), 48 horas mais tarde, as células foram duplamente coradas com anexina V-FITC e PI, de apoptose celular foi analisada por FACS. Os resultados foram representativos de três experiências independentes. ** P . 0,01

CSTP1 interage e desfosforila pAkt em Ser473 site

Para explorar os mecanismos sublinhadas responsáveis ​​pela apoptose elevada e ciclo celular retardada de células de câncer de bexiga mediada por CSTP1, procuramos encontrar vias a jusante da CSTP1 superexpressão sinalização. Vias de sinalização que normalmente envolvidos na biologia do cancro, o controlo do ciclo celular ou a proliferação de células foram examinados em CSTP1 que sobre-expressam células EJ por análise da actividade da luciferase utilizando Cignal Reporter Assay Kit. Os resultados mostraram que o fator FOXO tinha uma atividade transcricional mais robusto em células (Fig. 7a) CSTP1-superexpressão. O aumento da actividade FOXO foi posteriormente demonstrada pela redução do estado de fosforilação de FOXO3a no local Thr32 CSTP1 após sobre-expressão (Fig. 7B). Desde Akt quinase é o regulador negativo principal a montante do fator FOXO, nós supor que a atividade Akt quinase poderia diminuiu em células CSTP1-sobre-expressam. Para confirmar esta hipótese, a Akt fosforilada na Thr308 ou local de Ser473, que representa o estado de activação de Akt, foram detectados. resultados de transferência de Western mostraram que a sobre-expressão de CSTP1 diminuiu o nível de Akt fosforilada no local de Ser473, mas o nível de Akt fosforilada na Thr308 foi inalterada (Fig. 7B). Desde CSTP1 é regulada negativamente em tecidos de cancro da bexiga, por isso pedimos se a perda de expressão CSTP1 em células uroteliais pode resultar na ativação de Akt quinase e inativação do fator FOXO. Consistente com o ensaio CSTP1 sobre-expressão, de knockdown CSTP1 em SV-HUC1 aumentou o nível de fosforilação de Akt Ser473 no local e no local FOXO3a Thr32 (Fig. 7C). Para investigar adicionalmente o efeito de sobre-expressão CSTP1 sobre a actividade de Akt, também examinámos outras quatro proteínas bem conhecidas, que dependente de Akt para a fosforilação, GSK3α, GSK3β, p70S6K e TSC2. Para nossa surpresa, CSTP1 superexpressão não afecta o estado de fosforilação de GSK3α, GSK3β, p70S6K e TSC2 (Fig. 7B).

células EJ (A) que sobre-expressam CSTP1 e as células de controlo foram transfectadas com uma série de cignal plasmideo relatado, 48 h mais tarde, a actividade de luciferase foi medida utilizando o sistema de ensaio de luciferase com um luminetro. sinal repórter baseados em luciferase é normalizado para a expressão de um controlo de luciferase de Renilla plasmídeo co-transfectado. (B) Análise de Western blot dos níveis de fosforilação de FOXO3a, Akt, GSK3α, GSK3β, p70S6K e TSC2 em células EJ com superexpressão CSTP1. proteínas não fosforilada FOXO3a, Akt, GSK3α, GSK3β, p70S6K e TSC2 foram detectados como os controles internos. (C) Análise de Western blot dos níveis de fosforilação de FOXO3a e Akt após derrubar de CSTP1 em células SV-HUC1. (D) CSTP1 interage com Akt em células 293T. células 293T foram co-transfectadas com pcDNA3.1-CSTP1 e bandeira-Akt plasmídeos de expressão, interação entre CSTP1 e Akt foi analisada pela experiência co-ip com (painel de cima) anti-Flag ou anti-CSTP1 anticorpo (baixo painel). (E) desfosforilação de Akt por CSTP1 purificada

in vitro

. Puro His-Akt foi incubada com CSTP1 marcado com GST ou CSTP1ΔPP2Ac no tampão de fosfatase marcado com GST. Para um controlo negativo, proteína CSTP1 foi omitido da mistura de reacção (CTR). (F) As células EJ foram sobre-expressos CSTP1 (LV-CSTP1) ou CSTP1 (LV-CSTP1) mais fósforo-mimético S473D construção de Akt (CA-Akt) por lentivírus, do ciclo celular foi analisada por FACS. Todos os experimentos foram realizados pelo menos três vezes.

Em seguida, testamos se CSTP1 poderia ligar diretamente para e dephosphorylate Akt fosforilada em Ser473. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig.