Abstract
Fundo
Diosgenin, uma saponina esteróide obtido a partir de feno-grego (
Trigonella foenum graecum
), foi encontrada para exercer efeitos anti-cancerígenos, tais como a inibição da proliferação e induzir apoptose numa variedade de células tumorais. No entanto, o efeito de diosgenina na metástase do cancro permanece obscura. O objetivo do estudo é avaliar o efeito da diosgenina na migração e invasão em células PC-3 de cancro da próstata humano.
Métodos e principais conclusões
Diosgenin inibiu a proliferação de células PC-3, em um modo dependente da dose. Quando tratados com doses não tóxicas de diosgenina, a migração celular e invasão foram marcadamente suprimida in vitro por ensaio de cicatrização de feridas e de ensaio Boyden invasão câmara, respectivamente. Além disso, diosgenina reduziu as actividades de metaloproteinase de matriz-2 (MMP-2) e MMP-9 pelo ensaio de zimografia de gelatina. O nível de ARNm de MMP-2, -9, -7 e indutor de metaloproteinase de matriz extracelular (EMMPRIN) foram também suprimidas enquanto inibidor de tecido da metaloproteinase-2 (TIMP-2) foi aumentada por diosgenina. Além disso, diosgenina aboliu a expressão do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) em células PC-3 e a formação de tubos de células endoteliais. Os nossos ensaios immunoblotting indicou que a diosgenina potentemente suprimiu a fosforilação de phosphatidylinositide-3-quinase (PI3K), Akt, sinal extracelular que regula quinase (ERK) e cinase c-Jun N-terminal (JNK). Além disso, Diosgenin diminuiu significativamente o nível nuclear do fator nuclear kappa B (NF
κ
B), sugerindo que a diosgenina inibiu a atividade de NF-kB.
Conclusão /Significado
Os resultados sugeriram que a diosgenina inibiu a migração e a invasão de células PC-3, reduzindo a expressão de MMP. Ele também inibiu ERK, JNK e PI3K /Akt vias de sinalização, bem como NF-
κ
atividade B. Estes resultados revelam um novo potencial terapêutico para diosgenina na terapia anti-metastático
Citation:. Chen PS, Shih YW, Huang HC, Cheng HW (2011) Diosgenin, um Esteróides Saponin, Migração inibe e Invasão de cancro da próstata humano PC-3 células, reduzindo metaloproteinases Expression. PLoS ONE 6 (5): e20164. doi: 10.1371 /journal.pone.0020164
editor: Robert E. Meios, Yale Medical School, Estados Unidos da América
Recebidas: 1 de fevereiro de 2011; Aceito: 14 de abril de 2011; Publicado em: 23 de maio de 2011 |
Direitos de autor: © 2011 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Diosgenin é uma ocorrência natural presente saponina esteroidal em uma. variedade de plantas, incluindo feno-grego (
Trigonella foenum graecum
) e raízes de inhame selvagem (
Dioscorea villosa
) [1]. Diosgenina tem sido utilizada na medicina tradicional como um agente antihypercholesterolemia, antihypertriacylglycerolemia, anti-diabetes e antihyperglycemia [1], [2], [3], [4]. Vários relatórios demonstraram que diosgenina inibe a proliferação e induz a apoptose numa ampla variedade de células tumorais de cólon humano [5], osteossarcoma [6], leucemia [7], eritroleucemia [8], da mama [9], e no fígado [10] . O efeito anti-cancro de diosgenina foi demonstrada através de paragem do ciclo celular [7], [11], a activação de p53 e caspase-3 [5], [7], [8], [12]. Além disso, diosgenina inibe a actividade de NF-kB e a expressão do gene de NF-kB-regulada e proliferação reduzindo subsequentemente, invasão e osteoclastog�ese [6], [13]. Diosgenina também suprime a ciclooxigenase-2 [11] e lipoxigenase [14], que estão implicados na carcinogénese e como alvos importantes para quimioprevenção e terapia do cancro. Portanto, diosgenina possuam o quimioterápico do câncer potencial e sua atividade envolve vários alvos celulares e moleculares.
O câncer de próstata é um dos tumores mais comumente diagnosticados em homens ea segunda principal causa de mortalidade por câncer nos Estados Unidos [ ,,,0],15]. Embora o cancro da próstata na fase precoce pode ser tratado com cirurgia e terapia de privação de androgênio, que, eventualmente, progredir para mais maligno, metástase, e cancro da hormona refractário próstata (HRPC), para o qual não há nenhuma terapia curativa [16], [17] . Assim, é necessário o desenvolvimento de terapias inovadoras para o tratamento de cancro da próstata. Porque avançada célula de cancro da próstata com altamente invasivo resultado potencial em altas taxas de morbidade e mortalidade, a inibição da invasão e metástase pode ser uma boa abordagem para o tratamento de HRPC.
metástase do câncer é um processo altamente coordenado passo a passo que inclui descolamento das células a partir do tumor primário, proteólise locais da matriz extracelular (ECM), a penetração através da membrana basal de capilares e vasos linfáticos, intravasamento, e, em seguida, invasão em tecido novo e o crescimento [18], [19]. O processo de metástase é promovido por expressar e segregar diversas enzimas proteolíticas que podem degradar a maioria dos componentes da matriz extracelular. As metaloproteinases de matriz (MMPs), uma família de endopeptidases de Zn-dependente, são as principais proteases que participam na migração das células do tumor, espalhamento, invasão de tecidos e metástases [20]. Entre as MMPs, a MMP-2 e MMP-9 são enzimas essenciais para a degradação de colagénio de tipo IV e contribuir para o processo de metástase [21], [22]. MMP-2 e MMP-9 também são capazes de clivar colagénio tipo I [23], [24], o principal componente que forma uma estrutura de rede no estroma [25]. A activação de estas enzimas têm sido associados com o aumento da metástase de tumor, o que sugere um papel funcional central para estas proteases no processo metastático [26]. A degradação proteolítica da microambiente estromal desempenha um papel crítico na promoção da invasão. Para obter informações pormenorizadas sobre a invasão de células do cancro no estroma, colagénio do tipo I é utilizado na câmara de Boyden ensaio de invasão no presente estudo.
Além disso, a degradação proteolítica da ECM na metástase tumoral pode ser regulada por outras proteínas, tais como indutor de metaloproteinase de matriz extracelular (EMMPRIN) e inibidor de tecido de metaloproteinases (TIMPs). EMMPRIN é uma glicoproteína multifuncional que pode modificar o microambiente do tumor através da activação proteinases, indução de factores angiogénicos em células tumorais e do estroma. EMMPRIN é capaz de regular MMPs e estar envolvido na invasão e metástase processos de células cancerosas da próstata [27]. As atividades da maioria das MMPs são reguladas por TIMPs. O equilíbrio entre os níveis de MMP e de TIMP é um determinante importante da actividade proteolítica líquido [28].
Proteína quinase
Mitogen-activated (MAPK) tem sido conhecido por participar em numerosas cascatas de sinalização que desempenham papéis importantes na regulação o crescimento celular, apoptose, diferenciação, e metástase [29]. Os diversos membros da MAPK são activados em resposta a vários estímulos extracelulares e têm alvos a jusante distintos, estimulando, assim, a migração de células, proteinase-indução, e angiogénese, eventos que são essenciais para a metástase [30]. Extracelular sinal de regulação quinase (ERK1 /2) e cinase c-Jun N-terminal (JNK), duas grandes MAP quinases de mamífero, têm sido implicados na migração celular e proteinase-indução, eventos que são essenciais para a metástase [30]. ERK1 /2 e JNK desempenha um papel central na regulação da expressão de MMP [20]. A inibição da via da MAPK pode ter o potencial para prevenir a angiogénese, proliferação, invasão e metástase para uma vasta gama de tumores [31], [32], [33]. A metástase é também regulada pela via PI3K /Akt sinalização, que está envolvida em muitos processos celulares, incluindo a sobrevivência celular, a adesão celular e metástase [34], [35]. A inibição da MAPK e PI3K /Akt pode ter o potencial para prevenir a proliferação de células de cancro, invasão e metástase [31], [33]. Além disso, PI3K /Akt e MAPK vias de sinalização de desempenhar um papel central na regulação da expressão de MMP por factores de transcrição, NF-kB, incluindo [34], [36], [37]. NF-kB é mantida numa forma inactiva no citoplasma por proteínas inibidoras chamados inibidores da kB (IkB). Em resposta a um sinal de activao, o NF-kB é libertado da IκBα e se transloca desde o citoplasma para o núcleo, onde se liga a cognato sequências na região promotora de uma série de genes alvo e, subsequentemente, facilita a proliferação celular, angiogénese, e metástase. Assim, o bloqueio da via PI3K /Akt e MAPK, bem como NF-kB proporcionar aos potenciais alvos para estratégias terapêuticas tumorais.
Embora diosgenina está implicado como um novo agente quimiopreventivo baseada multitarget contra várias células de cancro, o papel de diosgenina contra a metástase de tumor e angiogênese ainda é incerto. O objetivo deste trabalho é examinar os efeitos inibitórios e mecanismos moleculares de diosgenina em metástase. Desde que o cancro da próstata PC-3 exposições de células humanas actividade altamente invasivo e metastático e tem sido utilizada para investigar as alterações bioquímicas nas células de cancro da próstata avançado e em avaliar a sua resposta a agentes quimioterapêuticos [38], foi usada PC 3-célula para as presentes experiências .
Materiais e Métodos
Reagentes e Cultura de células
Diosgenina, sulfóxido de dimetilo (DMSO), Tris-HCl, EDTA, SDS, fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), Nonidet P -40, ácido deoxicólico e ortovanadato de sódio, foram adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Kit de ensaio de proteína foi obtida a partir de Bio-Rad Labs (Hercules, CA). meio de Eagle modificado de Dulbecco em pó (DMEM) foi adquirido a partir de Gibco /BRL (Gaithersburg, MD). kit de extracção de ARN total e o kit de PCR foram de Viogene (Sunnyvale, CA). Os anticorpos contra ERK, JNK, Akt, NF-kB (p65), C23 e as proteínas fosforiladas foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos contra PI3K e PI3K fosforilada foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). próstata linhas celulares de cancro humano PC-3 e foi obtido a partir BCRC (Industry Research Instituto de Alimentação e Desenvolvimento, Taiwan). As células foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina, e foram incubadas em 5% de CO
2 incubadora humidificada a 37 ° C. Human umbilical células endoteliais da veia (HUVEC), gentilmente fornecido pelo Dr. Hua-Lin Wu [39], foi isolado a partir de veias de cordão umbilical humano, como descrito anteriormente [39], e cultivadas em 0,1% pratos revestidos com gelatina e mantidas em meio M199 suplementado com FBS a 16%, suplemento de crescimento de células endoteliais e sulfato de heparina (Upstate Biotechnology). HUVECs entre as passagens 2 e 6 foram utilizadas em todas as experiências. Para o tratamento diosgenina, diosgenina foi dissolvido em etanol e diluiu-se com meio de cultura (a concentração final de etanol era inferior a 0,2%).
Ensaio de viabilidade celular
O ensaio foi realizado como descrito anteriormente [ ,,,0],40]. Resumidamente, as células foram semeadas numa placa de 96 poços e tratadas com diosgenina em triplicado. Após 24 e 48 horas de incubação, o meio foi substituído com meio fresco contendo 0,5 mg /ml de MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio]. Após 4 horas, os sobrenadantes foram removidos e o formazan MTT resultante foi solubilizado em DMSO e medido espectrofotometricamente a 570 nm.
Migração Wound Healing Ensaio
O ensaio foi realizado como descrito anteriormente [41] . Células PC-3 foram plaqueadas numa placa de 12 poços e cresceu até à confluência. A cultura em monocamada foi em seguida, raspar-ferido com uma ponta de micropipeta estéril para criar uma zona desnudada (gap) de largura constante. Depois de remover os detritos celulares com PBS, as células foram expostas a várias concentrações de diosgenina após 24 horas. PC-3 células que migraram para a região feridas foram observadas pela Olympus CK-2 microscópio invertido e fotografadas (ampliação x 100). A área da ferida foi medida pelo programa de imagem J (https://rsb.info.nih.gov/ij/). A percentagem do fecho da ferida foi estimado pela seguinte equação: Sutura% = [1- (tamanho da ferida a T
T /área da ferida a T
0) x 100%, onde T
t é o tempo após o ferimento e T
0 é o momento imediatamente após o ferimento.
Boyden câmara Invasion ensaio
ensaio de invasão de câmara de Boyden foi realizado como anteriormente [41]. Resumidamente, o filtro de policarbonato (8 de poro) foi pré-revestidos com colagénio do tipo I (10 ug /ml). Depois tratou-se com diosgenina durante 24 horas, as células (1 x 10
4 células /cavidade) foram adicionadas à câmara superior em meio isento de soro. O meio completo (contendo 10% de FBS) foi aplicada para a câmara inferior como quimioatractor. A câmara foi incubada durante 6 horas a 37 ° C. No final da incubação, as células na superfície superior da membrana foram removidos cuidadosamente com uma cotonete e as células que invadiram para a superfície inferior da membrana foram fixadas com metanol e coradas com solução Giemsa 5%. As células invadidas sobre a superfície inferior do filtro de membrana foram marcados a partir de cinco campos aleatórios sob microscopia (200 x de ampliação).
formação do tubo Determinação
O ensaio de formação do tubo foi efectuada como descrito. Resumidamente, a 15 μ bem-Slides (Ibidi, Alemanha) foi revestida com 10 uL de Matrigel que foi deixada solidificar a 37 ° C. Para avaliar o efeito de diosgenina, as células PC-3 foram tratados com várias concentrações de diosgenina durante 24 h e o meio condicionado foram colhidos e sujeitos ao ensaio de formao de tubo. As HUVEC foram semeadas no Matrigel e cultivadas em meio condicionado de células PC-3, durante 6 horas. As redes fechadas de tubos completos foram contadas e fotografadas sob um microscópio invertido. Os comprimentos das células tubulares foram medidos utilizando o programa de imagem J.
Extração de RNA e transcrição reversa e PCR quantitativa em tempo real de PCR
O ARN total foi de extracção utilizando o kit de extracção total de ARN de acordo com a as instruções do fabricante. O ARN total (1 ug) de cada uma das amostras foi sujeito a transcrição reversa com oligo (dT) iniciadores por PCR kit de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc sintetizado foi utilizado para amplificação por PCR com os seguintes iniciadores de [41]: MMP-9, 5′-gcacgacgtcttccagtacc-3 ‘(para), 5′-tcaactcactccgggaactc-3′ (Ap); MMP-2, 5’-ggactatgaccgggataagaaatatg-3 ‘(para), 5′-gggcaccttctgaatttcca-3′ (Ap); β-actina: 5’-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ‘(para), 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’ (Ap). Os ADNc foram amplificadas durante 35 ciclos e cada uma das condições de reacção de PCR foi como se segue: passo de preparação a 94 ° C durante 5 minutos, desnaturante passo a 94 ° C durante 30 seg, o passo de recozimento a 56 ° C durante 30 seg, e o passo de polimerização a 72 ° C durante 30 seg. Os produtos de PCR foram analisados por electroforese em gel de agarose. As expressões de ARNm de MMP-2, -9, -7, EMMPRIN e TIMP-1, -2 foram determinadas por PCR quantitativa em tempo real, o qual é conduzido no sistema StepOne (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA). Resumidamente, cada mistura de amplificação (50 ul) contém 10 ng de ADNc e 25 ul de SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). As condições de PCR foram as seguintes: 95 ° C durante 2 min, 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 45 s. As sequências dos iniciadores para β-actina, MMP-2, MMP-9, MMP-7, EMMPRIN, TIMP-1, TIMP-2 e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) foram deduzidas a partir PrimerBank e listados na Tabela 1. Os resultados da PCR foram derivada usando o
método T comparativa C.
Análise de MMP-2 e MMP-9 actividades de Gelatina zimografia
as actividades de MMP-2 e MMP-9 foram ensaiada por zimografia em gelatina, como descrito anteriormente [41]. Resumidamente, as células subconfluentes PC-3 foram incubadas com meio isento de soro com várias concentrações de diosgenina durante 24 horas. O meio condicionado foi então recolhido e concentrado por centrifugação ultra-filtração. A amostra (20 ug) foi misturada com tampão de carga e submetido a 10% de gel de SDS-poliacrilamida contendo 0,1% de gelatina. A electroforese foi realizada a 100 V durante 3 horas a 4 ° C. Os geles foram em seguida lavadas com tampão de lavagem (2,5% de Triton X-100 em dd H
2O) à temperatura ambiente para remover o SDS, seguido de incubação a 37 ° C em tampão de reacção (Tris-HCl a 40, pH 8,0, 10 CaCl mM
2, 0,02% NaN
3). Após 16 h, os géis foram corados com Comassie blue R-250 (0,125% de Comassie blue R-250, 50% de metanol, 10% de ácido acético) durante 1 h e descorado com solução de descoloração (20% de metanol, 10% de ácido acético, 70% DDH
2O) até que as bandas foram visualizadas claras.
proteína nuclear Extracção
foram preparadas as proteínas nucleares como previamente descrito [41]. Resumidamente, as células foram lavadas com PBS arrefecido em gelo, centrifugadas, e ressuspendidas em tampão hipotónico (10 mM HEPES, pH 7,9, MgCl 1,5 mM
2, 10 mM de KCl, 0,05% de NP-40, DTT 0,5 mM e 0,5 mM PMSF). Os núcleos foram centrifugadas durante 10 min a 3000 rpm a 4 ° C. O sedimento foi então ressuspenso em tampão de extracto nuclear (HEPES 20 mM, pH 7,9, MgCl 1,5 mM
2, NaCl 420 mM, EDTA 0,2 mM, DTT 0,5 mM, PMSF 0,5 mM e glicerol a 25%) e incubou-se durante 30 min no gelo. Depois de uma outra centrifugação a 14.000 rpm durante 10 min, o sobrenadante contendo a proteína nuclear foi transferida para um tubo de microcentrífuga previamente arrefecido. Os extractos foram armazenadas a -80 ° C.
Western Blot
Depois de ser tratada com diosgenina, PC-3 de células foram lavadas duas vezes com PBS e tratadas com tampão de extracção (50 mM de Tris-Cl , pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,1% de SDS, 1% de NP-40, e 0,5% de ácido desoxicólico). Os extractos de células foram recolhidas e centrifugadas a 10000 × g durante 10 min a 4 ° C, e os sobrenadantes foram recolhidos como lisados celulares. Os lisados celulares foram sujeitos a SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose (Millipore, Bedford, MA). As membranas foram bloqueadas com 5% (w /v) de leite magro em PBS contendo 0,1% de Tween-20, e, em seguida, colocados a hibridar com o anticorpo primário. Subsequentemente, as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário apropriado (de rábano silvestre conjugado com peroxidase de cabra anti-rato ou IgG anti-coelho). As proteínas detectadas imunologicamente foram então revelados por quimiluminescência reforçada.
Análise Estatística
Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. A significância estatística foi analisada por ANOVA de uma via. Se foi observada a importância, o teste post-hoc de Dunnett foi utilizado para determinar a diferença entre os grupos de tratamento e grupo não tratado, com valores de
p
. 0,05 considerado estatisticamente significativo
Resultados
citotóxica efeito da diosgenin em células PC-3
o primeiro elucidados o efeito citotóxico de diosgenina em células de câncer de próstata PC-3 (Fig. 1). Nós demonstramos que tratada de diosgenina na concentração abaixo de 20 uM durante 24 horas ou 48 não afectou a viabilidade das células PC-3 de forma significativa. A viabilidade das células PC-3 foi significativamente diminuído por diosgenina a 30 uM. Os dados indicaram que o tratamento com diosgenina em doses de não mais do que 20 | iM, durante 24 e 48 horas não causou citotoxicidade de células PC-3.
As células foram tratadas com várias concentrações de diosgenina para 24 h e 48 h . A viabilidade das células é apresentado como a média ± S.D. de quatro experiências independentes.
*** p
. 0,001 comparado com o controlo não tratado
Diosgenin inibe a migração de células PC-3
Porque uma maior concentração de diosgenina era tóxico , investigamos o efeito inibitório de diosgenina na migração e invasão de células PC-3 utilizando doses não-tóxicas. Após incubação com diferentes concentrações de diosgenina durante 24 horas, diosgenina suprimida a migração de células PC-3 para a zona desnudada de uma forma dependente da dose (Fig. 2, A e B). Estes resultados revelaram que a diosgenina inibiu a motilidade das células PC-3 de forma significativa.
monocamadas de células foram raspadas por uma ponta de micropipeta estéril e as células foram tratadas com várias concentrações de diosgenina durante 24 h. (A) células migraram para a região feridas foram fotografadas (ampliação x 100). (B) A área de ferida das culturas de células foram quantificados em quatro campos em cada tratamento, e os dados foram calculados a partir de três experiências independentes. Os dados são apresentados como média ± D.P. quanto de três experiências independentes.
* p Art 0,05,
** p
. 0,01, em comparação com o controlo não tratado
Diosgenin inibe a invasão em células PC-3
Para elucidar o efeito inibitório de diosgenina na invasão de células PC-3 em toda a matriz extracelular, as células que invadiram através do filtro de policarbonato revestidos com colagénio do tipo I na câmara de Boyden foram analisados. Os resultados mostraram que a diosgenina suprimida invasão de células PC-3 ao longo do filtro revestidas com colagénio de tipo I de um modo dependente da dose. O tratamento com diosgenina de 10 e 20 uM inibido 22% e 40% de invasão de células, respectivamente (Fig. 3, A e B). Os resultados indicaram que a diosgenina invasão marcadamente inibida de células PC-3.
As células foram tratadas com várias concentrações de diosgenina para ensaio 24 h e a invasão de células foi realizada. As células invadidas (A) foram fotografadas (ampliação x 200). (B) As células invadidas PC-3 foram contadas em cinco campos aleatórios em cada tratamento, e os dados foram calculados a partir de três experiências independentes. Os dados são apresentados como a média ± S.D. de três experiências independentes.
* p Art 0,05,
** p
. 0,01, em comparação com o controlo não tratado
Diosgenin inibe a ativação e expressão de MMP-2 e MMP-9 em células PC-3
Uma vez que a activação das MMPs é crucial para a degradação do ECM, que é necessário para a invasão de células, foi investigado o efeito de diosgenina na activação de MMPs. Depois de células PC-3 foram tratados com várias concentrações de diosgenina durante 24 horas em meio isento de soro, o meio condicionado foi recolhido, concentrado e ensaiadas quanto à actividade de MMP por zimografia em gelatina. Os resultados mostraram que a MMP-9 e MMP-2 actividades foram marcadamente reduzidos em 20? M de diosgenina (Fig. 4A). Demonstramos ainda que a diosgenina suprimiu a expressão de MMP-9 e MMP-2 e ARNm de proteína foi determinada por RT-PCR e Western blotting, respectivamente (Fig. 4, B e C). Os resultados indicaram que ambas as actividades enzimáticas e expressões de MMP-9 e MMP-2 foram inibidas por diosgenina.
células PC-3 (A) foram tratados com várias concentrações de diosgenina durante 24 horas e as actividades de MMP -9 e MMP-2 foram determinados por zimografia em gelatina. As expressões de MMP-9 e MMP-2 de ARNm (B) e de proteína (C) foram analisadas por RT-PCR e Western blotting, respectivamente. β-actina foi utilizado como um controlo interno. (D) Os níveis de MMP-2, -9, -7, EMMPRIN e TIMP-1, -2 ARNm foram expressos como média ± S.D. de três experiências independentes.
* p Art 0,05,
** p
. 0,01, em comparação com o controlo não tratado
mRNA Diosgenin inibe a expressão de MMP-2, MMP -9, MMP-7 e indutor de metaloproteinase de matriz extracelular (EMMPRIN), enquanto o TIMP-2 Induz expressão
de forma a elucidar o efeito de diosgenina na expressão de genes envolvidas na degradação da ECM, os níveis de ARNm de MMP-2 , MMP-9, MMP-7, EMMPRIN, TIMP-1 e TIMP-2 foram analisados por quantitativa PCR em tempo real. Os resultados demonstraram que a diosgenina inibiu a expressão de ARNm de MMP-2, MMP-9, MMP-7 e EMMPRIN de uma forma dependente da dose. Diosgenina também elevados da expressão de TIMP-2, o qual é conhecido por bloquear o potencial proteolítica das MMPs (Fig. 4D). Os resultados sugeriram que a diosgenina pode afectar a expressão de genes envolvidos na activação proteolítica.
Diosgenina inibida PC-3 induzida por células endoteliais da veia umbilical humana celular (HUVEC) a formação do tubo
a formação de tubos de células endoteliais é um dos passos cruciais na angiogénese associada com a progressão e metástase do cancro. A fim de examinar o efeito inibidor de diosgenina na angiogénese induzida por células PC-3, foi realizada na formação de tubo HUVEC in vitro por meio condicionado de células PC-3. HUVEC cultivadas em Matrigel foi tratada com o meio condicionado de células PC-3 tratadas com diosgenina durante 24 horas, e a formação do tubo foram avaliados. Os resultados demonstraram meio condicionado de PC-3 de células induzidas a formação do tubo de HUVEC, e meio condicionado a partir de células expostas a diosgenina formação de tubo HUVEC do suprimida de uma forma dependente da dose (Fig. 5, A e B). Os resultados sugeriram que a diosgenina pode suprimir a angiogénese induzida por células PC-3 in vitro. Porque células PC-3 induzem a angiogênese por meio expressar fatores angiogênicos, tais como VEGF, nós avaliar se diosgenina inibe a expressão de VEGF em células PC-3. Os resultados demonstraram que a expressão de ARNm de VEGF em células PC-3 foi marcadamente diminuída por diosgenina de um modo dependente da dose (Fig. 5C). Os nossos dados sugerem que a diosgenina inibição de células PC-3 induzida por angiogénese suprimindo a expressão de VEGF.
HUVECs (A) foram semeadas em Matrigel e incubadas com meio condicionado de células PC-3 tratadas com diosgenina durante 24 h. Após 6 h, as redes fechadas de tubos completos foram fotografadas (ampliação x 100). (B) Os comprimentos tubulares das células foram medidas usando o software Image J.. (C) A expressão de ARNm de VEGF foi determinada e apresentada como a média ± S.D. de três experiências independentes.
* p Art 0,05,
** p
. 0,01, em comparação com o controlo não tratado
Diosgenin inibe a fosforilação da PI3K, Akt, ERK e JNK
Vários estudos têm indicado que as proteínas de sinalização, incluindo PI3K, AKT e MAPK membros estão envolvidas na expressão das MMPs e induzir metástases [30], [34], [35]. Foram investigados os efeitos de diosgenina sobre o estado fosforilado de PI3K, AKT, ERK1 /2, JNK1 /2 e p38 em células PC-3. Os dados demonstraram que a diosgenina reduziu a fosforilação de PI3K e Akt em uma dose e tempo-dependente forma (Fig. 6, A e B). Além disso, diosgenina suprimiu a fosforilação de ERK1 /2 e JNK1 /2 numa dose e modo dependente do tempo, ao mesmo tempo que não alterou a fosforilação da p38 (Fig. 7, A e B).
células PC-3 foram tratados com várias doses de diosgenina durante 24 h (a) ou de 20 uM de diosgenina durante 3, 6, 12, 18 e 24 h (B). A fosforilação de PI3K e Akt foi determinada por SDS-PAGE e Western blotting. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.
células PC-3 foram tratados com várias doses de diosgenina durante 24 h (A) ou de 20 uM de diosgenina durante 3, 6, 12, 18 e 24 h (B). A fosforilação de ERK1 /2, JNK1 /2 e p38 foram determinados por SDS-PAGE e Western blotting. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.
Para investigar se a inibição da invasão de células e de MMP-2/9 expressão foram através da inibição da ERK1 /2, JNK1 /2 e PI3K Pathways, PC-3 foram tratados com um inibidor de PI3K (LY294002; 20 mM), inibidor de ERK (U0126; 20 uM) e inibidor de JNK (SP600125; 20? M) durante 24 horas. Os resultados mostraram que o tratamento de LY294002, U0126 e SP600125 reduzida a invasão de células e de MMP-2/9 expressão significativamente (Fig. 8, A e B), sugerindo que a inibição da invasão de células e de MMP-2/9 expressão por diosgenina poderia parcialmente ocorrer através da repressão de PI3K, ERK e vias JNK.
(a) células foram tratadas com LY294002, U0126 e SP600125 durante 24 h e a célula capacidades invasivas foram realizadas pelo ensaio de invasão na câmara de Boyden. (B) A expressão da MMP-2, -9 ARNm foram determinados e expressos como a média ± S.D. de três experiências independentes.
** p Art 0,01,
*** p Art 0,001, em comparação com o controlo não tratado
Diosgenin regula negativamente o conteúdo nuclear de NF-. kB em células PC-3
Para investigar o efeito inibitório de diosgenina sobre a actividade de NF-kB, a quantidade de IκBα nos extractos citosólicos e NF-kB nos extractos nucleares de células foram medidos por transferência Western. Os dados revelaram que as células de PC-3 tratadas com diosgenina demonstrou um aumento no nível da proteína citosólica de IκBα e uma diminuição no nível da proteína nuclear de NF-kB (Fig. 9). Os resultados implicaram que a diosgenina inibiu significativamente a actividade de NF-kB.
células PC-3 foram tratados com várias doses de diosgenina durante 24 h. (A) O citosólica e extractos nucleares foram preparados e analisados por degradação IκBα e NF-kB p65 translocação. β-actina e C23 foram utilizadas como um controlo de carga e citosólica proteína nuclear, respectivamente. (B) os níveis determinados de IκBα e NF-kB foram quantificados por análise densitométrica. Os resultados densitométricos foram expressos como média ± S.D. de três experiências independentes.
* p Art 0,05,
** p Art 0,01,
*** p
. 0,001, em comparação com o controlo não tratado
Discussão
Diosgenina tem sido demonstrado que possuem potenciais efeitos anti-cancerígenos, tais como inibição do crescimento celular e induzir a apoptose de várias linhas celulares de cancro [5], [6], [7], [8] [9], [10]. No presente estudo, fornecemos evidências de que diosgenina foi capaz de inibir a metástase
in vitro
, tais como migração e invasão no PC-3 células humanas de câncer de próstata, sugerindo que a diosgenina pode possuir potencial anti-metastático.
Demonstrámos que diosgenina proliferação suprimida de células PC-3 de forma significativa para a concentração de 30 uM. Quando as células PC-3 foram tratados com diosgenina em doses não-tóxicas (abaixo de 20? M), migração e invasão foram inibidas. Estes resultados implicaram que os efeitos inibidores de diosgenina na migração de células PC-3 e invasão não foram devidos ao seu efeito citotóxico.
metástase do cancro requer a migração de células cancerosas. Durante a migração celular, a proteólise pericelular de ECM é importante para a saliência célula. A degradação proteolítica da ECM mediada por proteases extracelulares, tais como as MMPs, é necessária para a migração de células de cancro da próstata e invasão. Entre eles, a MMP-2, MMP-9 e MMP-7 desempenha um papel fundamental na progressão do cancro da próstata. A expressão da MMP-2 e MMP-9, estão associados com a progressão do cancro da próstata [42], [43]. Inibição de MMP-2 e MMP-9 de expressão suprimir o potencial metastático de cancro da próstata, [44] [32]. MMP-7 possui actividade proteolítica contra uma variedade de substratos ECM, incluindo colagénios, proteoglicanos, laminina, elastina, fibronectina, e caseína. MMP-7 é também produzida por várias células de tumores malignos, incluindo próstata, gástrico, da cabeça e pescoço, pulmão, hepatocelular, carcinomas colorectais e [45], [46]. Superexpressão MMP-7 promove a invasão de células cancerosas da próstata [47]. Além disso, EMMPRIN é capaz de regular as MMPs e ser envolvida nos processos de invasão e metástase de células de cancro da próstata [27]. A inibição da expressão EMMPRIN reduz a invasão de células de tumor em células de cancro da próstata humano [48]. TIMPs, o regulador de MMP, também estão envolvidos em progressão tumoral, invasão, angiogénese e metástase [49], [50]. No presente estudo, mostrou que a diosgenina inibiu a migração e a invasão de células PC-3. O tratamento com diosgenina de 10 e 20 uM, durante 24 horas diminuiu as actividades e expressão de MMP-2 e MMP-9 de forma significativa. Diosgenina também inibiu a expressão de ARNm de MMP-7 e EMMPRIN em células PC-3. Além disso, a expressão de TIMP-2 foi aumentada por diosgenina.