Abstract

A 15-LOX, propõe-se, suprime o crescimento do câncer de próstata, em parte, através da conversão de araquidônico, eicosatrien�co, e /ou ácidos eicosapentaenóico a N-6 metabólitos hidroxi. Estes metabolitos inibem a proliferação de PC3, LNCaP e DU145 células cancerosas da próstata, mas apenas no ≥1-10 M. Mostramos aqui que os metabólitos 15-LOX de ácido docosa-hexaenóico (DHA), 17-hydroperoxy-, 17-hidroxi-, 10,17-di-, e 7,17-di-hidroxi-DHA inibir a proliferação destas células em ≥0.001 , 0,01, 1 e 1 uM, respectivamente. Por comparação, o correspondente 15-hidroperoxi, 15-hidroxi, di-hidroxi-8,15, e 5,15-di-hidroxi metabolitos de ácido araquidónico, bem como o próprio DHA requerem ≥10-100 uM para fazer isso. Tal como o DHA, o DHA metabolitos a) induzir células PC3 para activar uma activado por proliferador de peroxissoma do receptor-γ (PPARy) repórter, expressar sindecano-1, e tornar-se apoptose e b) são impedidos de proliferação celular retardando por inibição farmacológica ou knockdown de PPARy ou sindecano-1. A proliferação de células de cancro da próstata assim lento metabolitos DHA acoplando o PPAR /sindecano 1-via da apoptose e, assim, podem contribuir para a próstata efeitos de supressão do câncer não só de 15-LOX mas também dietética DHA

citação.: O’Flaherty JT, Hu Y, Wooten RE, Horita DA, Samuel MP, Thomas MJ, et al. (2012) 15-lipoxigenase metabólitos do ácido docosahexaenóico Inibição do cancro da próstata proliferação e sobrevivência celular. PLoS ONE 7 (9): e45480. doi: 10.1371 /journal.pone.0045480

editor: Clarissa Menezes Maya-Monteiro, Fundação Oswaldo Cruz, Brasil

Recebido: 12 Março, 2012; Aceito: 20 de agosto de 2012; Publicação: 20 de setembro de 2012

Direitos de autor: © O’Flaherty et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede PO1CA106742 (JTO, YH e IJE), RO1CA115958 (IJE), RO1AI064609 (DAH) e Centro Grant NIH CA1207 (MJT) e duas subvenções contra o cancro jogadores de golfe “(JPara). National Science Foundation subvenção BIR-9414018 forneceu os fundos para comprar o espectrômetro de massa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o metabolismo de ácidos graxos na dieta é de particular interesse no cancro da próstata, o cancro mais frequentemente diagnosticado e uma das principais causas de morte em homens americanos. Estudos epidemiológicos sugerem que a ingestão de ácidos n-3 marinhos gordos poli-insaturados (AGPI), o ácido eicosapentaenóico (EPA, 20:05, n-3) e ácido docosa-hexaenóico (DHA, 22:06, n-3) reduz o risco de cancro da próstata [ ,,,0],1], [2]. Além disso, os níveis teciduais de n-3 PUFA foram inversamente associados com a progressão do câncer de próstata [3], [4], [5]. Além disso, a cultura de células e modelos animais têm mostrado que PUFA n-3 são protectores Considerando n-6 PUFAs promover este cancro [6], [7], [8]. PUFA são incorporados em fosfolipidos da membrana celular e são substratos para oxigenase (ciclo-oxigenase e lipoxigenase) enzimas para ser metabolizado em lípidos bioactivos. Um mecanismo proposto para a actividade inibidora de tumor de AGPI n-3 é a inibição competitiva dos oxigenases utilizados por n-6 PUFAs para formar metabolitos promotoras de tumores (revisto em [9], [10]). Nossos estudos [11], [12] e as dos outros [6], [13] têm demonstrado que o DHA é um forte inibidor do crescimento das células do cancro da próstata, uma propriedade que é regulado por uma 15-lipoxigenase (15-LOX) ( estudos não publicados).

estudos anteriores indicaram que duas isoformas de 15-LOX identificados nos seres humanos podem desempenhar um papel no desenvolvimento e progressão do cancro da próstata opostas através do metabolismo de n-6 PUFAs. 15-LOX-1 é mais altamente expresso em maligno do que o tecido da próstata humana normal e os seus níveis correlacionam-se positivamente com a gravidade da doença [14], [15], [16]. Prefere ácido linoleico (LA) a ácido araquidónico (AA) e, consequentemente, faz com que o metabolito principalmente LA, ácido 13-hidroxi-octadecaenoic (HODE) [14], [17], [18]. O cancro da próstata tem níveis mais elevados de 13-HODE e converte LA a 13-HODE para uma maior extensão do que o tecido normal da próstata [14], [15], [16]. 15-LOX-2, em contraste, prefere AA sobre LA, faz principalmente o metabolito de AA, 15-hidroxi-eicosatetraenóico ácido (15-HETE), é sub-expresso ou está ausente no cancro da próstata, e os seus níveis correlacionam negativamente com a gravidade da doença [14], [17], [18], [19], [20]. cancro da próstata humano tem relativamente pequena capacidade de converter AA a 15-HETE [15]. Estudos experimentais têm apoiado e ampliado estas observações clínicas

Ratos feitos para expressar em sua próstata glândulas humano 15-LOX-1 desenvolver neoplasia intra-epitelial prostática (PIN) [21].; quando semelhante manipulada para expressar humano 15-LOX-2, eles desenvolvem próstatas com células senescentes [22]. Correlacionando-se com estes resultados, a expressão forçada de humanos 15-LOX-1 velocidades e 15-LOX-1 knockdown diminui a proliferação de células cancerosas da próstata humanas em cultura e explantados [23]. A expressão forçada de humano de 15-LOX-2 faz com que estas células para parar a proliferação e tornam-se senescentes [24], [25]. O efeito de 15-LOX-1 aparece devido à sua produção de 13-HODE, o que aumenta a capacidade de factores de crescimento para estimular a proliferação de células de cancro da próstata [23], [26], [27]. O efeito de 15-LOX-2 é atribuída em parte à sua produção de 15-HETE, que inibe a proliferação de células de cancro da próstata [24], [25], [26], através da activação do receptor de activação de proliferador de peroxissoma (PPAR) -γ [26], [28], [29]. Estes resultados sugerem que a progressão de células epiteliais da próstata em malignidade envolve-se-regulação 15-LOX-1 e para baixo de regulação de 15-LOX-2 para criar um crescimento favorecendo ambiente, isto é, uma mais rica em pró-proliferativo e mais pobre em anti-proliferativa metabólitos PUFA. Existem problemas com este modelo /n-6 PUFA 15-LOX. -se AA faz com que células cancerosas da próstata para proliferar [30] e, como outra n-6 PUFA é sugerido para promover, em vez de suprimir o câncer de próstata em alguns estudos epidemiológicos [31], [32], [33]. Além disso, a acção anti-proliferativa de 15-HETE em células de cancro da próstata em cultura requer ≥10-100 uM [25], [26], [34]. Os principais metabolitos correspondentes de n-6 PUFAs, γ-linolénico (GLA), e o n-3 PUFA, ácido eicosapentaenóico (EPA), são também menos prováveis ​​mediadores de efeito anti-cancro do 15-LOX-2 desde ambos 15-hidroxi-eicosatrienóico e 15-hidroxi-ácido eicosapentaenóico requerem ≥1-5 uM para retardar a proliferação de células de cancro da próstata [35], [36]. Os dados existentes garante, assim, pesquisas para outros modelos de metabolito 15-LOX /PUFA.

Nós aqui examinar a atividade, potência e mecanismo de ação dos metabólitos 15-LOX de DHA. Estes metabolitos são de particular interesse porque 1) O DHA é um membro da família n-3 PUFA sugerido para suprimir o cancro da próstata em estudos epidemiológicos [31], [32], [33]; 2) O DHA é um dos principais contribuintes para o efeito anti-proliferativo de n-3 PUFA em células de cancro da próstata [11], [12], e 3) a actividade de mais curta cadeia de AGPI n-3, incluindo EPA, pode ser irrelevante para a DHA de atividade desde os homens [37], bem como células de câncer de próstata em cultura [11] podem facilmente converter mais curto cadeia de n-3 PUFA a EPA, mas são praticamente incapazes de converter EPA para DHA.

Materiais e Métodos

DHA e AA (NuChek Prep); soja 15-LOX tipo 1a (SLOX), borato de sódio, e boro-hidreto de sódio (Sigma); colunas de HPLC (Waters); HPLC ou de grau optima solventes orgânicos e éter dietílico (Fisher); (H-174) anticorpo-SDC-1 anti (Santa Cruz Biotechnology, Inc.); anticorpo secundário anti-HRP conjugada contra o anticorpo de coelho (Cell Signaling Technology); e CellTiter 96® Aqueous One Solution celular Ensaio de Proliferação e caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega) foram adquiridos. PC3, DU145, e LNCaP linhas celulares de cancro da próstata humano (American Type Culture Collection (Manassas, VA) foram cultivadas em meio de Eagle modificado avançada de Dulbecco (Invitrogen) contendo 1% de soro fetal de bovino (células PC3), meio essencial mínimo de Eagle com sais de Earle médio (Invitrogen) contendo soro bovino fetal a 10% (células DU145), ou meio RPMI 1640 (Invitrogen) com 10% de soro fetal de bovino (células LNCaP) como descrito [34], [38].

Preparações metabolitos

Nós preparamos 15S-hidroperoxi-eicosatetra-5Z, 8Z, 11Z, 13E-enóico (15-PETE), 15S-hidroxi-eicosatetra-5Z, 8Z, 11Z, 13E-enóico (15-HETE), 5S, 15S-di-hidroxi-eicosa-tetra-6E, 8Z, 11Z, 13E-enóico (5,15-diHETE), e 8S, 15S-di-hidroxi-eicosatetra-5Z, 9E, 11Z, 13E-enóico (5,15- diHETE) ácidos por reacção de ácido araquidónico (AA) com SLOX [39] e utilizado o mesmo método para preparar os metabolitos DHA. Resumidamente, (

-4 M) foi feito reagir com 0,8 DHA 10 mg de SLOX em 50 ml de aerado de sódio tampão de borato (50 mM; pH 9, 4 ° C, 30 min). As reacções foram extraídas com éter dietílico; os 17S-hidroperoxi-docosa-hexa-4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 15E, 19Z-enoato de metilo (17-HpDHA) produto foi purificado por cromatografia de ácido silícico gravimétrico, isocrática C18 u-Bondapak de HPLC (1,5 × 300 mm, metanol: H

2O: ácido acético glacial, 750/250 /0,1, v /v; 3 ml /min; eluindo a ~34 min), isocrático e μ-porasil HPLC (1,5 x 300 mm; hexano: isopropanol: acético glacial ácido, 950:50: 1, v /v; 5 ml /min; eluindo a ~ 6 min). Eluição espectros de UV foram monitorados com uma matriz espectrômetro G1315A diodo correu com ChemStation 51 software (Agilent Technologies). Fez-se reagir 17-HpDHA com boro-hidreto de sódio em metanol e re-purificado por HPLC μ-Bondapak para se obter 17S-hidroxi-docosahexa-4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 15E, 19Z-enoato de metilo (17-HDHA). Para os produtos di-hidroxi, foi feita reagir com 10 mg de DHA SLOX (10

~ 4 M) em 500 ml reacções adicionada a 0, 45, 90, 150, e 240 min. Depois de 300 min, a reacção foi processada como 17-HpHDA embora o passo de HPLC μ-Bondapak; o pico eluindo neste sistema em ~ 10 minutos com uma absorvância espectros trieno (valores máximos: 280, 270, e 261 nm) que domina o seu lado esquerdo e 5,15-diHETE-como espectros de absorvância (máximo: 243; corcova adiabática: ~223 nm) dominando o lado direito foi coletado; reduzido com boro-hidreto de sódio; e, a seguir Butovich et ai. [40], [41], resolvido por HPLC isocrática 5SW (3 x 250 mm; hexano: isopropanol: ácido acético glacial (974:26: 1, v /v; 1 mL /min) em picos a ~17 e 22 min com respectivos espectros de UV para 10S, 17S-di-hidroxi-docosahexa-4Z, 7Z, 11E, 13Z, 15E, 19Z-enoato de metilo (10,17-diHDHA também denominado DX protectin [42]; máximos: 280, 270, e 260 nm) e 7S, 17S-di-docsahexa-4Z, 8E, 10Z, 13Z, 15E, 19Z-enoato (7,17-diHDHA [ou protectin D5]; máxima: 222 nm; corcunda adiabática: 242 nm) [40], [ ,,,0],41], [43]. para além dos seus tempos de eluição de HPLC e espectro de UV, as estruturas dos metabolitos do AA foram confirmados por EM [39] e dos metabolitos de DHA por MS e de ressonância magnética nuclear (RMN). 17-HDHA e 10,17-diHDHA deu espectros de electropulverização (MS Quattro II, MassLynx 3.5 software, modo ião negativo) semelhantes aos publicados [40], [41], [43], [44], [45], [46]. a ião molecular para 17-HpDHA foi de 16 AMU maior do que para a 17-HDHA espectros de RMN (1D e 2D duplo quântico-filtrada COSY em d

4-metanol; 25 ° C; Bruker 699 MHz Avance espectrómetro de RMN). para 17-HDHA e 10,17-diHDHA tinha deslocamentos químicos e padrões de acoplamento correspondentes relatórios publicados [40], [41], [44]; os conjugados geometrias de ligação dupla foram deduzidas para 17-HDHA, 13Z, 15E; para 10,17-diHDHA, 11E, 13Z, 15E; e para 7,17-diHDHA, 8E, 10Z e 13Z, 15E. Os quatro metabolitos DHA faltava ressonâncias a 6,1-6,2 ppm indicando a ausência de uma ligação dupla conjugada trans-trans. O PUFA e metabolitos foram armazenadas em metanol sob uma atmosfera de árgon a -80 °; libertada de metanol por uma corrente de azoto; recolhido em meios de cultura; e adicionado a culturas de células. Devido à sua instabilidade [40], [41], 15-PETE e 17-HpDHA foram usados ​​dentro de 3 semanas de preparação.

Proliferação e caspase Ensaios

A proliferação foi analisada com celular Titer96 Aqueous uma célula de solução Proliferação Ensaios (Promega) como descrito [47]. Para medir a actividade apoptótica, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1000 células /poço, durante 24 h, em seguida, tratados com os compostos durante 48 horas antes da medição da actividade de caspase utilizando o ensaio de caspase-3/7 Glo® ( Promega) de acordo com as instruções do fabricante.

a activação de PPARy Ensaio

2 × 10

5 células PC3 foram semeadas em pratos de 35 mm em 1 ml de DMEM avançado com 1% de FBS, para 24 h e transfectados com 1 ug de lacZ e 1 ug de ADN PPRE (resposta PPAR elemento repórter luciferase) [34], [38] utilizando FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche). Em alguns estudos, as células foram co-transfectadas com um vector (1 ug) que codifica negativo dominante (d /n) -PPARγ (L468 /E471) [34] [38] ou vector pcDNA3 vazio (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 24 h ou foram tratados durante 30 minutos com o antagonista de PPARy, GW9662. As células foram então desafiados com um metabolito DHA ou um agonista de PPARy, troglitazona, durante 24 h. As células foram raspadas para Repórter Lysis Buffer (Promega). As amostras foram congeladas durante 18 h e centrifuga-se (200 g, 4 min, 20-C). Os fluidos sobrenadantes foram ensaiados quanto a luciferase e β-galactosidase (Promega Luciferase e β-galactosidase Enzyme Assay Systems). Luciferase foi corrigida para a eficiência de transfecção com base em β-galactosidase como em [34], [38].

SDC-1 Ensaio

Para detectar SDC-1 mensagem, de RNA celular PC3 total foi preparado e amplificados em triplicado utilizando o real-Time PCR System Applied Biosystems 7500. Primers para SDC-1 humano foram 5′-ggagcaggacttcacctttg (para a frente) e 5′-ctcccagcacctctttcct (reverso). Os dados foram normalizados para o controlo de arrumação peptidil-prolylisomerase B e são apresentados como em relação ao controlo. Para detectar a proteína SDC-1, as células PC3 foram homogeneizados e lisados ​​em tampão arrefecido com gelo (Tris-HCl a 25, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 0,1 mg /ml de fluoreto de fenil-metano, 1 × proteinase, e 1 × inibidores de fosfatase [Roche Applied Science]), dialisadas contra Tris 100 mM e acetato de sódio 30 mM, pH 8,0, durante 24 h a 4 ° C, e digerido por condroitinase ABC (Seikagaku, Ijamsville, MD) e heparinase III (Sigma -Aldrich) a 37 ° C durante a noite. Os extractos de proteína foram preparados para análise de Western blot, conforme descrito utilizando o anticorpo indicado [12]. densidades Band na filmes fotográficos foram analisados ​​utilizando 1.37v Imagem J (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Para silenciar SDC-1, 1 × 10

5 células PC3 por poço foram plaqueadas em placas de 96 poços, transfectadas com um pequeno ARN interferente (siRNA) para o SDC-1 gene humano (Ambion, catálogo n °. AM16708) ou um siRNA controlo negativo sem alvo conhecida, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) para atingir uma eficiência de knockdown de 75%, como descrito [12]. As culturas foram incubadas durante 18 h e depois desafiados com um metabolito DHA durante 3 dias.

Análises Estatísticas

Os dados são expressos como média ± DP quando os dados mostrados são de uma experiência, que foi repetida com semelhante ou resultados SEM onde os resultados são apresentados como a média de experiências independentes. Os resultados foram analisados ​​por ANOVA (uma forma ou de duas vias como indicado) e teste de múltipla pós Comparação de Bonferroni usando GraphPad Prism versão 4.00 para Windows, GraphPad Software, San Diego CA. As diferenças foram consideradas significativas para

P

. 0,05

Resultados

17-HpDHA, 17-HDHA, 10,17-diHDHA, e 7,17-HDHA desacelerou a proliferação de células PC3 de 25% a cerca de 0,1, 1, 8, e 10? M, respectivamente (Fig. 1A). Sob as mesmas condições, o DHA necessário 60 pM para obter esse efeito [12] e os metabólitos 15-LOX-AA derivada análogas, 15-HPETE, 15-HETE, e 8-15-diHETE, teve muito menos ou nenhuma actividade enquanto 5,15-diHETE proliferação estimulada ligeiramente (Fig. 1B). As comparáveis ​​metabólitos 15-hidroxi de EPA e GLA supostamente exigem ≥5? M para retardar a proliferação em 25% [35], [36] enquanto os metabólitos 15-LOX-dependentes de LA, 13-HODE e 9-HODE, faltava anti- actividade proliferativa a 100 uM e, na verdade, a proliferação estimulada pelo ≥0.1 e 1 nM, respectivamente (observações não publicadas). 17-HpDHA e 17-HDHA também provou ser mais potente do que o 15-HPETE ou 15-HETE em retardar a proliferação de LNCaP e DU145 células de cancro da próstata (Fig. 1C e 1D). resultados semelhantes ocorreram nas três linhas de células quando incubadas com os metabolitos para 48 ou 96 h (resultados não mostrados). Sob condições idênticas, o DHA necessária ≥30 uM para inibir a proliferação destas células [12].

Os tipos celulares indicadas foram incubadas durante 3 dias com o metabolito indicado e a sua proliferação apresentados como a média ± EPM (≥ 3 experimentos independentes) frações de que foram encontrados em células tratadas com o veículo (meio de cultura) para os metabolitos.

para examinar o mecanismo (s) subjacente a atividade anti-proliferativa dos metabólitos, enfocamos células PC3 e seguiu estudos anteriores que encontraram que o DHA inibe a proliferação de células de câncer de próstata através da activação de PPARy para induzir a expressão de sindecam (SDC) -1. Este proteoglicano transmembranar possui actividade indutora de apoptose de próstata e outras células cancerosas [12], [38], [48], [49]. 17-HpDHA e 17-HDHA, em ≥0.01 e 1 uM, respectivamente, causado células PC3 para activar caspase-3, um marcador de apoptose (Fig. 2A). A análise estatística (ANOVA) indicou que a variável de resposta à dose significativa (p 0,0001) e a variável de dois metabolito significativamente (p 0,001) impactado os resultados com 17-HpDHA sendo mais potente do que a 17-HDHA. Estes mesmos dois metabolitos DHA também causou as células para ativar um gene repórter PPAR; este efeito foi semelhante à dos dados farmacológicos activador PPAR, troglitazona (Fig. 2B), assim como o DHA [38], [48]. Ambos 10,17-diHDHA e 7-17-HDHA eram fracos activadores de PPARy neste estudo que induzem respectivamente um aumento de 69% e 68% na actividade ao longo de controlo que tenderam para, mas não atingiram significância estatística (P 0,1) (Fig. 2B). Temos anteriormente mostraram que tanto 15-HETE e 5,15-diHETE (1-200? M) falhou para activar este repórter [34]. Finalmente, os metabolitos de DHA estimuladas células PC3 de expressar ARNm SDC-1 (Figura 2C.) Que resultou no aumento da SDC-1protein (Figura 2D.); Estes efeitos podem também condiziam com os da troglitazona e DHA [12], [38], [48], [49]. As potências relativas de metabolitos na produção destas respostas aproximada suas potências relativas em retardar a proliferação de células PC3. A discrepância entre a activação de PPARy fraco por 10,17-diHDHA e 7-17-HDHA (Fig. 2B) e o seu efeito mais forte sobre a acumulação de proteína SDC-1 durante 72 h (Fig. 2D) pode sugerir uma absorção mais lenta e /ou o metabolismo destes dois produtos mais polares pelas células.

. As células foram incubadas com a concentração indicada de 17-ou 17-HDHA HpDHA durante 24 h e a actividade da caspase-3 foi medida por caspase-Glo® 3/7 ensaio. Os resultados são apresentados como média ± DP (N = 3) em relação às células de controlo tratadas com o meio para os metabolitos. As respostas a todas as doses e acima de 10

-8 M para 17-HpDHA e igual ou superior a 10

-7 M para 17-HDHA foram significativamente maiores do que a de células de controlo (ANOVA, P 0,05) . B. As células transfectadas com o gene repórter de luciferase de PPARy foram estimuladas durante 24 h com 10 uM do metabolito indicada (a dose mais baixa em que todos tinham um claro efeito no crescimento celular) ou 5 uM de troglitazona e ensaiadas para a luciferase. Os valores representam a média ± DP (n = 3). Barras marcadas com as mesmas letras não são significativamente diferentes uns dos outros; barras marcadas com letras diferentes são significativamente diferentes uns dos outros (one-way ANOVA, P 0,05) C. As células foram tratadas com meio (controlo) ou 10 uM do metabolito indicada por 8 ou 24 h e o seu ARNm SDC-1 estava medido. Os valores representam a média ± DP (n = 3). Dentro de cada grupo de tempo, barras marcadas com as mesmas letras não são significativamente diferentes uns dos outros; barras marcadas com letras diferentes são significativamente diferentes uns dos outros (one-way ANOVA, P 0,05). D. As células foram tratadas com meio (controlo) ou 10 uM do metabolito indicado durante 72 h e os lisados ​​foram analisados ​​quanto à SDC-1. O Western blot é representativa de 3 experiências independentes. Os valores nos gráficos representam a média ± SEM (n = 3 expericias independentes). Barras marcados com letras diferentes são significativamente diferentes uns dos outros (one-way ANOVA, P 0,05)

activação de PPARy apareceu crítica para a actividade dos metabolitos DHA:. Os metabolitos foram marcadamente inibido de induzir SDC-1 em células PC3 transfectadas com d /nPPARγ, mas não em células transfectadas com o vector pcDNA3 de controlo, em comparação com células que foram não transfectadas (Fig. 3A). Mais importante ainda, d /nPPARγ transfecção também bloqueados cada um de actividade anti-proliferativa dos quatro metabolitos «Considerando que pcDNA3 não, novamente em comparação com células que foram não transfectadas (Fig. 3B). Em apoio deste último resultado, a actividade anti-proliferativa dos metabolitos foi inibida em células PC3 pré-tratados com o antagonista de PPARy, GW6992, em comparação com as células tratadas com o veículo da droga (Fig. 3C). Finalmente, SDC-1 apareceu indução também essencial para a actividade anti-proliferativa dos metabolitos. As células que tinham a sua SDC-1 derrubado por transfecção com ARNsi específicos do SDC-1 eram não responde (isto é, não conseguiram impedir a proliferar em resposta) para os metabolitos em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo ou não transfectadas (Fig. 3D). Embora 10,17-diHDHA e 7-17-HDHA foram relativamente fracos activadores de PPARy (Fig. 2B), os efeitos destes metabolitos sobre SDC-1 expressão e proliferação também eram sensíveis à inibição de PPARy (Fig. 3A-D). Isto sugere que um baixo limiar de activação do receptor pode ser suficiente para a regulação positiva de PPAR

SDC 1-

gene que é consistente com os efeitos do DHA nesta via demonstrado em estudos anteriores [38].

A. As células não transfectadas ou transfectadas com pcDNA3 ou d /nPPARγ foram provocados com 10 uM do metabolito indicada durante 24 h antes do ensaio de ARNm sindecano-1. Os valores representam a média ± DP (n = 3). Dentro de um grupo de transfecção, barras marcadas com as mesmas letras não são significativamente diferentes uns dos outros; barras marcadas com letras diferentes são significativamente diferentes uns dos outros (one-way ANOVA, P 0,05). B. As células não transfectadas ou transfectadas com pcDNA3 ou d /nPPARγ foram provocados com 10 uM do metabolito indicada por 3 dias antes do ensaio de proliferação. Os valores representam a média ± DP (n = 3). Dentro de um grupo de metabolito, barras marcadas com as mesmas letras não são significativamente diferentes uns dos outros; barras marcadas com letras diferentes são significativamente diferentes uns dos outros (one-way ANOVA, P 0,05). C. As células foram incubadas com 0-1 uM de antagonista de PPARy, GW6692, durante 30 min e com 10 pM do metabolito indicada por 3 dias antes do ensaio de proliferação. Os resultados são apresentados como média ± SEM (n = 3 expericias independentes). Dentro de um grupo de metabolito, barras marcadas com as mesmas letras não são significativamente diferentes uns dos outros; barras marcadas com letras diferentes são significativamente diferentes uns dos outros (one-way ANOVA, P 0,05). D. células não transfectadas, transfectadas com ARNsi de controlo, ou transfectadas com ARNsi SDC-1 foram provocados com 10 uM do metabolito indicada por 3 dias antes do ensaio de proliferação. Os resultados são apresentados como média ± DP (N = 4). Dentro de um grupo de transfecção, barras marcadas com as mesmas letras não são significativamente diferentes uns dos outros; barras marcadas com letras diferentes são significativamente diferentes uns dos outros (one-way ANOVA, P 0,05).

Discussão

A maioria dos oxigenases PUFA e metabólitos que eles fazem aparecer ligada para a progressão do cancro da próstata, porque estes metabolitos promover as células deste tipo de câncer a proliferar [15], [16], [21], [23], [24], [26], [27], [28], [ ,,,0],30], [34], [50], [51], [52], [53]. 15-LOX-2 e seus metabólitos são exceções notáveis ​​a esta regra: eles aparecem ligadas à supressão de câncer de próstata em parte porque estes metabolitos inibir a proliferação [15], [19], [20], [22], [24] , [25], [26]. Com base na sua actividade in vitro e o domínio como 15-LOX-2 metabolitos, 15-HETE [24], [25], [26], [34], ácido 15-hidroxi-eicostrienoic, e ácido 15-hidroxi-eicosapentanóico [ ,,,0],35], [36] são mediadores candidatos de efeito anti-proliferativo de 15-LOX-2. No entanto, a baixa potência destes metabolitos permite que os produtos derivados de outros PUFA pode ser mais potente e, portanto, mais importante na mediação do efeito de 15-LOX-2. Descobrimos que os membros do 17-série de metabolitos DHA, 17-HpDHA, 17-HDHA, 7,17-diHDHA, e 10,17-diHDHA, inibir a proliferação de andrógeno-independente (PC3 e DU145) e dependentes de androgénios (LNCaP) células cancerosas da próstata. O mais potente destes, 17 e 17-HpDHA-HDHA, retardou significativamente a proliferação a concentrações de ≥1 e 100 nM, respectivamente, e, por conseguinte, estão 1000 vezes mais potente do que os correspondentes metabolitos de AA; Eles também parecem muito mais potente do que os metabólitos 15-LOX de EPA e GLA como relatado em [35], [36]. Os metabólitos DHA claramente agiu de uma maneira específica estrutural como evidenciado por suas decididamente diferentes potências individuais e por suas potências maiores do que suas contrapartes no 15-série de metabólitos do AA. Notamos que as actividades do 17-série de metabólitos DHA encontrados aqui não excluem possibilidades que os seus efeitos envolvem o seu maior metabolismo celular aos produtos ainda mais potentes anti-proliferativa. Estamos apenas começando a analisar esta questão.

Estudos têm demonstrado que o DHA suprime a proliferação de células de câncer de próstata, incluindo células PC3 por um caminho que envolve a ativação de PPAR, a ligação do PPAR ao promotor SDC-1 , a indução de SDC-1, e apoptose SDC-1 induzida [12], [38]:

os metabólitos DHA aqui estudados estimulado células PC3 para ativar um repórter PPAR, expressar SDC-1, e ativar caspase-3, sugerindo assim um passo adicional importante nesta via ou seja, o metabolismo de DHA para os intermediários mais potentes. Além disso, o antagonista de PPARy, GW6992, d /nPPARγ, e SDC-1 silenciamento bloqueado acção anti-proliferativa dos metabolitos de DHA; d /nPPARγ também bloqueou sua indução de SDC-1. Os metabolitos usados, assim, o mesmo caminho de sinalização como DHA para desacelerar a proliferação de células PC3. Este conjunto de resultados abre a possibilidade de que o efeito anti-proliferativo de DHA é mediada, pelo menos em parte, através do seu metabolismo por 15-LOX-2 para o 17-série de metabolitos, em especial 17 e 17-HpDHA-HDHA. Há, no entanto, vários problemas com este esquema.

Estudos discordam sobre a capacidade das células PC3 para metabolizar PUFA com algumas encontrar as células não fazem [26] ou muito pouco [23], [24] 13- HODE e 15-HETE e outros encontrando eles produzir quantidades apreciáveis ​​de 13-HODE [15], [16], mas pouco 15-HETE [15], mesmo após exposição a elevadas concentrações de LA ou AA. Desde 15-LOX-1 prefere LA para AA enquanto 15-LOX-2 prefere AA a LA [14], [17], [18], [19], [20], estes resultados indicam que as células PC3 têm pouca ou nenhuma 15-LOX-2 atividade de metabolização, um resultado compatível com os resultados que estas células têm 15-LOX-1, mas pouco ou nenhum 15-LOX-2 mensagem e proteína [15], [24], [54]. Além disso, a capacidade e especificidade relativas das duas enzimas humanas para usar DHA como um substrato não ter sido definida, embora um estudo knock-down 15-LOX-1 em células epiteliais do pigmento da retina sugere que a 15-LOX-1, mas não 15- LOX-2 é responsável pela metabolização de DHA para o 17-série de metabolitos [55]. É claro que a 17-série de metabolitos DHA são feitas por diversos tipos de células, in vitro e numerosos tipos de tecidos in vivo [45], [55], [56], [57], [58]. No entanto, a capacidade de maligno, bem como células da próstata normais e tecidos para tornar esses metabolitos e a contribuição de 15-LOX-1 versus 15-LOX-2 do presente não é conhecido. Descobrimos que as células PC3 desafiados com uma concentração de anti-proliferativa (isto é 100